徐 麗， 陳 新， 宗曉娟， 朱東姿， 魏海蓉， 王甲威， 譚 鉞， 張力思， 劉慶忠

(山東省果樹研究所/山東省果樹生物技術重點實驗室，山東 泰安 271000)

干旱和鹽堿等非生物脅迫是影響植物生長發(fā)育的主要限制因素[1-3]。為適應這些非生物脅迫，植物在分子水平上進化形成了相應的機制，誘導脅迫相關轉錄因子的表達。因為轉錄因子能通過參與不同的復雜的信號通路，調控植物的生理生化活動來抵御逆境。WRKY是目前研究較為廣泛的一類植物特有的轉錄因子，存在1個或2個高度保守的WRKYGQK結構域及緊隨其后的一段鋅指結構[4]。研究結果表明擬南芥和水稻中分別有74和126個WRKY基因家族成員，而在綠藻中僅有一個成員[5]。Zhou等[6]把大豆GmWRKY13和GmWRKY54分別轉到擬南芥中，過量表達GmWRKY54的植株對干旱和鹽害都具有一定的忍耐性，而過量表達GmWRKY13的植株對鹽害和甘露醇脅迫敏感。過表達AtWRKY25和AtWRKY33能夠通過影響SOS(Salt overly sensitive)通路來提高擬南芥對高鹽環(huán)境的耐受性[7]。Song等[8]用PEG，NaCl和ABA處理轉OsWRKY08基因的擬南芥，發(fā)現OsWRKY08基因表達量增加，改善了轉基因擬南芥滲透調節(jié)能力。相似的ZmWRKY33受高鹽、干旱、低溫和ABA誘導表達，且轉基因擬南芥的耐鹽性提高[9]。Sun等[10]的研究結果表明二穗短柄草BdWRKY36能提高轉基因煙草耐受干旱的能力。棉花的GhWRKY17在受干旱、高鹽處理的誘導后大量表達[11]。目前已從擬南芥[12][Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.]、水稻[13](OryzasativaL.)、油菜[14](BrassicanapusL.)、大豆[15][Glycinemax(Linn.) Merr.]等植物中克隆到大量的WRKY轉錄因子。而櫻桃中還未見相關WRKY轉錄因子的研究報道。

由于櫻桃喜溫、不耐寒、不耐鹽堿，所以其分布和栽培區(qū)域受到限制，因此種植櫻桃除選擇抗逆性強的品種，還要選擇合適的具有抗性的砧木。櫻桃砧木在櫻桃生產中起著非常重要的作用，因此改善砧木抗逆性迫在眉睫。通過常規(guī)育種獲得新品種周期較長，而通過基因工程獲得抗逆新品種日益受到重視，其中關鍵基因的挖掘是前提。本課題組利用RNA-Seq技術獲得了櫻桃轉錄組數據，本研究以此轉錄組數據為基礎，以甜櫻桃砧木Gisela 6葉片為材料，采用RT-PCR方法，篩選并克隆了櫻桃砧木WRKY轉錄因子，進行了生物信息學和脅迫誘導表達模式分析，為櫻桃抗逆品種選育提供理論依據和技術支持，也為櫻桃的分子育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料為Gisela 6(PrunuscerasusXPrunuscanescens)組培苗。組培苗在MS+0.5 mg/L 6-BA，附加蔗糖20.0 mg/L、瓊脂6.0 mg/L，pH為5.6的繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)。對培養(yǎng)3周的組培苗分別轉移到添加甘露醇(200 mmol/L)和NaCl(200 mmol/L)的培養(yǎng)基上，每個處理重復3次，每個重復9瓶，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48和72 h取組培苗葉片。采集后立即投入液氮冷凍，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 RNA提取和cDNA合成

采用RN38-EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒(北京，艾德萊)提取總RNA。反轉錄參照Fermentas公司說明書進行，以Oligo(dT)18為引物合成cDNA第一鏈。

1.3 PcWRKY1基因的克隆

以獲得的櫻桃轉錄組數據為基礎，設計1對引物PcWRKY1-F(5′-ATGATTTCTCTAGGGGAACCTGG-3′)和PcWRKY1-R (5′-TTAGACAGGTTCTGCTTTTGGATTT-3′)。以反轉錄cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應條件: 94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段切膠回收和連接pEASY-Blunt載體(北京，全式金)，轉化大腸桿菌DH5α，菌落PCR檢測后挑取5個陽性菌落送交上海生工生物公司測序。

1.4 櫻桃PcWRKY1基因的生物信息學分析

用NCBI提供的在線ORF Finder( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找基因的開放閱讀框(ORF),用BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) 進行核苷酸及氨基酸序列的同源序列搜索,用DNAMAN軟件構建系統(tǒng)進化樹。用ProtParam (http://us.expasy.org/tools/ProtParam.html) 預測編碼蛋白質的分子量、等電點等理化特性，通過ProtScale軟件分析(http://www.expasy.org/cgibin/protscale.pl)氨基酸序列的疏/親水性。

1.5 PcWRKY1基因非生物脅迫表達分析

提取不同處理材料的總RNA，按照試劑盒說明書反轉錄合成第一鏈cDNA(Fermentas)。利用Real-time qRT-PCR分析櫻桃砧木PcWRKY1基因分別在200 mmol甘露醇和200 mmol NaCl脅迫下的表達情況。以稀釋后的cDNA為模板，甜櫻桃β-actin基因(Accession no. FJ560908)為內參，利用ABI7500型熒光定量PCR儀，參照康為公司UltraSYBR mixture with Rox試劑盒說明書進行。PCR反應條件：95 ℃變性10 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)。熒光定量PCR的引物序列為qF(5′-CTAATGATGATGGATACAAT-3′)和qR(5′-TCTTCTTAACAGGACAAT-3′)，每個樣品重復3次，相對基因表達根據2-△△Ct方法計算。

2 結 果

2.1 PcWRKY1基因克隆與序列分析

以甜櫻桃砧木葉片RNA反轉錄合成的cDNA為模板，以PcWRKY1-F和PcWRKY1-R為引物擴增獲得約1 500 bp的片段(圖1)，測序結果表明目的片段為1 461 bp。利用NCBI中的ORF Finder分析發(fā)現PcWRKY1基因起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼486個氨基酸。氨基酸序列分析發(fā)現該序列含有2個WRKY保守結構域和2個C2H2不同的鋅指基序(圖2)，一個是C-X4-C-X22-H-X1-H，另一個是C-X4-C-X23-H-X1-H，表明其屬于WRKY家族第Ⅰ類成員。ProtParam軟件分析結果顯示其分子量為52 940，等電點為5.84，不穩(wěn)定系數為43.68，屬于不穩(wěn)定蛋白質。親水性平均數為-0.897，預測該蛋白質為親水性蛋白。利用NCBI網站BLAST程序進行序列比對，該cDNA序列與其他植物的WRKY基因具有較高的相似性，與碧桃(XM_007215222.1)、梅(XM_008231659.2)、蘋果(XM_008381756.2)和白梨(XM_009366930.2)WRKY基因的核苷酸序列相似性分別為98%、98%、85%和85%。這表明分離得到的cDNA序列是甜櫻桃砧木的WRKY基因，將其命名為PcWRKY1，GenBank登錄號為KY399985。

M：DL2000 marker；1：PcWRKY1基因全長PCR擴增產物。圖1 PcWRKY1基因PCR擴增產物電泳分析Fig.1 Electrophoresis of amplified product of PcWRKY1 gene

2.2 PcWRKY1系統(tǒng)進化分析

將推導的PcWRKY1氨基酸序列經BLAST比對，搜索與PcWRKY1同源性較高的植物氨基酸序列。結果顯示PcWRKY1氨基酸序列與碧桃、梅、白梨和蘋果等WRKY基因編碼的氨基酸一致性分別為98%、98%、76%和72%。為了進一步分析PcWRKY1與其它WRKY基因的親緣關系，下載10個其他植物WRKY基因編碼的氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹(圖3)，結果表明PcWRKY1與來自薔薇科的碧桃和梅親緣關系最近，與白梨和蘋果次之。

2.3 PcWRKY1的非生物脅迫表達分析

研究結果表明，WRKY基因能受很多信號分子誘導，為進一步研究PcWRKY1在非生物脅迫誘導下的表達情況，用干旱和鹽對甜櫻桃砧木進行處理。以甜櫻桃β-actin基因為內參，利用qRT-PCR方法對甜櫻桃砧木葉片PcWRKY1基因在干旱(200 mmol甘露醇)和鹽(200 mmol NaCl)脅迫下的表達情況進行初步研究，干旱處理2 h和4 h時PcWRKY1基因的表達量基本相同，6 h時表達量達到最大值，之后表達量呈下降趨勢，但在整個脅迫過程中表達量均高于對照時期(0 h)，說明PcWRKY1基因可能在干旱脅迫中起作用(圖4)。而NaCl處理2 h時PcWRKY1基因表達量開始升高，隨著處理時間延長表達量逐漸增強, 在處理6 h時PcWRKY1基因表達量達到最大值，隨后表達量開始下降，但在整個脅迫過程中表達量均高于對照時期(0 h)，表明PcWRKY1基因可能在響應鹽脅迫中起作用(圖5)。

灰色區(qū)域為WRKY轉錄因子的特征序列WRKYGQK；方框內是起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)；下劃線部分是鋅指結構域C2H2，其中C和H殘基用方框標出。圖2 PcWRKY1基因的堿基序列及預測的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and the predicted amino acid sequence of PcWRKY1

圖3 甜櫻桃砧木PcWRKY1氨基酸序列與不同物種WRKY氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the amino acid sequence of PcWRKY1 in cherry rootstock and the amino acid sequence of WRKY from different species

圖4 200 mmol甘露醇處理下PcWRKY1基因的表達Fig.4 Expression of PcWRKY1 gene under the treatment of 200 mmol mannitol

圖5 200 mmol NaCl處理下PcWRKY1基因的表達Fig.5 Expression of PcWRKY1 gene under the treatment of 200 mmol NaCl

3 討 論

WRKY轉錄因子廣泛參與植物的生長、發(fā)育、衰老等進程，對各種生物脅迫和非生物脅迫都有一定響應。但是關于WRKY轉錄因子的研究多集中于擬南芥和煙草等模式植物中，而有關櫻桃轉錄因子的相關研究還未見報道。本研究從甜櫻桃砧木中分離到1個WRKY基因，生物信息學分析結果表明，PcWRKY1編碼486個氨基酸，推測相對分子量為52 940。根據WRKY結構域的數量和鋅指結構域的特征，WRKY家族被劃分成3類[16]，第I類包含2個WRKY結構域，第II類包含1個WRKY結構域，其鋅指結構均為C2H2(C-X4～5-C-X22～23-H-X1-H)型，第III類與第II類相同，含有1個WRKY結構域，但其鋅指結構為C2HC (C-X7-C-X23-H-X1-C)型。PcWRKY1含有2個高度保守的的WRKY結構域，鋅指結構為C2H2型，屬于WRKY家族第I類成員。系統(tǒng)進化分析結果顯示，PcWRKY1與來自薔薇科的碧桃和梅的WRKY同源性最高，與薔薇科植物聚在一起，表明該蛋白質在植物進化過程中比較保守，也暗示了其在功能上的保守性。

干旱和鹽都會導致植物缺水，缺水可影響植物的新陳代謝、生長發(fā)育、胞膜透性和蛋白質含量等。轉錄因子在植物耐受干旱和鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。其中WRKY基因家族成員被證實能響應植物對干旱和鹽的脅迫[17-18]。共表達擬南芥AtWRKY28和AtbHLH17能夠顯著提升多種非生物脅迫的耐受性，包括干旱、高鹽和氧化脅迫[19]。過表達水稻OsWRKY45提高了水稻的耐鹽、耐旱性，同時還增強了植株的免疫力[20]。過表達棉花hWRKY39-1能夠提高轉基因煙草對鹽的耐受性[21]。本研究通過熒光定量PCR對櫻桃砧木在200 mmol甘露醇和200 mmol NaCl脅迫下PcWRKY1的表達模式進行了分析。結果顯示，PcWRKY1在干旱脅迫后表達量明顯上升，6 h時表達量達到最高。在鹽脅迫中PcWRKY1的表達情況與干旱脅迫相似，被誘導2 h后表達量開始升高，并且隨著時間延長在72 h內一直處于高表達水平。研究結果表明第Ⅰ類WRKY蛋白在起源上屬于較為原始的一個類群，也最為保守，可參與對病原菌和非生物逆境的抗性[22]。序列分析結果表明PcWRKY1屬于第I類WRKY基因家族成員，結合熒光定量分析結果，推測PcWRKY1可能同時響應干旱脅迫和鹽脅迫。為了進一步研究該基因的功能，作者已經將該基因構建了植物表達載體，進行煙草轉化試驗，進一步分析該基因的抗逆性。

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