曹雪玲，張東杰，李 鑫,任重遠(yuǎn)，連麗麗

(1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林 吉林 132002；2.中國石油吉林石化公司，吉林 吉林 132000)

碘可以直接或間接參與生命活動(dòng)，對(duì)人體的新陳代謝和成長起著重要作用[1]。任何必需的元素，過量或不足均將對(duì)人體產(chǎn)生影響，特別是微量元素對(duì)生命活動(dòng)的影響更為顯著。人們主要從飲水、糧食、蔬菜和環(huán)境(如海水、人工降雨等)中獲取碘，而飲用水中的碘含量反映了一個(gè)地區(qū)碘營養(yǎng)的基本指標(biāo)。若碘的攝入量不足會(huì)導(dǎo)致碘缺乏病，引起智力發(fā)育不良，并導(dǎo)致潛在的地方性甲狀腺腫或地方性克汀病等疾病[2-3]，但若碘攝入量超過生理需求，也會(huì)影響人體健康。

目前，檢測碘含量的方法包括比色法[4]、電泳法[6]、電化學(xué)法[5]、離子色譜法[7]、色譜法[8]等。然而這些方法在檢測過程中存在檢測范圍窄、檢出限高、操作條件苛刻或檢測成本過高等缺點(diǎn)。為克服上述不足，許多熒光探針被用于碘的檢測[9-10]，其中蛋白質(zhì)保護(hù)的金納米簇具有生物兼容性、水溶性及光學(xué)性能優(yōu)異等特點(diǎn)，作為熒光探針得到了廣泛應(yīng)用[11-13]。例如：基于碘可以誘導(dǎo)金納米簇的熒光增強(qiáng)，谷胱甘肽保護(hù)的金納米簇被用作熒光探針檢測碘[14]，檢出限為400 nmol/L。文獻(xiàn)[15]利用組氨酸保護(hù)金納米簇檢測碘，方法的檢測范圍寬，靈敏度良好。本課題組利用蛋白質(zhì)保護(hù)的金納米簇作為熒光探針建立了碘單質(zhì)的檢測方法，但未對(duì)金納米簇與碘的作用機(jī)理做明確解釋[16]。

本文利用牛血清白蛋白保護(hù)的金納米簇(AuNCs@BSA)為熒光探針，高靈敏地檢測了碘單質(zhì)，并利用Stern-Volmer方程進(jìn)行了熱力學(xué)計(jì)算，對(duì)碘與金納米簇的作用機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光光譜儀RF-5301pc型(日本島津公司)；FLS980穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀(英國愛丁堡儀器公司)；Bruker Vertex 80 V傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR,布魯克公司)；62A DS圓二色譜儀(美國Aviv公司)；UV-3100光譜儀(日本Shimadzu公司)。

牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)購于Sigma-Aldrich公司。氯金酸(HAuCl4·3H2O)購于北京化學(xué)試劑公司。G-75凝膠購于 Sigma-Aldrich 公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器條件

熒光發(fā)射光譜：氙燈為激發(fā)光源，激發(fā)波長為350 nm，掃描范圍為550～750 nm，狹縫為5 nm×5 nm。圓二色譜采用0.1 cm光程的石英池，掃描波長為190～260 nm，所有數(shù)據(jù)掃描3次。傅立葉變換紅外光譜儀：配MCT-B 液氮冷卻檢測器。溴化鉀壓片,光譜采集范圍:400～4 000 cm-1。

1.3 金納米簇制備

基于文獻(xiàn)方法制備金納米簇[17-18]：在37 ℃下，取5 mL 50 mg/mL的 BSA恒溫10 min，加入5 mL 10 mmol/L HAuCl4,磁力攪拌2 min后，再加入0.5 mL 1 mol/L的NaOH溶液，然后將此反應(yīng)液在微波反應(yīng)器中于37 ℃下反應(yīng)12 h。制備的金納米簇粗產(chǎn)品用分子量為 8 000～14 000 Da的透析袋透析24 h；未反應(yīng)的BSA用 G-75凝膠分子篩柱去除；將金納米簇冷凍干燥為粉末，備用。

圖1 金納米簇的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence emission spectra of the prepared AuNCs@BSAinsert：the lifetime of the prepared AuNCs@BSA

圖2 金納米簇中加入不同濃度碘的熒光猝滅圖Fig.2 Emission spectra of AuNCs@BSA(0.5 g·L-1) in the presence of different concentrations of iodineinsert:relationship between ΔIF and concentration of iodine；concentration(a-g):0,0.5,1,5,15,25,35 μmol/L

2 結(jié)果與討論

2.1 金納米簇檢測碘單質(zhì)的方法建立

2.1.1金納米簇的表征在激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長610 nm下，AuNCs@BSA的熒光光譜圖見圖1，與文獻(xiàn)制備的含有16個(gè)金的AuNCs@BSA基本一致。圖1插圖為AuNCs@BSA的熒光壽命圖，擬合計(jì)算得到其熒光壽命約為11 μs，與Hu等[19]制備的AuNCs@BSA的熒光壽命(11 μs)一致。綜上所述，本文制備的產(chǎn)物為金納米簇。

2.1.2分析方法的建立由碘單質(zhì)對(duì)金納米簇的熒光猝滅圖(圖2)可知，AuNCs@BSA在610 nm有較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，因碘單質(zhì)可在較寬的pH值范圍內(nèi)引起金納米簇的熒光發(fā)射峰猝滅。本實(shí)驗(yàn)選擇在pH 8.3(制備金納米簇后的pH值)條件下加入碘溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AuNCs@BSA的熒光猝滅現(xiàn)象隨著碘溶液加入量的增加而增強(qiáng)，當(dāng)?shù)饧尤肓窟_(dá)到35 μmol/L時(shí)，AuNCs@BSA的熒光基本完全猝滅，且最大發(fā)射峰的峰位藍(lán)移至590 nm，此時(shí)AuNCs@BSA的熒光峰位置及強(qiáng)度均發(fā)生很大改變，推測AuNCs@BSA內(nèi)金核的微環(huán)境發(fā)生了較大變化，碘與AuNCs@BSA之間存在強(qiáng)的相互作用[20]。

以AuNCs@BSA加入碘前后的熒光強(qiáng)度(ΔIF=IF0-IF)與碘濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明ΔIF與碘濃度(c)在2.0 nmol/L～35 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為ΔIF=7.840c+10.937，相關(guān)系數(shù)r=0.997 7(見圖2插圖)。逐級(jí)稀釋AuNCs@BSA使其信噪比為3，加入不同濃度的碘，繪制熒光強(qiáng)度與濃度之間的關(guān)系曲線，計(jì)算得到檢出限為1.8 nmol/L。

表1 實(shí)際樣品中碘含量的測定結(jié)果Table 1 Determined results of iodine in real samples

2.2 實(shí)際樣品中碘含量的測定

我國規(guī)定居民飲用水中碘含量應(yīng)在10 μg/L，若飲用水中的碘含量小于5 μg/L，則會(huì)出現(xiàn)地方性甲狀腺腫病，而含量超過150 μg/L時(shí)也會(huì)威脅人體健康[21]。實(shí)驗(yàn)選擇飲用水為實(shí)際樣品，水樣經(jīng)濃縮處理后，采用升華的方法使碘離子轉(zhuǎn)化為碘單質(zhì)，進(jìn)行檢測。分別利用此方法和ICP-MS[21]檢測了樣品中的總碘含量，結(jié)果見表1。由表1可見，利用本方法檢測的碘含量與ICP-MS檢測結(jié)果差別不大，說明本方法可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測。

圖3 干擾離子對(duì)金納米簇的干擾試驗(yàn)Fig.3 Influence of the fluorescence emission intensity with different interference ions in AuNCs@BSA

2.3 干擾試驗(yàn)

2.4 作用機(jī)理研究

2.4.1熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算熒光猝滅是熒光物質(zhì)與溶劑或溶質(zhì)分子之間發(fā)生熒光強(qiáng)度降低的過程，實(shí)質(zhì)是發(fā)光過程相互競爭從而縮短發(fā)光分子激發(fā)態(tài)壽命的過程。熒光猝滅作用可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光劑的激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移或電荷轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致；而靜態(tài)猝滅則是猝滅劑與熒光劑基態(tài)之間相互作用所致[22]。為闡明碘單質(zhì)與AuNCs@BSA的熒光猝滅機(jī)理,用Stern-Volmer方程對(duì)碘單質(zhì)與AuNCs@BSA濃度依賴的變溫?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行分析：

IF0/IF=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

圖4 金納米簇與碘的Stern-Volmer曲線Fig.4 Stern-Volmer curves under different temperatures of AuNCs@BSA with I2

式(1)中IF0和IF分別為加入猝滅劑前后AuNCs@BSA的熒光強(qiáng)度，KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，Kq為猝滅過程速率常數(shù)，[Q]為猝滅劑的濃度，τ0為熒光劑分子平均壽命，由圖1B可知AuNCs@BSA熒光壽命約為11 μs。以IF0/IF對(duì)[Q]作圖，并計(jì)算出不同溫度下的Kq和KSV。由圖4可知，在298、308、318 K的溫度下IF0/IF與[Q]呈良好的線性關(guān)系。表2結(jié)果表明，KSV隨溫度的升高而減小,KSV均小于2.0×1010L/mol·s。由于2.0×1010L/mol·s為生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)，大于此值定義為靜態(tài)猝滅，而小于此值定義為動(dòng)態(tài)猝滅[22]，因此，可確定本文碘單質(zhì)誘導(dǎo)AuNCs@BSA熒光猝滅為動(dòng)態(tài)猝滅過程。

基于修正的Stern-Volmer方程(2)，利用IF0/(IF0-IF)與[Q]作圖，其中Ka為有效猝滅常數(shù)，fa為接近猝滅體的分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IF0/(IF0-IF)與[Q]呈良好的線性關(guān)系，且Ka值隨著溫度升高而逐漸減小，這與KSV的變化趨勢一致,進(jìn)一步證明碘單質(zhì)引起的AuNCs@BSA熒光猝滅是動(dòng)態(tài)猝滅過程。由式(2)計(jì)算出不同溫度下的有效猝滅常數(shù)Ka，帶入式(3)和(4)，R為氣體常數(shù)，分別計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS和ΔG(表3)，發(fā)現(xiàn)ΔH>0且ΔS>0，表明碘與AuNCs@BSA之間的相互作用屬于疏水作用[23-24]。

表2 不同溫度下金納米簇與碘的KSV和KqTable 2 Stern-Volmer quenching constants(KSV )and the quenching rate constants(Kq )of I2 binding to AuNCs@BSA at various temperatures

表3 金納米簇與碘在不同溫度下的熱力參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters for I2 binding to AuNCs@BSA at different temperatures

IF0/(IF0-IF)=1/(fa·Ka·[Q])+1/fa

(2)

lgKa=-ΔH/(2.303RT)+ΔS/(2.303R)

(3)

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

2.4.2熒光響應(yīng)機(jī)理研究據(jù)文獻(xiàn)[25]報(bào)道，AuNCs@BSA中的金核與BSA通過Au—S相結(jié)合，金納米簇中的配體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)AuNCs@BSA熒光變化起到關(guān)鍵作用，如果配體蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，會(huì)導(dǎo)致AuNCs@BSA的熒光光譜變化。所以本文推測碘單質(zhì)引起AuNCs@BSA熒光發(fā)射峰的猝滅，主要原因在于碘的加入使配位的BSA構(gòu)象發(fā)生變化，測定了BSA及加入碘前后AuNCs@BSA的紅外光譜圖,發(fā)現(xiàn)合成的AuNCs@BSA及加入碘的紅外光譜中只有微小的變化(圖5A)，不利于分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。圖5B分別為配體BSA、AuNCs@BSA及加入碘后的AuNCs@BSA的圓二色譜圖，由圖可知配體BSA的圓二色譜圖中有 222、210 nm兩個(gè)負(fù)峰，兩峰均為α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰。BSA與金核通過Au—S結(jié)合后，其在222 nm處的峰強(qiáng)度較BSA的峰強(qiáng)度弱，使得210 nm處的峰移至208 nm，表明α-螺旋的含量減少，而無規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)增多，說明已形成金納米簇，這與之前的報(bào)道相符[26]。而碘加入到AuNCs@BSA中后，222 nm的峰強(qiáng)度較AuNCs@BSA進(jìn)一步變?nèi)?，說明α-螺旋的結(jié)構(gòu)繼續(xù)減少，而無規(guī)卷曲的含量增多。綜上所述，碘的加入影響了配體BSA的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，這可能是引起AuNCs@BSA熒光猝滅的重要原因，詳細(xì)的機(jī)理有待于繼續(xù)研究。

3 結(jié) 論

本文以AuNCs@BSA為熒光探針，建立了碘單質(zhì)的檢測方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品中碘單質(zhì)的檢測。詳細(xì)探討了其熒光猝滅機(jī)制，并利用Stern-Volmer方程計(jì)算和分析熒光數(shù)據(jù)。熒光猝滅速率常數(shù)值說明碘單質(zhì)引起AuNCs@BSA的熒光發(fā)射峰猝滅屬于動(dòng)態(tài)猝滅過程，熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果表明碘與AuNCs@BSA之間主要是疏水作用。結(jié)合圓二色譜及紅外光譜圖的結(jié)果，認(rèn)為碘與配體BSA產(chǎn)生相互作用，引起了BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，從而誘導(dǎo)AuNCs@BSA的熒光光譜猝滅。

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