闞延澤， 孫文秀， 李 偉

(長江大學生命科學學院,湖北 荊州 434025)

醛酮還原酶(AKR)是一類依賴NADH/NADPH作為輔酶將醛酮類物質(zhì)還原為相應醇類物質(zhì)的氧化還原酶[1-2]。它們在生物界廣泛分布，植物、動物和微生物中均有報道[3]。已知的醛酮還原酶數(shù)量眾多，包括16個家族近200個成員[4]。序列比對分析發(fā)現(xiàn)醛酮還原酶之間具有一定的序列同源性，都具有一個典型的(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)[5]。其中，醛酮還原酶負責底物催化的關(guān)鍵氨基酸一般由相對保守的催化四聯(lián)體(D-Y-K-H)組成[6-7]。醛酮還原酶底物廣泛，包括醛酮類化合物、芳香類化合物、醛糖和類固醇等[3-4]。每個醛酮還原酶家族都有其特異性底物，同時在機體內(nèi)行使獨特的生物學功能，例如AKR7家族可以降解致癌羰基化合物，在生物體內(nèi)參與機體的保護和防御[8]；AKR1C亞家族具有代謝人體性激素的能力，參與人體激素代謝和調(diào)節(jié)[9-10]；醛糖還原酶(AR)通過將葡萄糖催化還原成山梨醇，同時減輕果糖和山梨醇在周圍組織細胞中的過多積累，從而達到抑制糖尿病的功能[11-12]。代海艷等[13]重組表達了黃鱔醛酮還原酶基因Eakr，發(fā)現(xiàn)含該重組基因的菌株比野生菌株抗羰基化合物脅迫的能力增強。除此之外，國內(nèi)外對魚類醛酮還原酶基因及功能的研究相對匱乏。僅有少數(shù)羅非魚醛酮還原酶AKR1A1羰基解毒作用的報道[14]。黃鱔醛酮還原酶Eakr的氨基酸序列與已報道的所有醛酮還原酶家族成員同源性均小于25%，且其催化四聯(lián)體氨基酸為D-Y-A-H，這與其他已知醛酮還原酶的催化四聯(lián)體存在一個氨基酸的差別。本研究擬通過將黃鱔Eakr第81位丙氨酸(A)進行定點突變?yōu)橘嚢彼?K)，分析突變蛋白EakrA81K的底物譜，比較野生型(Eakr)和突變型蛋白(EakrA81K)對不同代謝底物的活性變化，為深入了解黃鱔醛酮還原酶Eakr的功能及其催化四聯(lián)體在底物識別上的作用提供重要的參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

BL21(DE3)菌株購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。含pET-28a-Eakr的BL21(DE3)菌株，含pET-28a (+)空白質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株，均由本實驗室構(gòu)建并保存于長江大學生物醫(yī)藥研究所。Ni離子親和層析柱購于上海七海復泰生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化有限公司。DNA凝膠回收試劑盒、PfuDNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。酶反應底物丙酮醛、苯甲醛、反式丁烯醛購自上海阿拉丁生化技術(shù)股份有限公司。3-戊酮、2,3-戊二酮、2,4-戊二酮購自上海麥克林生化技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 黃鱔Eakr基因A81K位點的定點突變

用快速質(zhì)粒DNA中量提取試劑盒，從含pET-28a-Eakr質(zhì)粒的BL21(DE3)菌中提取質(zhì)粒DNA。用突變引物對F1：5′-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3′和Rm：5′-TCTGCACAGCTGGTGCCTTATCTCCAGAGGACT-3′擴增突變位點及上游片段；用突變引物對Fm：5′-AAGTCCTCTGGAGATAAGGCACCAGCTGTGCAGAG-3′和R1：5′-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTATCGC-3′擴增突變位點及下游片段。引物中突變位點堿基用斜體標出，酶切位點用下劃線標出。將第1次PCR擴增產(chǎn)物回收、純化后等量混勻，利用F1和R1引物進行重疊PCR擴增。每次PCR擴增均采用Tran Start Fast Pfu DNA Polymerase高保真DNA聚合酶以降低錯義突變。擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后連接T載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，送上海鉑尚生物技術(shù)公司進行序列測定。

1.3 表達載體構(gòu)建及重組蛋白表達及純化

提取經(jīng)測序驗證過的質(zhì)粒DNA，采用限制內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ進行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收后純化，并連接到同樣雙酶切的pET-28a(+)中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，經(jīng)卡納霉素抗性篩選、菌落PCR驗證及SDS-PAGE電泳檢測獲得陽性表達菌株。

將野生型和突變型陽性重組菌按 1∶50分別接種到200 ml 新鮮LB培養(yǎng)基，200 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導，37 ℃誘導培養(yǎng)4 h，將誘導表達完成后的菌液在4 ℃ 10 000 r/min條件下離心15 min，棄上清液，收集菌體加入PBS(pH8.5)洗滌菌體，重懸后，用超聲波破碎菌體細胞(工作5 s，間隔15 s，工作80次)；將細胞破碎液在4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄上清液，收集沉淀，加入適量PBS 緩沖液(pH=8.5，50 mmol/L，含6 mol/L鹽酸胍)重懸，于4 ℃中靜置1 h以上去除包涵體，再次離心，收集上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后加入鎳離子親和層析柱中結(jié)合12 h，用不同咪唑濃度(20 mmol/L，100 mmol/L，200 mmol/L，300 mmol/L)的PBS緩沖液進行梯度洗脫，洗脫液收集裝入透析袋中，密封后于4 ℃透析過夜，收集透析后進行12%的SDS-PAGA電泳檢測。

1.4 EakrA81K酶活性檢測及底物特異性分析

利用普析通用公司TU-1900紫外分光光度計測定還原型輔酶NADPH在340 nm處吸光值的變化來評價Eakr和EakrA81K的活性。酶活性單位定義為：醛酮還原酶在最適條件下1 min消耗1 μmol的NADPH為1個酶活性單位(U)。取比色皿，依次加入1 000 μl 50.0 mmol/L PBS(pH=5.0)，50 μl酶液，850 μl底物(約10.0 mmol/L)，80 μl甲醇，37 ℃保溫10 min后，加入20 μl 0.1 mmol/LNADPH，總體系為2 ml，將比色皿放入紫外分光光度計中，測定340 nm處吸光值的變化并記錄，每個底物重復3次。酶活性計算按照Chen等[15]報道的方法進行，米氏常數(shù)(Km)和催化常數(shù)(kcat)參照文獻[16]計算。

按照上述方法，分別測量Eakr和EakrA81K重組蛋白對苯甲醛、鄰苯二甲醛、甲醛、戊二醛、反式丁烯醛、甘油醛、2,3-丁二酮、丙酮、醋酸甲羥孕酮、蒽酮、黃體酮、甲睪酮、甲酸、戊酸雌二醇、2-戊酮、3-戊酮、2,3-戊二酮、2,4-戊二酮、葡萄糖等底物的酶活性。

1.5 野生型與突變型蛋白的溫度及pH耐受性分析

在標準反應體系中，取等量野生型與突變型蛋白分別與甲醛(10 mmol/L)混勻后在不同溫度(10 ℃， 20 ℃，30 ℃，35 ℃，37 ℃，40 ℃，50 ℃)靜置3 min或在不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)的PBS緩沖溶液中靜置3 min測定其相對酶活性，以其最適反應溫度或最適pH下的相對酶活性為100%，每個處理重復3次。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鱔醛酮還原酶基因的定點突變

通過引物對Fm和R1及引物對F1和Rm PCR擴增后分別得到了1條約750 bp的條帶和1條約250 bp的條帶，大小與預期相符(圖1a)；將上述PCR片段回收純化后等量混合進行重疊PCR反應，得到了1條特異的分子量約1 000 bp的條帶(圖1b)，證明重疊PCR已經(jīng)成功實現(xiàn)了上下游基因片段的融合。將上述重疊PCR片段經(jīng)過回收、純化克隆測序后得知，黃鱔Eakr基因的第81號位氨基酸對應的堿基已經(jīng)由原來的GCT突變成了AAG，其對應氨基酸也已由丙氨酸(A)突變成賴氨酸(K)；除此以外，測序結(jié)果表明，該突變基因沒有產(chǎn)生其他錯義突變。

泳道1～2：擴增的下游片段；3～4：擴增的上游片段；5～6：擴增的重疊片段；M：DNA分子量標準。圖1 重疊 PCR擴增突變基因電泳Fig.1 Electrophoresis of the gene mutation products from SOE-PCR amplification

2.2 重組蛋白EakrA81K的純化

將含有pET-EakrA81K的重組菌株經(jīng)過0.1 mmol/L IPTG誘導后，表達了1條分子量約38 000的蛋白，這表明陽性重組子成功實現(xiàn)了融合表達；EakrA81K蛋白約占大腸桿菌總蛋白的40%以上，通過Ni離子親和層析，實現(xiàn)了突變體蛋白EakrA81K的純化(圖2)。

1：空白質(zhì)粒菌株；2：誘導前的含pET-28-EakrA81K菌株；3：誘導后的含pET-28-EakrA81K菌株；4：20 mmol咪唑洗脫后蛋白；5：100 mmol咪唑洗脫蛋白；6：200 mmol咪唑洗脫蛋白；M：蛋白質(zhì)分子量標準。圖2 重組EakrA81K蛋白的SDS-PAGE電泳Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of EakrA81K protein

2.3 重組蛋白EakrA81K的底物特異性及酶動力學常數(shù)

以NADPH為輔酶，檢測重組蛋白EakrA81K對醛、酮類物質(zhì)的還原活性。結(jié)果表明：該重組蛋白對所測醛類物質(zhì)及中長鏈酮類物質(zhì)具有良好的還原活性,但對醇、糖、酸類物質(zhì)酶活性極低或未檢測到(表1)。其中，對3-戊酮活性最高，其酶比活力約0.882 U/mg。在所測底物中，重組蛋白EakrA81K與醛類物質(zhì)的米氏常數(shù)(Km)均低于酮類物質(zhì)，說明該酶和醛類物質(zhì)的親和力更高。甲醛的米氏常數(shù)最低(2.957 mmol/L)，說明所測底物中甲醛和EakrA81K結(jié)合效率最高。同時，隨著底物碳原子數(shù)目的增加，底物的米氏常數(shù)值也隨之升高，結(jié)合效率降低(表1)。

表1 EakrA81K底物譜及酶動力學常數(shù)

“-”表示未檢測到活性。

2.4 A81K定點突變對酶活性的影響

表2表明，野生型黃鱔醛酮還原酶Eakr最適底物為2,3-丁二酮。Eakr對2-戊酮的還原活性僅為對2,3-丁二酮活性的4.6%，而對2,4-戊二酮的酶活性僅為對2,3-丁二酮酶活性的5.6%。但是，野生型蛋白對含有3-位酮基團的3-戊酮和2,3-戊二酮的酶活性較高，分別為對2,3-丁二酮酶活性的73.0%和84.5%。由此可知，Eakr在底物選擇上更傾向于3-位酮基，當?shù)孜锝Y(jié)構(gòu)中存在與3-位酮基相鄰的2-位酮基時還原活性更好。相比突變前，突變型重組蛋白EakrA81K對甲醛、2-戊酮、甘油醛、2,4-戊二酮和戊二醛等底物的活性顯著升高(表2)。突變型蛋白EakrA81K最適底物為3-戊酮 (Km=12.257)，對2-戊酮(Km=9.136)的還原活性為對3-戊酮活性的66.7%。分析其米氏常數(shù)，顯然突變型蛋白對2-戊酮的親和力更高(表1)。

表2 野生型Eakr和突變型蛋白EakrA81K的酶比活力

P<0.01時表示差異極顯著，P<0.05時表示差異顯著。

2.5 溫度和pH對Eakr以及EakrA81K蛋白的影響

使用甲醛作為底物，研究了pH和溫度對Eakr以及EakrA81K蛋白酶活性的影響。結(jié)果表明，在pH為4時野生型蛋白Eakr活性最高，pH為4.5時其依然保持70%左右的酶活性，當pH繼續(xù)升高后Eakr的活性急劇下降。相似地，突變型蛋白EakrA81K在pH 4.5～5.5時保持70%以上的酶活性，在此pH范圍之外，對甲醛的還原活性急劇下降(圖3)。由此看出，A81K位點突變稍降低了黃鱔醛酮還原酶的酸度耐受能力。

圖3 不同pH條件下野生型Eakr及突變型蛋白EakrA81K的相對酶活性Fig.3 The relative activity of Eakr and EakrA81K in different pH condition

同樣地，溫度對野生型Eakr及突變型蛋白EakrA81K具有相似的影響。Eakr在35 ℃活性最高，在 30～40 ℃可保持50%以上的酶活性；EakrA81K最適反應溫度為37 ℃，在溫度 35～40 ℃時保持80%以上的酶活性(圖4)。從相對酶活性上分析，突變型蛋白比野生型蛋白的溫度耐受性略高。

圖4 不同溫度下野生型Eakr及突變型蛋白EakrA81K的相對酶活性Fig.4 The relative activity of Eakr and EakrA81K under different temperature

3 討 論

本研究通過重疊PCR技術(shù)將黃鱔醛酮還原酶Eakr催化四聯(lián)體中81位氨基酸丙氨酸(A)突變?yōu)橘嚢彼?K)后，實現(xiàn)了突變蛋白EakrA81K的重組表達及純化。根據(jù)已知的醛酮還原酶底物譜，分析了突變型蛋白底物特異性。結(jié)果表明，突變型蛋白EakrA81K對醛類物質(zhì)以及中長鏈酮類物質(zhì)具有較高的還原活性；野生型醛酮還原酶Eakr及突變型EakrA81K蛋白均沒有檢測到對醇、糖、酸類物質(zhì)的還原活性，這表明黃鱔醛酮還原酶可能不屬于醛糖還原酶或醛醇還原酶家族的成員。突變型蛋白EakrA81K與醛類物質(zhì)親和力較好，但隨著底物碳原子數(shù)目的增加，酶與底物親和力下降，這可能是碳原子數(shù)目增加導致底物與酶難以靠近造成的。Wang等[17]對人的醛酮還原酶LEK底物譜的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，隨底物的碳原子數(shù)量增多，LEK與底物親和力降低，還原活性下降。A81K位點突變導致酶對大部分底物的活性顯著提升，這可能是因為賴氨酸(K)是一種具有較長側(cè)鏈的堿性氨基酸，它可以通過與底物形成氫鍵等方式幫助底物與酶分子結(jié)合進入活性中心完成還原反應。野生型Eakr蛋白在還原中長鏈酮類時選擇3-位酮基作為催化位點，而2-位酮基的存在對底物與酶的結(jié)合起到促進作用。類似試驗結(jié)果也在氧化葡萄糖酸桿菌的醛酮還原酶AKR5C3的研究中報道過[18]。突變型蛋白EakrA81K對含3-位酮基的化合物表現(xiàn)良好的還原活性，且對含2-位酮基的底物還原活性大大增強。但當?shù)孜?,3-位同時存在酮基時，EakrA81K對其還原活性顯著下降。推測，底物2-位酮基的存在對3-位酮基的還原產(chǎn)生了非競爭性抑制是導致該酶對此類二酮類底物酶活性降低的主要原因。以上結(jié)果表明黃鱔醛酮還原酶Eakr第81位氨基酸在底物識別上具有重要作用。該研究為深入了解魚類醛酮還原酶的生物學功能提供了方向和基礎資料，同時為研究Eakr底物結(jié)合位點，拓寬底物譜以及酶改造提供了重要參考資料。

參考文獻:

[1] MINDNICH R D, PENNING T M. Aldo-keto reductase(AKR) superfamily: genomics and annotation [J]. Hum Genomics, 2009, 3 (4)： 362-370.

[2] 代海艷，江 翱，李 偉．黃鱔醛酮還原酶的羰基解毒作用初探[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017,45(1):150-152.

[3] HYNDMAN D, BAUMAN D R, HEREDIA V V, et al. The aldo-keto reductase superfamily homepage [J]. Chem Biol Interact, 2003, 143/144 (2)： 621-631.

[4] PENNING T M. The aldo-keto reductases (AKRs): Overview [J]. Chem Biol Interact, 2015, 234： 236-246.

[5] SCOBLE J, MCALISTER A D, FULTON Z, et al. Crystal structure and comparative functional analyses of aMycobacteriumaldo-keto reductase [J]. Mol Biol, 2010, 398： 26-39.

[6] SUN L, CHEN Y, RAJENDRAN C, et al. Crystal structure of perakine reductase, founding member of a novel aldo-keto reductase (AKR) subfamily that undergoes unique conformational changes duringNADPHbinding [J]. J Biol Chem, 2012, 287(14)： 11213-11221.

[7] KAMITORI S, IGUCHI A, OHTAKI A, et al. X-ray structures of NADPH-dependent carbonyl reductase fromSporobolomycessalmonicolorprovide insights into stereoselective reductions of carbonyl compounds [J]. J Mol Biol, 2005, 352(3)： 551-558.

[8] LI D, ELLIS E M, FERRARI M. Human aldo-keto reductaseAKR7A2 protects against the cytotoxicity and mutagenicity of reactive aldehydes and lowers intracellular reactive oxygen species in hamster V79-4 cells [J]. Chem Biol Interact, 2012, 195(1)： 25-34.

[10] HEVIR N, VOUK K, SINKOVEC J, et al. Aldo-keto reductases AKR1C1, AKR1C2 and AKR1C3 may enhance progesterone metabolism in ovarian endometriosis [J]. Chem Biol Interact, 2011, 191(1)： 217-226.

[11] SINGH R, KISHORE L, KAUR N. Diabetic peripheral neuropathy： current perspective and future directions [J]. Pharmacol Res,2014, 80： 21-35.

[12] 李宏哲，李才銳，孫曙光. 醛糖還原酶在糖尿病視網(wǎng)膜病變中作用的研究進展 [J]. 國際眼科雜志, 2015, 15(7)： 1176-1178.

[13] 代海艷，江 翱，李 偉. 黃鱔醛酮還原酶的羰基解毒作用初探 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學, 2017, 45(1)： 150-152.

[14] OSORIO-YEZ C, LUIS GARCA-TAVERA J, TERESA PéREZ-NEZ M, et al. Benzo (α) pyrene induces hepatic AKR1A1 mRNA expression in tilapia fish (Oreochromisniloticus) [J]. Toxicology Mechanisms and Methods, 2012, 22(6)： 438-444.

[15] CHEN M, LIN J P, MA Y S, et al. Characterization of a novel NADPH-dependent oxidoreductase fromGluconobacteroxydans[J]. Mol Biotechnol, 2010,46：176-181.

[16] HONG S, NAM H K, KIM K R，et al. Molecular characterization of an aldo-keto reductase fromMarivirgatractuosathat converts retinal to retinol [J]. J Biotechnol, 2014,169：23-33.

[17] WANG Q, YE T, MA Z, et al. Characterization and sitedirected mutation of a novel aldo-keto reductase fromLodderomyceselongisporusNRRL YB4239 with high production rate of ethyl (R)4chloro3hydroxybutanoate [J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2014, 41(11)： 1609-1616.

[18] 劉 旭. 基于結(jié)構(gòu)解析的醛酮還原酶AKR5C3的底物選擇性研究 [D]. 上海：華東理工大學, 2011.