陳 靜， 何吉祥， 樊佳佳， 黃 龍， 吳本麗， 宋光同， 汪 翔， 武 松

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，安徽 合肥 230031； 2.農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380)

生肌決定因子基因MyoD是生肌調(diào)節(jié)因子基因MRFs家族(MyoD、MyoG、Myf5和MRF4)的主要成員之一，生肌調(diào)節(jié)因子具有一個(gè)保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(bHLH)[1-2]。MyoD在成肌細(xì)胞分化為肌纖維的過程中起關(guān)鍵的正向調(diào)控作用，控制著很多關(guān)鍵基因的表達(dá)[3-5]。因?yàn)闀r(shí)空表達(dá)模式不同，4個(gè)MRFs家族成員在動(dòng)物肌肉發(fā)育過程中所發(fā)揮的作用不同[6]，其中MyoD基因是脊椎動(dòng)物胚胎期肌肉發(fā)育的主要調(diào)控基因，主要作用是促進(jìn)骨骼肌的形成和分化，缺少M(fèi)yoD基因可導(dǎo)致成肌細(xì)胞無法正常增殖和分化[7-8]。MyoD與肌肉基因啟動(dòng)子的E-BOX區(qū)域結(jié)合后，能激活肌肉特異性轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)肌前體細(xì)胞的增殖和分化，另外MyoD基因還可使成纖維細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞，最終分化為成熟肌纖維[9]。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)和插入/缺失(Insertion/deletion, Indel)標(biāo)記作為新型分子標(biāo)記，廣泛分布于整個(gè)基因組，是動(dòng)植物中普遍存在的一種遺傳標(biāo)記[10-12]。草魚(Ctenopharyngodonidella)是中國淡水養(yǎng)殖魚類中產(chǎn)量最大的養(yǎng)殖品種，至今仍沒有通過國家良種審定委員會(huì)鑒定的人工選育的良種。基于MyoD基因?qū)?dòng)物肌肉發(fā)育和生長的重要作用，本研究以MyoD基因作為草魚生長性狀的候選基因，通過直接測序法檢測SNP和Indel標(biāo)記，并與相關(guān)生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期獲得與草魚生長性狀相關(guān)聯(lián)的SNP和Indel標(biāo)記作為草魚分子標(biāo)記輔助選育的候選標(biāo)記，縮短育種周期，提高選擇效率。

1 材料與方法

1.1 材料

收集盡量多來源的草魚共20尾作為篩選突變位點(diǎn)的樣本，取魚的尾鰭，-20 ℃保存?zhèn)溆?。生長性狀關(guān)聯(lián)性分析的草魚樣品采自長豐縣盛源養(yǎng)殖合作社，隨機(jī)選擇同期繁殖、同塘養(yǎng)殖的3齡草魚共297尾，測量體質(zhì)量、全長、體長、體寬、體高、眼間距、尾柄長和尾柄高8項(xiàng)生長指標(biāo)，同時(shí)剪取尾鰭-20 ℃保存。

1.2 基因組DNA的提取與檢測

使用QIAamp DNA Mini Kit (北京Qiagen公司產(chǎn)品)提取基因組DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸的質(zhì)量，-20 ℃保存待用。

1.3 MyoD基因的PCR擴(kuò)增及突變位點(diǎn)基因分型

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室克隆得到的草魚MyoD基因序列(GenBank登錄號：MG544985)與草魚全基因組測序序列(http://www.ncgr.ac.cn/grasscarp/)[13]進(jìn)行比較，在5′側(cè)翼區(qū)、外顯子和內(nèi)含子上篩選多態(tài)位點(diǎn)。根據(jù)突變位點(diǎn)采用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

以不同來源的20尾草魚為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括10.0 μl 2×TaqPCR master mix、上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μl、模板DNA 20 ng，加ddH2O至20.0 μl。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 10 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，保存于4 ℃。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物純化后送至上海捷瑞生物工程有限公司測序。測序結(jié)果用軟件BioEdit進(jìn)行比對和篩選，獲得多態(tài)性高、分型穩(wěn)定的突變位點(diǎn)。采用直接測序法對297尾草魚MyoD基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行分型。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用PopGen 32軟件計(jì)算有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)，利用Picalc程序包計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)。采用SPSS 20軟件一般線性模型(General linear model，GLM)分析突變位點(diǎn)各基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)程度，因變量為草魚8項(xiàng)生長指標(biāo)，自變量為篩選到的突變位點(diǎn)的不同基因型。其生物統(tǒng)計(jì)模型為：Yij=μ+Bi+eij，其中Yij表示某性狀第i個(gè)標(biāo)記在第j個(gè)個(gè)體上的觀測值，μ表示試驗(yàn)觀測的所有個(gè)體平均值，Bi表示第i個(gè)標(biāo)記的效應(yīng)值，eij表示對應(yīng)個(gè)體觀測值的隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MyoD基因突變位點(diǎn)篩選

通過序列比對，在MyoD基因5′側(cè)翼區(qū)、外顯子和內(nèi)含子上共篩選得到6個(gè)突變位點(diǎn)，分別命名為M1(940后T堿基的插入)、M2(A1601G)、M3(1630后重復(fù)單元AATAGCCT的缺失)、M4(G1669A)、M5(A1681T)、M6(T2322G)。其中M1位于5′側(cè)翼區(qū)，M2、M3、M4和M5位于內(nèi)含子1，M6位于外顯子3。M6位點(diǎn)(T2322G)的突變沒有導(dǎo)致氨基酸的變化，屬于同義改變。

共設(shè)計(jì)3對引物在20個(gè)草魚樣本中對這6個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證(引物序列和參數(shù)見表1)，3對引物PCR 擴(kuò)增分別獲得409 bp、354 bp和245 bp片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序和比對后獲得多態(tài)性高、分型穩(wěn)定的4個(gè)位點(diǎn)，即M1、M3、M4和M5。

表1 草魚MyoD基因擴(kuò)增多態(tài)位點(diǎn)檢測引物

2.2 MyoD基因突變位點(diǎn)在草魚群體中的遺傳結(jié)構(gòu)分析

采用直接測序法對297尾草魚MyoD基因的4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，統(tǒng)計(jì)4個(gè)突變位點(diǎn)的遺傳參數(shù)。結(jié)果(表2)表明，有效等位基因數(shù)(Ne)為 1.422 0～1.978 6，觀測雜合度(Ho)為 0.268 5～0.466 4， 期望雜合度(He)為 0.297 2～0.495 4，多態(tài)信息含量(PIC)為 0.252 7～0.372 3，He和PIC均大于0.25小于0.50，說明4個(gè)突變位點(diǎn)具有中度多態(tài)性[14]。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，Hardy-Weinberg平衡常數(shù)分別為0.690 3、0.175 6、0.093 2、0.311 8，表明試驗(yàn)群體在該4個(gè)突變位點(diǎn)均處于哈溫平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表2 草魚MyoD基因SNP和Indel遺傳多樣性參數(shù)

2.3 MyoD基因突變位點(diǎn)與草魚生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

采用一般線性模型分析草魚MyoD基因4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)不同基因型與生長性狀的相關(guān)性(表3)。M1位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的體長、全長、尾柄長和尾柄高存在顯著差異(P<0.05)，純合缺失基因型(DD)顯著大于純合插入基因型(TT)，為優(yōu)勢基因型；M3和M4位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的生長性狀差異均不顯著(P>0.05)；M5位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的體質(zhì)量、體寬、體高和眼間距存在顯著差異(P<0.05)，優(yōu)勢基因型為TT。

3 討 論

本研究中，在草魚MyoD基因中共發(fā)現(xiàn)4個(gè)多態(tài)性高、分型穩(wěn)定的突變位點(diǎn)，即M1、M3、M4和M5，其中M1位于5′側(cè)翼區(qū)，M3、M4和M5位于內(nèi)含子1。位于5′側(cè)翼區(qū)的M1位點(diǎn)雖然不編碼氨基酸，但由于5′UTR在基因表達(dá)調(diào)控中有重要作用，因而其序列突變可能會(huì)對基因表達(dá)調(diào)控產(chǎn)生變化進(jìn)而影響機(jī)體的多種性狀[15-16]，在本研究中就發(fā)現(xiàn)該突變與草魚全長、體長等生長性狀有顯著相關(guān)。有研究結(jié)果表明，基因組中的突變位點(diǎn)絕大多數(shù)位于內(nèi)含子區(qū)域，而外顯子相對較保守[8,17]。本研究在草魚MyoD基因中發(fā)現(xiàn)的4個(gè)突變位點(diǎn)中就有3個(gè)位于內(nèi)含子，可能是因?yàn)閮?nèi)含子不參與氨基酸編碼，與外顯子相比其受到的選擇壓力較小，變異更容易積累[18-19]。

表3 草魚MyoD基因SNP和Indel位點(diǎn)基因型與生長性狀的相關(guān)性

相同位點(diǎn)同列數(shù)值后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

MyoD基因是生肌調(diào)節(jié)因子基因MRFs家族的主要成員之一，是脊椎動(dòng)物胚胎期肌肉發(fā)育的主導(dǎo)調(diào)控基因之一，對骨骼肌的形成和分化起主要作用，因此，MyoD基因的核苷酸變異可能會(huì)影響一些與肌肉肉質(zhì)和生長性能相關(guān)的生產(chǎn)性狀[20]。MyoD基因多態(tài)性與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)研究在畜牧領(lǐng)域中已經(jīng)有較多報(bào)道。Han等[21]研究發(fā)現(xiàn)大白豬MyoD基因的SNP位點(diǎn)g.257A>C與肌肉pH值呈顯著關(guān)聯(lián)性。田璐等[22]在肉牛上發(fā)現(xiàn)MyoD基因內(nèi)含子2中不同基因型對肉牛的宰前活質(zhì)量、胴體質(zhì)量、凈肉質(zhì)量、高檔肉質(zhì)量、眼肌面積等性狀影響極顯著或顯著。褚敏等[20]在大通耗牛MyoD1基因3′UTR的1 976 bp處發(fā)現(xiàn)1個(gè)突變位點(diǎn)，對體質(zhì)量、胸圍、體斜長方面影響顯著。李萬貴等[23]在櫻桃谷鴨MyoD基因外顯子4發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn)，突變基因型TT鴨群體顯著小于野生基因型AA群體。Chen等[24]研究發(fā)現(xiàn)MyoD1a和MyoD1b對虹鱒肉質(zhì)有重要影響。陳松波等[25]研究發(fā)現(xiàn)牙鲆MyoD基因內(nèi)含子1上的SNPs對牙鲆的生長性狀影響顯著。在本研究中，MyoD基因多態(tài)性位點(diǎn)與草魚生長性狀的相關(guān)分析結(jié)果表明，5′側(cè)翼區(qū)M1位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的體長、全長、尾柄長和尾柄高存在顯著差異(P<0.05)，純合缺失基因型(DD)顯著大于純合插入基因型(TT)；內(nèi)含子1中M5位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的體質(zhì)量、體寬、體高和眼間距存在顯著差異(P<0.05)，與這些經(jīng)濟(jì)性狀連鎖的優(yōu)勢基因型為TT。因此可以將草魚MyoD基因作為分子輔助草魚選育的候選基因，位點(diǎn)M1(940后T堿基的插入)和M5(A1681T)作為草魚分子標(biāo)記輔助育種的候選分子標(biāo)記。

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