付言峰， 李 蘭， Robert V. Knox， 李碧俠， 方曉敏， 任守文

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所/動物品種改良和繁育重點實驗室/江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺， 江蘇 南京 210014; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫工程研究所， 江蘇 南京 100193; 3.美國伊利諾伊大學， 伊利諾伊 厄巴納-香檳 61801)

近些年來，隨著人們對豬肉品質(zhì)的要求越來越高，肉質(zhì)性狀也越來越被養(yǎng)豬企業(yè)所關(guān)注[1-2]，而影響豬肉質(zhì)性狀(眼肌面積、背膘后、瘦肉率、肌間脂肪含量 等)的一個關(guān)鍵因素是脂肪沉積[3]，脂肪沉積非常復(fù)雜，每一種類型的脂肪沉積都對應(yīng)一種不同的沉積過程[4-5]。另外，豬產(chǎn)仔數(shù)是一個重要的繁殖性狀和經(jīng)濟性狀[6]，而影響豬產(chǎn)仔數(shù)的一個關(guān)鍵因素是胚胎附植[7]，因為很多胚胎在這個過程中死亡[8]，而這些胚胎的死亡是導(dǎo)致產(chǎn)仔數(shù)下降的一個重要原因[9-11]。此外，豬作為一個良好的新型模式動物，在研究人類疾病(如肥胖和流產(chǎn))的過程中也發(fā)揮著重要的作用[12]。

作為一個同時影響豬肉質(zhì)性狀和繁殖性狀的基因，脂肪肥胖相關(guān)基因 (FTO)于2007年被發(fā)現(xiàn)與肥胖相關(guān)[13]，在人類和小鼠上的研究結(jié)果表明該基因在控制食欲和能量消耗方面具有重要作用[14-15]。FTO基因可以通過調(diào)控脂肪細胞成脂功能，從而調(diào)節(jié)人類肥胖的發(fā)生[16]。國外對豬FTO基因的遺傳變異與其肌內(nèi)脂肪、肌間脂肪的沉積、大理石評分、滴水損失及瘦肉率等豬肉品質(zhì)的關(guān)系研究已有零星報道[17]，國內(nèi)對豬FTO基因的遺傳變異在不同品種豬群中的多態(tài)性分布也有一些報道[18]。

除了影響脂肪代謝以外，F(xiàn)TO還影響機體的繁殖性能[19]。人和大鼠中的研究結(jié)果表明，胎盤組織中的FTO基因在子宮內(nèi)環(huán)境與胎兒生長發(fā)育之間發(fā)揮了橋梁作用[20]；在小鼠中，原位雜交和Real-time qPCR結(jié)果表明，F(xiàn)TO在胚胎組織中表達量很高[12]；在山羊中，研究發(fā)現(xiàn)妊娠第110 d時，胎盤組織中的FTO表達與胎兒體質(zhì)量有很強的相關(guān)性[21]；在荷斯坦牛中，F(xiàn)TO多態(tài)性影響乳脂量[22]。

鑒于FTO在脂肪代謝和繁殖過程中的生物學功能，本研究采用Real-time qPCR方法分析了FTO在脂肪沉積過程中的蘇山豬組織樣中的表達，F(xiàn)TO在胚胎附植過程中的梅山豬組織樣中的表達，克隆測序了蘇山豬FTO基因的全長編碼序列(CDS)，并推測了編碼序列上SNPs突變所引發(fā)的氨基酸變化。這些結(jié)果將有助于人們進一步了解FTO的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

脂肪沉積研究所用試驗動物來自江蘇洪澤鑫象豬業(yè)有限公司，選用10頭體質(zhì)量達(95±2) kg、6月齡的半同胞健康蘇山豬，分成2組，即：5頭高脂豬(活體測定背膘厚度最高的前5頭豬)和5頭低脂豬(活體測定背膘厚度最低的后5頭豬)，這些試驗豬在同一豬場進行統(tǒng)一的飼喂和管理，同時在自由采食及飲水條件下，進行疾病防治和行為體況觀察。將供試豬電昏后在同一天快速屠宰，然后用無RNase的手術(shù)器械參照屠宰程序[23]采集蘇山豬的16種組織樣(背膘、背最長肌、心、肝、脾、肺、胃、大腸、小腸、腎、膀胱、卵巢、輸卵管、子宮體、子宮頸和子宮內(nèi)膜)。上述組織樣采集后，立即用液氮冷凍保存，用于后續(xù)的RNA提取。

胚胎附植研究的試驗動物來自于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院梅山豬保種場，以3頭梅山豬母豬(第5胎次～第7胎次)為研究對象，按豬場常規(guī)條件進行飼喂和管理，同時在自由采食及飲水條件下，進行疾病防治和行為體況觀察。在同場、相同管理條件下進行單圈飼養(yǎng)，進行同期發(fā)情處理，相同種公豬精液授精妊娠。以最后一次配種為0 d計，在配種第18 d(附植中期)進行屠宰，采集全身20種組織樣(子宮體、胚胎、子宮內(nèi)膜附著點、子宮內(nèi)膜非附著點、卵巢、子宮角、大腦、下丘腦、垂體、脊髓、心、肝、脾、肺、胃、大腸、小腸、腎上腺、腎和膀胱)。 樣品采集后，立即用液氮保存。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑有TRIzol (Invitrogen, America)、AMV First Strand cDNA Synthesis Kit (BBI, Canada)、SybrGreen PCR Master Mix 2X (ABI, America)、瓊脂糖 (Biowest, Spain)、DEPC (KeyGen, China)、PremixTaq(TaKaRa, Japan)，1×TAE等緩沖液為自配，其他常規(guī)試劑為南京化學試劑有限公司生產(chǎn)。

熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(ABI, America)、凝膠成像儀 (Tanon 3500, China)、紫外分光光度儀(Shimadzu，Japan) 、超純水儀(Millipore, USA)、自動滅菌鍋(博訊 YXQ-LS-50A, China) 、高速冷凍離心機(Eppendorf, Germany)。

1.3 引物設(shè)計

豬FTO(GenBank: NM_001112692)和GAPDH(持家基因)的Real-time quantitative PCR引物均由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，其中FTO_fat deposition引物用于脂肪沉積的研究，F(xiàn)TO_embryo implantation引物用于胚胎附植的研究。引物(表1)由上海英濰捷基(Invitrogen)生物公司合成。

表1 豬FTO基因?qū)崟r熒光定量PCR分析用引物序列及反應(yīng)條件

1.4 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄成cDNA

總RNA用TRIzol/氯仿方法[24]從豬組織樣品中提取，之后用超微量紫外分光光度計 (Thermo NANODROP 2000 Spectrophotometer, 美國) 檢測提取RNA濃度，再用1.5%的瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。

RT-PCR中的RT(反轉(zhuǎn)錄),使用總RNA為模板合成cDNA第一鏈，采用“AMV First Strand cDNA Synthesis Kit”試劑盒，21 μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，分兩步進行， (1)Total RNA 5 μl, Rnase-free ddH2O 5 μl，隨機引物(10 pmol/μl)各1 μl，70 ℃溫浴5 min。(2) 冰浴10 s，離心加入下列試劑：5×Reaction Buffer 4 μl, dNTP Mix (10 mmol/L) 2 μl, Rnase inhibitor (20 U/μl) 1 μl, AMV Reverse Transcriptase (10 U/μl) 2 μl。(3) 37 ℃溫浴5 min，42 ℃溫浴60 min，70 ℃溫浴10 min。終止反應(yīng)。-20 ℃保存。

1.5 實時熒光定量PCR

為了保證樣品的可靠性，對反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA先進行預(yù)試驗。為減少干擾，每個cDNA樣本都稀釋10倍 (5 μl cDNA + 45 μl H2O)，每個樣品做3個重復(fù)，并用ddH2O 代替cDNA 模板做陰性對照，以檢測是否有外源DNA污染。

以cDNA為模板，分別定量PCR擴增基因目的片段，20 μl PCR反應(yīng)體系如下：SybrGreen qPCR Master Mix (2X) 10.0 μl, 上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μl，模板(cDNA稀釋10倍) 1.0 μl,TaqDNA Polymerase 0.3 μl, 加Rnase-free ddH2O到 20.0 μl。反應(yīng)程序如下：95 ℃ 2 min 熱啟動HotStarTaq酶活性；95 ℃溶解10 s，60 ℃煺火/延伸 40 s，循環(huán)40次；45～95 ℃，讀板時0.1 ℃/s進行溶解曲線分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實時熒光定量PCR的數(shù)據(jù)利用2-△△Ct法分析，得到FTO的mRNA 相對表達量，內(nèi)參基因為GAPDH[25-26]。不同組織間mRNA表達量的差異性顯著水平通過SAS 8.2 統(tǒng)計軟件包進行GLM分析，結(jié)果以最小二乘均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取結(jié)果

組織樣中提取的總RNA利用分光光度計測定出的OD260/OD280結(jié)果大都處于1.8～2.1，表明提取的RNA濃度和質(zhì)量都較高。隨機選取8種組織樣提取的總RNA，進行瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果顯示總RNA在凝膠上顯示出2條清晰的條帶，分別為28 S和18 S rRNA，且同一組織樣的2條帶的灰度值比值(28 S/18 S)大都處于1.0～1.5，表明總RNA基本完整，可以滿足后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和Real-time PCR試驗的要求(圖1)。

2.2 FTO在豬脂肪沉積過程中的mRNA表達

半定量PCR結(jié)果表明，F(xiàn)TO的mRNA在蘇山豬的11種組織樣中均有表達，其mRNA相對表達量(兩條帶灰度值比值FTO/GAPDH)由大到小排序為：卵巢(0.91)、 肺(0.89)、輸卵管(0.86)、 子宮內(nèi)膜 (0.83)、大腸(0.66)、子宮體(0.65)、 子宮頸 (0.64)、脾(0.57)、 膀胱(0.50)、胃(0.42)和小腸(0.04)。其中，卵巢、輸卵管、子宮內(nèi)膜等繁殖組織樣中的表達量高于其他組織樣 (圖2)。

從左至右依次為：脊髓、大腦、小腸、大腸、膀胱、心、背最長肌和脾臟。圖1 不同組織樣提取的總RNA的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig.1 Results of 1.5% agarose gel electrophoresis for total RNA extracted from different swine tissues

圖2 FTO基因在蘇山豬不同組織中的mRNA表達量Fig.2 The mRNA expression level of FTO in different tissues of Sushan pigs

定量PCR(Real-time qPCR)結(jié)果表明，F(xiàn)TO的mRNA在蘇山豬的另外5種組織樣中也均有表達，包括：背膘、心、腎、背最長肌和肝。按照mRNA表達量由大到小排序，低脂豬為：背膘(9.44)、心臟 (1.00)、腎臟 (0.92)、肝臟 (0.20)、背最長肌 (0.08)；高脂豬為：背膘 (10.59)、心臟 (0.85)、背最長肌 (0.81)、肝臟 (0.58)、腎臟 (0.51)。對2種脂肪類型豬綜合分析，背膘中的mRNA表達量最高，且極顯著高于其他任何組織(P< 0.01)；背最長肌中的mRNA表達量，高脂豬顯著大于低脂豬(P<0.05)(圖3)。FTO的表達量越高，脂肪含量越高，眼肌面積和瘦肉率越低(表2)，F(xiàn)TO的高表達似乎促進豬的脂肪沉積。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 FTO基因在蘇山豬不同組織樣中的定量PCR結(jié)果Fig.3 Quantitative PCR results of FTO in different tissues of Sushan pigs

2.3 FTO在豬胚胎附植過程中的mRNA表達

Real-time quantitative PCR結(jié)果顯示，胚胎附植中期 (妊娠第18 d)，在梅山豬15種組織樣中均檢測到FTO基因的mRNA表達，按表達量從高到低，依次為：子宮體、胚胎、下丘腦、子宮內(nèi)膜附植點、子宮內(nèi)膜非附植點、卵巢、子宮角、大腦、膀胱、脊髓、腎上腺、脾、垂體、背膘和心。在這些組織樣中，子宮體、胚胎、子宮內(nèi)膜附植點、非附植點和卵巢等繁殖組織樣中mRNA的表達量顯著高于其他組織樣(下丘腦除外) (P<0.05)，這說明胚胎附植期繁殖組織樣是FTO的主要靶組織。

另外，F(xiàn)TO在下丘腦組織中的表達量排名第三，在垂體中也有較高的表達量 (圖4)，表明,FTOmRNA的表達在胚胎附植調(diào)控中發(fā)揮一定作用，調(diào)控途徑很可能是下丘腦-垂體-性腺軸。另外，F(xiàn)TO在豬脂肪沉積過程和胚胎附植過程中所展現(xiàn)出的不同的表達趨勢，表明其作用廣泛，在機體生長發(fā)育、妊娠維持等方面均發(fā)揮著重要作用。

表2 用于FTO表達研究的蘇山豬的脂肪沉積相關(guān)肉質(zhì)性狀

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)。

圖4 胚胎附植期FTO基因在梅山豬不同組織樣中的mRNA表達Fig.4 The mRNA expression of FTO in different tissues of Meishan pigs during embryo implantation

2.4 FTO的單核苷酸突變(cSNPs)及引起的氨基酸突變

本研究使用克隆測序法，在51頭蘇山豬群中檢測了FTO編碼序列(即CDS區(qū)，范圍：15～1 532 bp)上的單核苷酸突變(cSNPs)，并對這些突變引起的氨基酸水平的突變進行了分析。結(jié)果表明，蘇山豬FTO編碼序列(GenBank: JX873956)上共發(fā)現(xiàn)10個cSNPs，依次為：G52A(FTOcDNA序列第52位的G→A突變)、A227G、C523T、C608G、G628A、A655G、A810G、A886G、G1002A和A1344G。這10個cSNPs分布于第1、第3、第4、第6、第8外顯子上，其中有8個突變引起了所編碼氨基酸的變化(表3)。

表3 蘇山豬群中檢測到的FTO基因cSNPs及其引起的氨基酸突變

2.5 FTO第3外顯子cSNPs的基因和基因型頻率

通過直接測序法，本研究檢測了51頭蘇山豬群中的FTO第3外顯子中的4個cSNPs (A227G、C523T、C608G和G628A)。結(jié)果(表4)表明，在A227G和G628A位點均檢測到3種基因型，而在C523T和C608G位點均只檢測到2種基因型?？ǚ?(χ2)檢驗結(jié)果表明，A227G、C523T和G628A位點的基因和基因型頻率均處于哈代-溫伯格平衡分布，而C608G位點則處于哈代-溫伯格不平衡分布 (P<0.01)。

表4 蘇山豬群中檢測到的FTO基因cSNPs位點的基因頻率和基因型頻率

χ2(df=2)0.01=9.21,χ2(df=2)0.05=5.99;**表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

脂肪沉積可以影響豬背膘厚、背最長肌橫截面積、瘦肉率等肉質(zhì)性狀[3]。胚胎附植可以影響豬窩產(chǎn)仔數(shù)、終生產(chǎn)仔數(shù)、母豬利用年限等繁殖性狀[27-28]。隨著定位克隆、物理作圖和候選基因等分子生物學技術(shù)的發(fā)展，研究人員已成功發(fā)現(xiàn)一些同時影響豬脂肪性狀和繁殖性狀的候選基因，如過氧化物酶體增殖物活化受體基因 (PPAR)[29-30]、瘦素受體基因 (LEPR)[31-32]和組蛋白去乙?；富?SIRT1)[33-34]等。

FTO在豬脂肪沉積過程中的mRNA表達結(jié)果表明，蘇山豬16種組織樣中均檢測到FTO的mRNA表達，且背膘中的表達量最高，并極顯著高于其他任何組織(P<0.01)，說明FTO作用廣泛，且主要在易脂肪沉積的組織中發(fā)揮作用；在背最長肌中的mRNA表達量，高脂豬顯著大于低脂豬(P<0.05)，說明FTO基因的高表達量與豬脂肪沉積量呈正相關(guān)，即FTO的高表達有利于脂肪沉積。在德國哥廷根小型豬中，研究者發(fā)現(xiàn)脂肪沉積時期，其肌肉、大腦、肝、腎和心臟中均表達FTO的mRNA，且組織間表達量差異顯著 (P<0.05)[12]。在蘇格蘭黑臉綿羊中，肥胖羊相較于普通羊，有更高的FTOmRNA表達量[35]。在蛋雞中，4～8周齡的快速生長期，垂體、下丘腦、肌肉、脂肪、睪丸等組織樣中均檢測到FTO的mRNA表達[36]。

FTO在豬胚胎附植過程中的mRNA表達結(jié)果表明，胚胎附植中期梅山豬15種組織樣中均檢測到FTO基因的mRNA表達，且繁殖組織中的表達量顯著高于其他組織(下丘腦除外)(P<0.05)，也顯著高于空懷豬。另外FTO在下丘腦中的表達量排名第三位，在垂體中也有表達，這說明FTO很可能通過下丘腦-垂體-性腺軸在豬胚胎附植調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。Bassols等發(fā)現(xiàn)，人的子宮組織中FTO的mRNA表達量顯著高于其他組織，且FTO在子宮中的高表達量與不斷增加的胎兒體質(zhì)量和長度顯著相關(guān)[37]。在大鼠中，妊娠時期肥胖的母鼠生下的斷奶仔鼠，在下丘腦和肝臟中均檢測到更高的FTOmRNA表達量[38]。 在大鼠和人中，胎盤組織中FTO的表達說明其可能是子宮內(nèi)環(huán)境和胎兒生長之間相互聯(lián)系的橋梁[20]。

FTO的cSNPs及引起的氨基酸突變分析結(jié)果表明，蘇山豬FTO編碼序列(15～1 532 bp)上共發(fā)現(xiàn)10個cSNPs突變，其中有8個直接引起了編碼氨基酸的變化，這些突變可能會進一步引發(fā)基因功能的變化[39]；另外2個cSNPs也可能通過連鎖不平衡與直接影響繁殖性狀的位點相作用，從而間接影響到氨基酸直至蛋白質(zhì)的變化[40-41]。FTO第3外顯子中的4個cSNPs在蘇山豬群中均檢測到2種以上的基因型，說明其可在蘇山豬、金華豬[18]等某些特定豬群中作為影響豬肉質(zhì)和繁殖性狀的候選基因。

綜上所述，豬FTO是一個動態(tài)表達的基因，作用廣泛，脂肪沉積時期主要在脂肪組織中表達，胚胎附植時期主要在子宮、胚胎等繁殖組織中表達，在這2個機體活動中都發(fā)揮著重要的作用。在蘇山豬群編碼序列中發(fā)現(xiàn)的8個直接引起編碼氨基酸變化的cSNPs會在分子標記選擇輔助育種中發(fā)揮重要作用。

參考文獻:

[1] 付言峰,李 蘭,周艷紅,等. 瘦素受體對蘇鐘豬脂肪沉積調(diào)控的影響 [J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報,2015, 38(6):986-992.

[2] VAN WIJK H, DIBBITS B, BARON E, et al. Identification of quantitative trait loci for carcass composition and pork quality traits in a commercial finishing cross [J]. J Anim Sci,2006, 84(4):789-799.

[3] WOOD J, ENSER M, FISHER A, et al. Fat deposition, fatty acid composition and meat quality: a review [J]. Meat Science,2008, 78(4):343-358.

[4] HAUSMAN G, POULOS S. Recruitment and differentiation of intramuscular preadipocytes in stromal-vascular cell cultures derived from neonatal pig semitendinosus muscles [J]. J Anim Sci,2004, 82(2):429-437.

[5] 付言峰,李 蘭,王學敏,等. 蘇鐘豬FTO基因的mRNA表達、克隆測序及其生物信息學分析 [J]. 華北農(nóng)學報, 2013, 28(1):128-134.

[6] FU Y, LI L, LI B, et al. Long form leptin receptor and SNP effect on reproductive traits during embryo attachment in Suzhong sows [J]. Animal Reproduction Science, 2016, 168(2):57-65.

[7] LIM W, BAE H, BAZER F W, et al. Functional roles of eph A-ephrin A1 system in endometrial luminal epithelial cells during early pregnancy [J]. Journal of Cellular Physiology,2016, 232(6):1527-1538.

[8] CARDENAS H, POPE W. Increased ovulation rate in gilts treated with dihydrotestosterone [J]. Reproduction,2002, 123(4):527-533.

[9] GEISERT R, SCHMITT R. Early embryonic survival in the pig: Can it be improved [J]. Journal of Animal Science,2002, 80(1):54-65.

[10] FU Y, FU J, YANG L, et al. Expression of Eph-Ephrin a molecules in endometrium during swine embryo implantation examined using Real-Time RT-PCR [J]. Agricultural Sciences in China,2011, 10(9):1445-1451.

[11] LIN H, WANG H, WANG Y, et al. Transcriptomic analysis of the porcine endometrium during embryo implantation[J]. Genes,2015, 6 (4):1330-1346.

[12] MADSEN M B, BIRCK M M, FREDHOLM M, et al. Expression studies of the obesity candidate geneFTOin pig [J]. Anim Biotechnol,2009, 21 (1):51-63.

[13] FRAYLING T M, TIMPSON N J, WEEDON M N, et al. A common variant in theFTOgene is associated with body mass index and predisposes to childhood and adult obesity [J]. Science,2007, 316 (5826):889-894.

[14] FISCHER J, KOCH L, EMMERLING C, et al. Inactivation of theFtogene protects from obesity [J]. Nature,2009, 458 (7240):894-898.

[15] KL?TING N, SCHLEINITZ D, RUSCHKE K, et al. Inverse relationship between obesity andFTOgene expression in visceral adipose tissue in humans [J]. Diabetologia,2008, 51 (4):641-647.

[16] LIU Y, LIU Z, SONG Y, et al. Meta-analysis added power to identify variants inFTOassociated with type 2 diabetes and obesity in the Asian population [J]. Obesity,2010, 18 (8):1619-1624.

[17] FAN B, DU Z Q, ROTHSCHILD M F. The fat mass and obesity-associated (FTO) gene is associated with intramuscular fat content and growth rate in the pig [J]. Anim Biotechnol,2009, 20 (2):58-70.

[18] 陶 新,鄧 波,門小明,等. 不同豬種肉質(zhì)相關(guān)基因Hal,RN和FTO的多態(tài)性研究 [J]. 畜牧獸醫(yī)學報,2012, 43(5):676-683.

[19] BARTON S J, MOSQUERA M, CLEAL J K, et al. Relation ofFTOgene variants to fetal growth trajectories: findings from the southampton women′s survey [J]. Placenta,2016, 38(2):100-106.

[20] MAYEUR S, CISSE O, GABORY A, et al. Placental expression of the obesity-associated geneFTOis reduced by fetal growth restriction but not by macrosomia in rats and humans [J]. J Dev Orig Health Dis,2013, 4(2):1-5.

[21] SEBERT S, HYATT M, CHAN L, et al. Influence of prenatal nutrition and obesity on tissue specific fat mass and obesity-associated (FTO) gene expression [J]. Reproduction,2010, 139(1):265-274.

[22] ZIELKE L G, BORTFELDT R H, REISSMANN M. Impact of variation at theftolocus on milk fat yield in holstein dairy cattle [J]. PLoS One,2013, 8(5):e63406.

[23] FU Y, FU J, REN Q, et al. Expression of Eph A molecules during swine embryo implantation [J]. Molecular Biology Reports,2012, 39(3):2179-2185.

[24] SAMBROOK J, RUSSELL D W. Molecular cloning: a laboratory manual [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

[25] LIVAK K, SCHMITTGEN T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-[Delta][Delta] CT method [J]. Methods,2001, 25(4):402-408.

[26] SCHMITTGEN T, LIVAK K. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method [J]. Nature Protocols,2008, 3 (6):1101-1108.

[27] 馬喜山,王愛國,傅金戀. 豬HB-EGF 基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科學,2009, 42 (1):274-282.

[28] 付言峰,王愛國,李 蘭,等. 胚胎附植期Eph-Ephirn A基因家族在豬子宮內(nèi)膜中的mRNA表達變化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報,2013, 29(1):93-100.

[29] MANDARD S, MüLLER M, KERSTEN S. Peroxisome proliferator-activated receptor a target genes[J]. Cell Mol Life Sci,2004, 61(4):393-416.

[30] WANG G, KONG L, HU P, et al. Effect of polymorphism in the peroxisome proliferator-activated receptor gamma gene on litter size of pigs [J]. Molecular Biology Reports,2011, 38(3):1807-1812.

[31] 付言峰,方曉敏,李碧俠,等. 瘦素受體表達量在蘇鐘豬脂肪沉積調(diào)控中的作用 [J]. 中國獸醫(yī)學報,2012, 32(9):1266-1271.

[32] LI Y, GENG J, WANG Y, et al. The role of leptin receptor gene polymorphisms in determining the susceptibility and prognosis of NSCLC in Chinese patients [J]. J Cancer Res Clin Oncol,2011, 138 (2):311-316.

[33] 李碧俠,趙 芳,付言峰,等. 豬卵巢顆粒細胞中SIRT1基因表達量與雌激素分泌的相關(guān)性 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報,2013, 29(3): 555-558.

[34] OH W K, CHO K B, HIEN T T, et al. Amurensin G, a potent natural SIRT1 inhibitor, rescues doxorubicin responsiveness via down-regulation of multidrug resistance [J]. Mol Pharmacol,2010, 78(5):855-864.

[35] SéBERT S, HYATT M, CHAN L, et al. Influence of prenatal nutrition and obesity on tissue specific fat mass and obesity-associated (FTO) gene expression [J]. Reproduction,2010, 139(1):265-274.

[36] TIWARI A, KRZYSIK-WALKER S, RAMACHANDRAN R. Cloning and characterization of chicken fat mass and obesity associated (Fto) gene: fasting affects Fto expression [J]. Domest Anim Endocrinol,2012, 42(1):1-10.

[37] BASSOLS J, PRATS-PUIG A, VAZQUEZ-RUIZ M, et al. Placental FTO expression relates to fetal growth [J]. Int J Obes,2010, 34(9):1365-1370.

[38] CARUSO V, CHEN H, MORRIS M J. Early hypothalamic FTO overexpression in response to maternal obesity-potential contribution to postweaning hyperphagia [J]. PLoS One,2011, 6(9):e25261.

[39] CHEN X, WANG X, LI Z, et al. Molecular cloning, tissue expression and protein structure prediction of the porcine 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductaseHMGRgene [J]. Gene,2012, 495(2):170-177.

[40] NIU B, YE L, LI F, et al. Identification of polymorphism and association analysis with reproductive traits in the porcine RNF4 gene [J]. Animal Reproduction Science,2009, 110(4):283-292.

[41] FU Y, FU J, WANG A. Association of EphA4 polymorphism with swine reproductive traits and mRNA expression of EphA4 during embryo implantation [J]. Molecular Biology Reports,2012, 39(3):2689-2696.