徐小波， 章熙霞， 王公金， 譚小東， 周曉龍

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所/農(nóng)業(yè)部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014； 2.南京市畜牧家禽研究所，江蘇 南京 210036)

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂產(chǎn)生1個(gè)卵母細(xì)胞和第一極體(PbⅠ)，第二次減數(shù)分裂產(chǎn)生1個(gè)卵母細(xì)胞和第二極體(PbⅡ)，極體(Pb)排出后一般幾小時(shí)至十幾小時(shí)便退化，部分第一極體會(huì)繼續(xù)分裂為2個(gè)小極體。之前，人們認(rèn)為極體只是退化的沒(méi)有生物學(xué)功能的染色質(zhì)，很少有人對(duì)其進(jìn)行研究，直到1995年，Evsikov等[1]發(fā)現(xiàn)小鼠極體可以參與受精卵發(fā)育，從而證明了極體中的染色質(zhì)具有與卵母細(xì)胞中染色體一樣的功能。隨后，極體作為含有與卵母細(xì)胞相近遺傳物質(zhì)的特殊細(xì)胞，其生物學(xué)功能和利用價(jià)值得到人們的重新認(rèn)識(shí)與重視。有學(xué)者利用PbⅡ和PbⅠ的遺傳物質(zhì)重組卵母細(xì)胞，得到能正常繁殖的小鼠后代[2-3]。人卵母細(xì)胞PbⅠ的排出與否及其形態(tài)與卵母細(xì)胞本身的質(zhì)量和發(fā)育率有關(guān)，而與能否受精無(wú)關(guān)[4-5]。國(guó)內(nèi)科學(xué)家對(duì)極體的研究起步較晚，大多是將極體作為一種生物信號(hào)或標(biāo)記，而針對(duì)極體的生物學(xué)功能及如何保存與利用的研究報(bào)道很少。其中，蘭宗寶等[6]發(fā)現(xiàn)豬卵母細(xì)胞是否排出PbⅠ直接影響胚胎早期發(fā)育，鮑時(shí)華等[7]發(fā)現(xiàn)通過(guò)小鼠卵母細(xì)胞PbⅠ的形態(tài)可預(yù)測(cè)受精卵質(zhì)量。在人類醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐中，極體的染色體已成功應(yīng)用于人類的基因診斷，以降低遺傳缺陷的發(fā)生率[8-9]。李澎濤等[10]發(fā)現(xiàn)，PbⅠ與人卵母細(xì)胞的受精和發(fā)育能力有關(guān)，可根據(jù)PbⅠ的形態(tài)來(lái)預(yù)知卵母細(xì)胞的發(fā)育情況。谷瑞環(huán)等[11]認(rèn)為，根據(jù)受精后PbⅡ出現(xiàn)的比例可一定程度預(yù)知體外受精結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)早出現(xiàn)PbⅡ的卵母細(xì)胞質(zhì)量或質(zhì)核成熟同步化較好。劉芳等[12]也發(fā)現(xiàn)，人卵母細(xì)胞受精后3～5 h出現(xiàn)PbⅡ且 18～20 h形成2個(gè)原核的胚胎發(fā)育潛能較好。本研究擬對(duì)豬卵母細(xì)胞和受精卵在體外培養(yǎng)條件下PbⅠ和PbⅡ的排出與退化規(guī)律進(jìn)行觀察與判定，對(duì)其形態(tài)學(xué)以及不同保存條件下的活性進(jìn)行鑒定與評(píng)價(jià)，以期為極體功能的深入研究提供優(yōu)質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 豬卵巢和卵母細(xì)胞的采集

于生豬屠宰場(chǎng)挑選年齡在6月齡左右，體質(zhì)量 95～110 kg的杜長(zhǎng)大或杜大長(zhǎng)育肥豬中的未閹割母豬，摘取生產(chǎn)線上剛屠宰開(kāi)膛后溫?zé)犭伢w的豬卵巢，置于盛有生理鹽水的 28～37 ℃保溫瓶中。于2 h內(nèi)，在無(wú)菌室用注射器抽吸直徑 3～5 mm卵泡的卵泡液，在實(shí)體顯微鏡下，檢出有3層以上顆粒細(xì)胞包圍的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，轉(zhuǎn)移至平衡2 h以上的TCM-199液滴中，清洗 2～3次，進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)(5% CO2的空氣，飽和濕度，39 ℃， 24～72 h)。

1.2 極體的排出與采集

不同時(shí)間段取體外成熟培養(yǎng)的COCs，將卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞除去，每隔4 h觀察一次PbⅠ 的排出情況。精卵共孵育在改進(jìn)型Tris緩沖液(mTBM)中進(jìn)行，完成后轉(zhuǎn)入北卡萊羅納州立大學(xué)-23培養(yǎng)基中，每隔4 h觀察一次PbⅡ的排出情況。PbⅠ和PbⅡ的采集均采用顯微操作法：選擇含有 1～2級(jí)PbⅠ和PbⅡ的卵母細(xì)胞或受精卵，以顯微操作儀固定針固定卵母細(xì)胞或受精卵，用內(nèi)徑 20～25 μm的拔尖去核針刺入透明帶，伸入卵周隙，吸取PbⅠ和PbⅡ。

1.3 極體的形態(tài)學(xué)分級(jí)和活性鑒定

PbⅠ和PbⅡ的形態(tài)學(xué)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)參照Ebner等[13]的方法進(jìn)行，根據(jù)外形、胞質(zhì)均勻度、膜表面平滑度和完整度分為5個(gè)等級(jí)。

PbⅠ和PbⅡ的活性鑒定參照劉文華等[14]的方法進(jìn)行，即通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色的方法進(jìn)行鑒定，有活性的胞質(zhì)不染色，無(wú)活性的呈藍(lán)色。

1.4 極體的體外保存

本試驗(yàn)主要探討39 ℃、4 ℃、-20 ℃、-196 ℃ 4種溫度條件下Pb的保存情況。

1.4.1 常溫及低溫保存 根據(jù)形態(tài)分級(jí)選取含 1～2級(jí)PbⅠ的卵母細(xì)胞和含 1～3級(jí)PbⅡ的受精卵，放入預(yù)平衡的組織培養(yǎng)液-199(TCM-199)微滴培養(yǎng)系統(tǒng)中，分別在4 ℃及39 ℃下保存，在設(shè)定時(shí)間取部分卵母細(xì)胞或受精卵對(duì)Pb進(jìn)行活性鑒定。

1.4.2 冷凍和超低溫冷凍保存 將含有PbⅠ的卵母細(xì)胞和含有PbⅡ的受精卵裝入含乙二醇40(EG40)冷凍保護(hù)液的微管中(直徑 200～300 μm)，置于-20 ℃冰箱中冷藏或直接投入液氮(-196 ℃)中冷凍保存。在設(shè)定時(shí)間取樣，解凍并對(duì)Pb進(jìn)行活性鑒定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

卵丘擴(kuò)散率、極體排出率、保存成活率及形態(tài)學(xué)差異等數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用多重比較檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 極體的排出時(shí)間

2.1.1 PbⅠ 表1顯示，體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中卵丘細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的擴(kuò)散，培養(yǎng) 32～36 h開(kāi)始排出PbⅠ，培養(yǎng)40 h時(shí)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散率(86.8%)最高，PbⅠ排出率(66.7%)也達(dá)到最高。培養(yǎng) 40～52 h，卵丘細(xì)胞慢慢脫落，擴(kuò)散率有所降低。

2.1.2 PbⅡ 2批610枚(第一批310枚，第二批300枚)受精卵培養(yǎng)觀察結(jié)果(表2)顯示，卵母細(xì)胞受精后4 h就有少量的PbⅡ排出，16 h排出量迅速增加，20 h的排出率(49.5%)最高，24 h部分PbⅡ出現(xiàn)退化或消失，排出率開(kāi)始下降。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間PbⅠ排出率

同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

表2 受精后不同培養(yǎng)時(shí)間PbⅡ排出率

同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同排出時(shí)間極體的形態(tài)與活性

2.2.1 Pb Ⅰ 表3顯示，卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)32 h至36 h開(kāi)始有Pb Ⅰ排出，并發(fā)現(xiàn)開(kāi)始排出的Pb Ⅰ中1～2級(jí)的比例(37.5%)不是很高。培養(yǎng)40～44 h排出的Pb Ⅰ較多，其中培養(yǎng)40 h的1～2級(jí)的比例高達(dá)51.7%，3級(jí)的比例30.7%，4～5級(jí)的比例只有17.6%。培養(yǎng)44～52 h，1～2級(jí)Pb Ⅰ的比例下降，而4～5級(jí)的比例升高，到52 h時(shí)1～2級(jí)Pb Ⅰ只有14.8%。形態(tài)分級(jí)與活性鑒定結(jié)果表明，1～2級(jí)Pb Ⅰ大多具有生物活性， 3級(jí)Pb Ⅰ的活性相對(duì)較差，4～5級(jí)Pb Ⅰ基本沒(méi)有活性。

表3 不同排出時(shí)間PbⅠ形態(tài)分級(jí)

同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2.2 PbⅡ 表4顯示，受精后4～20 h排出的PbⅡ中1～2級(jí)所占比例均高于50%，受精后24 h 1～2級(jí)PbⅡ所占比例明顯下降。其中受精后16 h和20 h排出的PbⅡ1～2級(jí)的比例分別保持在50.4%和58.9%，結(jié)合前述受精后不同時(shí)間PbⅡ的排出率結(jié)果(受精后20 h排出率最高，49.5%)， 確定受精后20 h左右是豬PbⅡ最佳的采集時(shí)間?；钚澡b定結(jié)果表明，PbⅡ在形態(tài)與活性的相關(guān)性方面與PbⅠ一致。

表4 受精后不同排出時(shí)間PbⅡ的形態(tài)分級(jí)

同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同保存溫度對(duì)極體形態(tài)與活性的影響

2.3.1 PbⅠ 表5顯示，39 ℃下保存2 h，PbⅠ的形態(tài)正常且存活率較高，保存4 h時(shí)形態(tài)尚正常，但存活率顯著下降，保存6 h形態(tài)不正常，并且存活率只有18.2%。4 ℃條件保存 20～40 h，PbⅠ仍然保持良好的形態(tài)與較高的存活率，但保存60 h時(shí)，PbⅠ開(kāi)始崩解或消失(形態(tài)正常率30.5%)，完全喪失活性(存活率為0)。-20 ℃冷凍保存168 h，PbⅠ形態(tài)正常率為98.3%，存活率為95.0%。-196 ℃超低溫冷凍保存1 344 h，PbⅠ形態(tài)正常率(97.8%)和存活率(89.1%)均保持在較高水平。

表5 不同保存溫度下PbⅠ的形態(tài)與活性

同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 PbⅡ 表6顯示，受精卵中的PbⅡ在39 ℃下保存12 h仍有75.9%的存活率，保存16 h存活率顯著下降，為34.5%。4 ℃下保存30 h，PbⅡ的存活率為87.5%，保存60 h時(shí)，存活率僅有8.3%，形態(tài)正常率為25.0%。-20 ℃冷凍保存240 h，PbⅡ的存活率為84.6%，保存360 h時(shí)，PbⅡ的存活率為69.2%，保存480 h時(shí)，PbⅡ的存活率為23.1%。-196 ℃超低溫冷凍保存1 344 h后，PbⅡ的形態(tài)正常率和存活率分別為95.7%和87.0%。

3 討 論

不同哺乳動(dòng)物極體的排出時(shí)間有很大差異。小鼠注射人絨毛膜促性腺激素后12 h得到的PbⅠ數(shù)量最多[14]，與公鼠交配后24 h，PbⅡ排出率最高，達(dá)到79.7%[15]。在體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中，牛卵母細(xì)胞PbⅠ的排出高峰出現(xiàn)在16 h，排出率為37.0%，培養(yǎng)24 h時(shí)排出率達(dá)74.5%[16]。孫青原等[17]發(fā)現(xiàn)，牛受精后5 h時(shí)PbⅡ被排出。用乙醇對(duì)體外成熟培養(yǎng) 26～30 h的延邊黃牛卵母細(xì)胞進(jìn)行預(yù)激活(5～7 min)，培養(yǎng) 2～3 h后第二極體大量排出[18]。華再東等[19]發(fā)現(xiàn)，豬COCs培養(yǎng)時(shí)間不足38 h時(shí)，雖能看到極體，但激活后卵裂率極低，說(shuō)明卵母細(xì)胞并未真正成熟。本研究中，豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)36 h時(shí)出現(xiàn)PbⅠ，40 h排出率達(dá)66.7%。受精后4 h就有少量的受精卵排出PbⅡ，受精后16 h PbⅡ排出率顯著增加，20 h時(shí)達(dá)到最高。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，豬PbⅠ和PbⅡ的排出時(shí)間不同，這可能與屠宰場(chǎng)所取卵巢周期不同以及采卵所選卵泡成熟度不一致造成卵母細(xì)胞發(fā)育不同步有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

表6 不同保存溫度下PbⅡ的形態(tài)與活性

同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

人的PbⅠ排出后可存活20 h[20]，而小鼠的PbⅠ排出后僅僅存活 6～12 h[1]。劉文華等[14]將小鼠PbⅠ第二次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞在4.0 ℃、室溫和37.5 ℃下進(jìn)行保存觀察，發(fā)現(xiàn)在室溫和37.5 ℃下PbⅠ從細(xì)胞核排出后6 h完全失活，而在4.0 ℃下PbⅠ排出后12 h存活率為90%，排出后48 h存活率約為70%。39 ℃下豬極體(包括PbⅠ和PbⅡ)活性很快喪失，隨著保存溫度降低，其存活時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，在超低溫(-196.0 ℃)條件下，極體的活性保持時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，保存1 344 h的PbⅠ和PbⅡ存活率仍保持在89.1%和87.0%。說(shuō)明，降低卵母細(xì)胞極體在體外保存的環(huán)境溫度，可有效延緩極體的退化與凋亡。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)PbⅡ在39.0 ℃下的存活時(shí)間比PbⅠ長(zhǎng)，-196.0 ℃低溫冷凍保存下PbⅠ的存活率高于PbⅡ。

PbⅠ和PbⅡ遺傳物質(zhì)的全能性已被證實(shí)并得到公認(rèn)[21]。極體中胞質(zhì)很少，主要是細(xì)胞核，因此與精子一樣易于冷凍長(zhǎng)期保存。極體的冷凍保存為哺乳動(dòng)物(特別是珍稀動(dòng)物)雌性種質(zhì)資源的保存開(kāi)辟了新途徑，在豬的雌配子(卵母細(xì)胞)或受精卵的冷凍保存研究方面雖已獲得成功，但豬卵母細(xì)胞脂肪含量高，所以冷凍解凍后的成活率很低。豬極體冷凍保存的成功，繞過(guò)豬卵母細(xì)胞冷凍的困難，實(shí)現(xiàn)了豬雌配子遺傳物質(zhì)的長(zhǎng)期保存。

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