李忠健 ，張鵬遠(yuǎn) ，靳金粉 ，趙蘭勇 *，徐宗大 *

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東省林木種苗和花卉站，山東 濟(jì)南 250000）

玫瑰屬于薔薇科薔薇屬，花形優(yōu)美，花香四溢，耐寒抗旱，便于管理。花色作為玫瑰一種主要觀賞特性，直接影響其觀賞價(jià)值。類黃酮途徑是玫瑰花色形成的主要途徑[1]，黃酮醇合成酶基因（FLS）是該途徑中關(guān)鍵基因之一，它的表達(dá)量多少直接影響著花色的形成[2-3]。

Holton等[4]利用PCR技術(shù)首次從矮牽牛中克隆出黃酮醇合成酶基因，之后FLS在苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）[5]、 煙草 （Nicotiana tabacun）[6]、 茶樹（Camellia sinensis）[7]、金銀花（Lonicera japonica）[8]等多種植物成功被克隆，其蛋白結(jié)構(gòu)也已明確。在此基礎(chǔ)上，F(xiàn)LS基因開始通過基因工程應(yīng)用于花色基因的改良工作，Zhou等[9]將金花茶的FLS基因在煙草中過量表達(dá)后，煙草花色轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨忘S色，并且花色苷成分明顯減少，黃酮醇明顯增加，進(jìn)一步說明該基因是在類黃酮途徑中的重要基因。

玫瑰花色多以紫色為主，也有少量粉色、白色品種，但是缺乏黃色、橙色等品種[10]，花色的單一嚴(yán)重限制了玫瑰作為觀賞植物的應(yīng)用。目前雜交育種的手段是改良玫瑰花色的主要方法，而很少利用基因工程，因此怎樣通過基因工程改良玫瑰花色可作為今后培育玫瑰新品種的一個(gè)新的研究方向。FLS基因作為玫瑰花色合成途徑上的關(guān)鍵基因之一，本研究將其在玫瑰花瓣中分離并分析，對(duì)今后玫瑰花色的改良有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間地點(diǎn)

2016年于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院花卉研究所進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 植物材料

所用植物為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)玫瑰種質(zhì)資源圃內(nèi)的玫瑰野生類型 ‘琿春’（Rosa rugosa‘Hunchun’），2016年4月至5月中旬采摘初開期花瓣，迅速放入液氮中，然后保存于-80℃冰箱中。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因克隆

采用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒提取‘琿春’花瓣的總RNA，1.0%的非變性瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，利用Nanodrop2000C微量分光光度檢測(cè)RNA的純度和濃度。檢測(cè)合格的RNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒5X ALL-In-One RT MasterMix說明書合成cDNA第一鏈。參照本實(shí)驗(yàn)室已有的玫瑰花瓣轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)該FLS基因特異性引物：上游引物 RrFLS：5’-ATGGGGGTAGAGAGAGTTC-3’；下游 引 物 RrFLSR：5’-AGATGGCCAGTGGTACGAT-3’，引物合成由上海生物工程有限公司進(jìn)行。

以cDNA作為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增該基因的目的片段。PCR反應(yīng)體系為：滅菌ddH2O 9.5uL、2×EasyTaqSuperMix 12.5μL、目的基因上下游引物各 1μL、模板 cDNA 1uL，共 25μL。 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 5min；94℃變性 1min，55℃退火 45s，72℃延伸 1min，35個(gè)循環(huán)，72℃保溫 10min。 用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得的PCR產(chǎn)物。根據(jù)Magen膠回收試劑盒說明書將目的條帶進(jìn)行回收，與TaKaRa的PMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行PCR鑒定后挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

3‘RACE擴(kuò)增根據(jù)測(cè)序得到的玫瑰FLS基因片段序列，設(shè)計(jì)巢式PCR所需特異性引物：RrFLS-1：5’-TGCTCTTGGTGTGGTTGC-3’；RrFLS-2：5’-AGATGGCCAGTGGTACGAT-3’；B26：5’-GACTCTAGACGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。

以cDNA為模板，用巢式PCR特異性引物進(jìn)行3’端擴(kuò)增。第一輪PCR：用RrFLS-1和B26做第一輪PCR引物，反應(yīng)體系同上，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性 5min；94℃ 變 性 1min，55℃ 退 火 30s，72℃ 延 伸45s，35 個(gè)循環(huán)，72℃保溫 10min。 第二輪 PCR：將第一輪產(chǎn)物稀釋100、500、700倍作為模板，RrFLS-2和B26做第二輪PCR引物，反應(yīng)體系同上，反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5min；94℃變性 1min，55℃退火30s，72℃延伸 45s，35 個(gè)循環(huán)，72℃保溫 10min。 用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得的PCR產(chǎn)物。根據(jù)Magen膠回收試劑盒說明書將目的條帶進(jìn)行回收，與TaKaRa的PMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行PCR鑒定后挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

借助NCBI提供的在線Blast進(jìn)行同源序列的比對(duì)；利用DNAMAN對(duì)該蛋白與其他植物蛋白進(jìn)行多重比對(duì)分析；利用ExPasy服務(wù)器中在線軟件ProtParam預(yù)測(cè)RrFLS蛋白的基本理化性質(zhì)；利用NCBI中的CD-Search功能預(yù)測(cè)目的基因的保守域；利用ORFFinder對(duì)RrFLS基因cDNA的開放閱讀框進(jìn)行查找；利用在線軟件NetPhos3.1server、NetOGlyc4.0server和SignalP4.1，對(duì)目的基因編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)和信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用在線軟件TMpred軟件預(yù)測(cè)RrFLS蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用在線軟件SOPMA對(duì)目的基因編碼的蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用MEGA5.0構(gòu)建FLS系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RrFLS基因克隆結(jié)果

以玫瑰花瓣cDNA為模板，經(jīng)過擴(kuò)增測(cè)序得到741bp的RrFLS中間片段 （圖1），經(jīng)過過3’RACE擴(kuò)增后得到565bp的3’末端序列 （圖2），利用DNAstar對(duì)兩者經(jīng)過拼接后得到1287bp的cDNA序列全長(zhǎng)。利用DNAMAN對(duì)RrFLS的堿基序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其包括完整的開放閱讀框（ORF），含有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，具備長(zhǎng)度為1008bp的完整閱讀框架(ORF)，有polyA尾巴，編碼335個(gè)氨基酸（圖3）。

2.2 RrFLS基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 RrFLS基因基本理化性質(zhì)分析

圖1 中間片段的克隆Fig.1 Cloning of intermediate fragments

圖 2 3’RACE擴(kuò)增Fig.2 3’RACE amplification

圖3 RrFLS的基因序列及其氨基酸序列Fig.3 RrFLS cDNA nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence

根據(jù)ProtParam軟件對(duì)RrFLS蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果可以看出，RrFLS蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為38018.54Da，理論等電點(diǎn)pI=5.85，該蛋白為酸性。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為34.10（＜40），所以可推測(cè)RrFLS蛋白為穩(wěn)定蛋白。從ProtScale對(duì)RrFLS蛋白的疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果可看出，RrFLS蛋白疏水性最大值為1.878，最小值為-2.967，平均疏水指數(shù)為-0.455，所以推測(cè)該蛋白偏親水。

圖4 RrFLS蛋白保守域預(yù)測(cè)Fig.4 Prcdicts conservative structure domain of RrFLS

根據(jù)NCBI的CD-Search功能的結(jié)果可以看出，RrFLS基因有一個(gè)含有96個(gè)氨基酸殘基的保守結(jié)構(gòu)域，屬2OG-Fe(II)_oxy超級(jí)家族（圖4）

根據(jù)NetPhos 3.1 server的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果可以看出，該蛋白存在8個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)，8個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)。磷酸化位點(diǎn)數(shù)量較多，可以說明在RrFLS蛋白中可逆磷酸化調(diào)控有重要作用。利用NetOGlyc4.0server預(yù)測(cè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)的O糖基化位點(diǎn)，可知在玫瑰FLS中含有3個(gè)O糖基化位點(diǎn)，分別位于氨基酸序列的第22位、26位和108位。利用SignalP4.1軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列信號(hào)肽進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)，沒有信號(hào)肽及其剪切位點(diǎn)在RrFLS基因編碼的蛋白中。

根據(jù)TMpred軟件對(duì)RrFLS蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果可以看出，玫瑰RrFLS蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)SOPMA軟件對(duì)RrLFS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可知，該蛋白由36.12%的α螺旋、33.13%的隨機(jī)卷曲、7.46%的β轉(zhuǎn)角和23.28%的延伸鏈組成（圖 5）。

圖5 RrFLS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Predication of secondary structure of RrFLS

2.2.2 蛋白序列同源性和進(jìn)化樹分析

用DNAMAN軟件對(duì)包括玫瑰在內(nèi)的7種植物的FLS蛋白氨基酸進(jìn)行多重序列對(duì)比，從比對(duì)結(jié)果（圖6）可以看出，F(xiàn)LS在不同植物中保守性非常好，僅N端起始的1~19個(gè)氨基酸序列保守性比較差，表明不同物種的FLS的同源性非常高。

利用MEGA5，以包括玫瑰FLS在內(nèi)的16種植物的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，可以看出，與玫瑰同科的植物親緣關(guān)系較近，玫瑰與桃最先聚合，說明在以下幾種植物中它與桃的親緣關(guān)系最近，與薔薇、草莓在聚合為一個(gè)亞類，說明玫瑰與薔薇、草莓也有非常近的親緣關(guān)系，與其他科的植物親緣關(guān)系相隨比較遠(yuǎn)（圖7）。

3 討論

FLS基因是植物類黃酮物質(zhì)合成途徑中非常重要的基因，可以催化二氫黃酮醇結(jié)構(gòu)中的C3發(fā)生羥基化，形成黃酮醇類化合物[11-15]。因二氫黃酮醇為FLS基因和二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）基因的共同底物，所以黃酮醇以及花色苷的合成量與FLS基因表達(dá)量有直接聯(lián)系，因此FLS表達(dá)量的高低對(duì)花色形成也有重要影響。FLS作為影響花色形成的關(guān)鍵基因，已成功從多種植物分離出來。本研究運(yùn)用RT-PCR和RACE技術(shù)將FLS基因成功從玫瑰花瓣中克隆出來，經(jīng)生物信息學(xué)分析得到，RrFLS基因含1005bp的開放閱讀框，編碼335個(gè)氨基酸，其蛋白的分子式為C1731H2681N443O502S9，相對(duì)分子質(zhì)量為38018.54Da，等電點(diǎn)pI為5.85。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)

為34.10（＜40），為穩(wěn)定蛋白，不存在信號(hào)肽和剪切位點(diǎn)。其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由36.12%α螺旋、33.13%隨機(jī)卷曲、7.46%β轉(zhuǎn)角和23.28%延伸鏈組成。

圖6 不同植物FLS蛋白氨基酸序列多重比對(duì)Fig.6 Multiple alignment of FLS amino acid sequences from different plants

圖7 RrFLS與其它物種FLS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.7 The phylogenetic tree derived from the alignment of amino acid secquences of RrFLS and other FLS

RrFLS基因翻譯得到的氨基酸序列經(jīng)NCBI中Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它與其他植物氨基酸序列同源性較高，為67%~99%，與同科植物桃相比相似程度可達(dá)到99%，與薔薇科許多植物相似度可以到90%以上，以上結(jié)果可以說明FLS基因在不同物種之間是相對(duì)比較保守的，與前人實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同[16]，可為不同科屬植物親緣關(guān)系的研究提供理論依據(jù)。

Nieslen等[17]利用基因沉默技術(shù)抑制FLS基因，使洋桔梗的花色由紫色變?yōu)榧t色，并能穩(wěn)定遺傳。Holton等[4]向煙草中導(dǎo)入反義FLS基因后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)花色苷含量明顯升高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證明了FLS基因可以影響花色的形成。本研究通過對(duì)玫瑰花瓣中FLS基因進(jìn)行分離，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探明了RrFLS的信息，為今后玫瑰花色的改良提供了理論依據(jù)。

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