劉 勇， 劉 燕， 胡茂飛， 趙許朋， 楊 丹

(1.貴陽學院生物與環(huán)境工程學院，貴州 貴陽 550005； 2.中國科學院地球化學研究所環(huán)境地球化學國家重點實驗室，貴州 貴陽 550002； 3.中國科學院大學，北京 100049)

作物連作障礙是影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素[1-2]。土壤理化性質(zhì)惡化、作物根結(jié)線蟲、傳染性病害以及作物根系分泌物和殘茬分解物的化感自毒作用等均能導致連作障礙[3-7]。其中化感自毒作用(Allelopathic autotoxicity)即作物根系分泌物、莖、葉等淋溶物和殘茬腐解物(一些次生代謝產(chǎn)物)對自身細胞膜透性、酶活性及光合作用等產(chǎn)生影響，進而危害植物生長發(fā)育，而中藥材的有效成分絕大部分是次生代謝產(chǎn)物，因此中藥材育種、栽培等過程通過提高次生代謝產(chǎn)物含量，更易產(chǎn)生化感自毒作用[8-9]，研究結(jié)果表明三七、當歸、人參、黃芪、黃連等均存在化感自毒現(xiàn)象，嚴重制約了其可持續(xù)發(fā)展[10-13]。針對上述問題，中藥材連作障礙的表現(xiàn)性狀、內(nèi)在機制及應(yīng)對策略正成為該領(lǐng)域備受關(guān)注的重要方向[14-16]。

頭花蓼(PolygonumcapitatumBuch.-Ham. exD. Don)又名四季紅、石莽草等，為蓼科蓼屬多年生草本植物，是中國西南地區(qū)著名的“特色苗藥”，對治療泌尿系統(tǒng)疾病頗有療效，其中沒食子酸、黃酮類是其主要藥用成分[17-19]。頭花蓼種植面積隨著市場需求增加日趨擴大，其中貴州省目前種植面積達 1.33×103hm2以上。然而長期以來頭花蓼連作障礙問題突出，主要表現(xiàn)為出苗率低下、長勢較弱且不整齊、有效成分含量明顯降低等，嚴重影響其產(chǎn)量和藥用品質(zhì)，成為制約該產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸。目前關(guān)于頭花蓼連作障礙的報道集中在化學成分分析、連作后土壤養(yǎng)分變化分析以及不同施肥方式的調(diào)控措施，對水浸提物化感自毒的研究還不多見[20-21]。本研究通過人工制備頭花蓼根、莖、葉水浸提液，研究頭花蓼水浸提液對其種子發(fā)芽及幼苗生長的影響，為探明其連作障礙成因積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為提出治理對策提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 頭花蓼根、莖、葉水浸提液制備

2016年3月于貴州省威門藥業(yè)頭花蓼種植基地采集生長旺盛的頭花蓼植株、種子。植株清洗晾干，分根、莖、葉剪碎研磨，分別準確稱量100 g于燒杯，加入100 ml無菌蒸餾水，室溫下浸提48 h，每12 h搖晃1次，抽濾獲得1 000 mg/ml原液，稀釋分別得到5 mg/ml、 10 mg/ml 、50 mg/ml 、100 mg/ml、250 mg/ml、500 mg/ml的根、莖、葉水浸提液，冷藏備用。

1.2 種子發(fā)芽試驗

取3 000粒頭花蓼種子置于燒杯，35 ℃溫水浸泡24 h，挑選籽粒飽滿的種子放于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿(均滅菌)，每皿40顆，滴加不同浸提液5 ml至濾紙濕潤飽和，3次重復。光照12 h/黑暗12 h條件于培養(yǎng)箱(22 ℃)培養(yǎng)，每2 d加蒸餾水后1 d加對應(yīng)水浸提液補充皿內(nèi)水分，以蒸餾水(0 mg/ml)為對照，連續(xù)培養(yǎng)15 d，每日記錄種子發(fā)芽情況，測量胚根(芽)長。

1.3 幼苗生長試驗

種子發(fā)芽試驗結(jié)束后，每皿選取發(fā)芽良好的種子，去掉皿蓋繼續(xù)培養(yǎng)幼苗10 d，操作方法同方法1.2，測量幼苗根長和芽長。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/總供試種子數(shù))×100%[13]；

發(fā)芽速率=[N1+(N2-N1)/2+…+(Nt-Nt-1)/t]×100%，其中Nt為t日內(nèi)種子發(fā)芽率[22]；

發(fā)芽抑制率=(1-發(fā)芽種子數(shù)/對照組發(fā)芽種子數(shù))×100%，負值表示有促進作用，正值表示有抑制作用[23]；

發(fā)芽勢=(發(fā)芽高峰期種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%，表征種子發(fā)芽快慢及活力強弱[13]；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑[(Gt/Dt)]，Gt為第td萌發(fā)種子數(shù)，Dt為相應(yīng)種子萌發(fā)天數(shù)[24]；

種子活力指數(shù)(VI)=∑[(Gt/Dt)]×Sx，其中，Sx為種苗平均總長度[25]；

化感指數(shù)(RI)=(1-C/T)×100%，其中，C為對照組各指標平均值，T為浸提液培養(yǎng)時各指標平均值。RI>0表示有促進作用，RI<0表示有抑制作用[12]；

綜合化感指數(shù)(M)：各處理的化感效應(yīng)指數(shù)RI之和求平均值為M值，M>0表示有促進作用，M<0表示有抑制作用，絕對值大小表征作用強弱[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 頭花蓼種子發(fā)芽表觀特征

頭花蓼根、莖、葉水浸提液處理后其種子發(fā)芽數(shù)差異明顯，并出現(xiàn)種子胚根(芽)腐爛發(fā)霉、傾倒、葉片色澤暗淡等癥狀。其中，根水浸提液下種子胚芽均呈不同程度傾倒，當質(zhì)量濃度為 250～500 mg/ml時，部分種子腐爛、發(fā)霉。莖水浸提液質(zhì)量濃度≥100 mg/ml時，葉片色澤暗淡，部分胚芽傾倒，質(zhì)量濃度至250 mg/ml時胚(根)芽腐爛逐漸明顯。葉水浸提液≥100 mg/ml時部分種子發(fā)霉、胚(根)芽腐爛逐漸明顯。3種不同水浸提液質(zhì)量濃度均為5 mg/ml時其種子發(fā)芽數(shù)、日均發(fā)芽數(shù)分別高達 25.0～27.0顆、1.6～1.7顆，但水浸提液質(zhì)量濃度升高至500 mg/ml時，種子發(fā)芽數(shù)、日均發(fā)芽數(shù)分別急劇降至 3.0～5.0顆、0.2～0.3顆。3種不同水浸提液下種子發(fā)芽后葉片數(shù)雖未變化，但其胚根和胚芽長度均受到明顯抑制，隨著濃度升高長度分別僅為對照組的 1/3～1/2和 1/3～3/4(表1)。

表1 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發(fā)芽表觀特征影響

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2 頭花蓼種子發(fā)芽率及發(fā)芽速率

頭花蓼根、莖、葉水浸提液下其種子發(fā)芽率分別介于 8.3%～66.7%、9.2%～63.3%、11.7%～66.7%(P<0.05)，3種不同水浸提液質(zhì)量濃度為5 mg/ml時種子發(fā)芽率均達最高值，隨著質(zhì)量濃度升高均逐漸降至約10%(圖1)。頭花蓼根水浸提液質(zhì)量濃度為10 mg/ml時種子發(fā)芽速率達最高值0.2，葉水浸提液質(zhì)量濃度為5 mg/ml時種子發(fā)芽速率達最高值0.1，莖水浸提液下種子發(fā)芽速率均低于對照組，隨著3種不同水浸提液質(zhì)量濃度升高種子發(fā)芽速率均逐漸降至僅約為對照組的1/12(圖2)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖1 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發(fā)芽率的影響Fig.1 The effects of water extracts from different parts of P. capitatum on its seed germination rate

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖2 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發(fā)芽速率的影響Fig.2 The effects of water extracts from different parts of P. capitatum on its seed germination speed

2.3 頭花蓼種子發(fā)芽勢、發(fā)芽抑制率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)

發(fā)芽勢表征種子發(fā)芽期間活力強弱，發(fā)芽勢越大，種子活力越強，發(fā)芽越整齊[16]。由表2可知，頭花蓼根水浸提液質(zhì)量濃度10 mg/ml時種子發(fā)芽勢增大至22.5%，500 mg/ml時發(fā)芽勢驟減至0.8%，莖、葉水浸提液下隨著質(zhì)量濃度升高種子發(fā)芽勢均逐漸降至0。當根、莖、葉水浸提液質(zhì)量濃度5 mg/ml時，發(fā)芽抑制率均為負值，分別低至-11.2%、-7.7%、-13.1%，隨著質(zhì)量濃度升高均為正值且不斷增大，500 mg/ml時分別高達86.2%、84.2%、80.4%。

種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)用來綜合評估種子活力大小、發(fā)芽速度、發(fā)芽整齊度和幼苗健壯的潛勢[24-25]。由圖3、圖4可知，頭花蓼根、莖、葉水浸提液質(zhì)量濃度不同時其種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)變化規(guī)律相似，根水浸提液質(zhì)量濃度為10 mg/ml時種子發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)為最大值30.7、126.3，隨著質(zhì)量濃度升高至500 mg/ml時分別降至1.9、5.0。莖、葉水浸提液質(zhì)量濃度為5 mg/ml時種子發(fā)芽指數(shù)值分別高達23.1、23.0，活力指數(shù)值分別高達103.8、84.3，但隨著質(zhì)量濃度升高均逐漸減小，至500 mg/ml時，莖水浸提液處理的發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)分別低至0.5、1.1，葉水浸提液處理的發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)分別低至1.8、3.1。

表2 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發(fā)芽勢、發(fā)芽抑制率影響

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖3 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發(fā)芽指數(shù)的影響Fig.3 The effects of water extracts from different parts of P. capitatum on its seed germination index

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖4 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子活力指數(shù)的影響Fig.4 The effects of water extracts from different parts of P. capitatum on its seed vigor index

2.4 頭花蓼種子發(fā)芽各指標化感指數(shù)(RI)及綜合化感指數(shù)(M)

由表3可知，當根水浸提液質(zhì)量濃度低于50 mg/ml，莖、葉水浸提液質(zhì)量濃度低于5 mg/ml時各指標RI值總體為正，表明對種子發(fā)芽率、發(fā)芽速率和發(fā)芽指數(shù)均具有促進作用，其他質(zhì)量濃度時均為負值且隨著濃度升高至250 mg/ml時對種子發(fā)芽速率、發(fā)芽指數(shù)抑制作用最強，500 mg/ml處對種子發(fā)芽率抑制作用最強。觀察綜合化感指數(shù)M值，除500 mg/ml時根水浸提液對種子發(fā)芽抑制最明顯外，其余質(zhì)量濃度時莖、葉水浸提液抑制作用顯著強于根水浸提液。

2.5 頭花蓼不同部位水浸提液對其幼苗生長的影響

頭花蓼幼苗培養(yǎng)中出現(xiàn)不同程度幼苗變纖細、傾倒，根、芽發(fā)霉腐爛，葉片色澤暗淡等癥狀。其中，根水浸提液下幼苗較空白更纖細，質(zhì)量濃度至250 mg/ml時幼苗出現(xiàn)傾倒、發(fā)霉和腐爛等現(xiàn)象。莖、葉水浸提液質(zhì)量濃度≥100 mg/ml時，幼苗葉片色澤暗淡，部分幼苗傾倒，幼苗根芽腐爛逐漸明顯。由表4可知，頭花蓼根水浸提液低于100 mg/ml、莖水浸提液低于50 mg/ml、葉水浸提液低于10 mg/ml時對幼苗根長影響均較小，而隨著質(zhì)量濃度升高產(chǎn)生抑制作用， 500 mg/ml時幼苗根長分別減至對照的2/3、2/3、1/3。根、葉水浸提液對幼苗芽長均具有抑制作用，500 mg/ml時幼苗芽長分別為2.3 cm、1.9 cm，莖水浸提液為10mg/ml時幼苗芽長達最高值3.4 cm，濃度進一步升高時對幼苗芽長無顯著影響但芽長均值降低至2.2 cm，幼苗芽長整齊度下降。由表5可知，頭花蓼根水浸提液為5mg/ml 時幼苗根芽比高達0.8，顯著高于對照組，500 mg/ml時胚根芽比僅為0.3，顯著低于對照組，其他質(zhì)量濃度均無顯著差異。莖水浸提液對種子及幼苗(胚)根芽比無顯著影響。葉水浸提液為5 mg/ml時胚根芽比高達1.0，顯著高于對照組，500 mg/ml時幼苗胚根芽比僅為0.4，顯著低于對照組。

表3 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發(fā)芽化感指數(shù)(RI)的影響

表4 頭花蓼不同部位水浸提液對其幼苗生長的影響

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

表5 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

中藥材化感自毒現(xiàn)象較為普遍[27-29]。中藥材栽培中不僅要求高產(chǎn)量，同時更注重品質(zhì)，因此提高中藥材次生代謝產(chǎn)物(往往是藥用成分)含量是其栽培的目標。這些次生代謝產(chǎn)物往往屬于易揮發(fā)性或水溶性的酚類、萜類等物質(zhì)，通過自身揮發(fā)和雨水淋溶等途徑向根際環(huán)境釋放[30]。栽培中選擇不斷提高中藥材次生代謝產(chǎn)物含量，在逆境下更易向根際環(huán)境釋放和積累次生代謝產(chǎn)物，進而轉(zhuǎn)為影響中藥材栽培的化感物質(zhì)，如造成中藥材根際環(huán)境病蟲害逐年增加，根際土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)逐漸改變，破壞中藥材細胞膜結(jié)構(gòu)和抑制酶活性等，這是中藥材相比其他作物更易產(chǎn)生化感自毒作用而導致連作障礙的主要原因[31]。同時，中藥材化感物質(zhì)成分復雜且多種化感物質(zhì)共同作用往往表現(xiàn)為低濃度時促進中藥材生理代謝，很可能成為誘導種子發(fā)芽和促進幼苗生長的活性物質(zhì)，但高濃度時產(chǎn)生抑制作用，這與高濃度化感物質(zhì)造成中藥材栽培環(huán)境脅迫，反過來環(huán)境脅迫時又促使中藥材釋放和積累更多化感物質(zhì)，加劇了中藥材化感自毒作用的產(chǎn)生有關(guān)[32]。

本研究中頭花蓼根、莖、葉水浸提液對其種子發(fā)芽或幼苗生長影響具有一定“低促高抑”特征，但抑制影響更為明顯。3種不同水浸提液濃度高于10 mg/ml時逐漸出現(xiàn)種子及幼苗發(fā)霉腐爛、葉片色澤暗淡、幼苗變纖細(或傾倒)以及出苗不整齊等自毒癥狀，500 mg/ml時，種子發(fā)芽率降至10%左右，發(fā)芽速率僅為對照組的1/12，發(fā)芽抑制率達80.4%以上，發(fā)芽勢降至0.8%以下，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)僅為0.5、1.1。各指標化感指數(shù)及綜合指數(shù)均表明頭花蓼不同部位水浸提液對種子發(fā)芽或幼苗生長抑制作用總體表現(xiàn)為莖水浸提液>葉水浸提液>根水浸提液。綜上，頭花蓼根、莖、葉不同部位水浸提液具有明顯的化感自毒作用，很可能是其連作障礙的重要因素，但水浸提液化學成分中起主導作用的關(guān)鍵物質(zhì)有待進一步研究。針對實際生產(chǎn)中頭花蓼連作栽培時在“環(huán)境脅迫”下逐年累積化感物質(zhì)，連作障礙現(xiàn)象明顯，建議采取以下措施：(1)盡可能清理出收獲后土壤中頭花蓼植株、根等殘留物，避免中藥材自身各類化感物質(zhì)產(chǎn)生；(2)采用深耕翻土與烈日暴曬等相結(jié)合，可有效殺死有害微生物和減少化感物質(zhì)累積；(3)建立科學的多群體輪作、間作或套作制度進行生態(tài)調(diào)節(jié)，這也是生產(chǎn)實踐中減緩作物連作障礙影響的有效方式。

致謝： 特別感謝貴州威門藥業(yè)股份有限公司為本研究開展提供便利!

參考文獻：

[1] 張子龍，王文全. 植物連作障礙的形成機制及其調(diào)控技術(shù)研究進展[J]. 生物學雜志，2010，27(5): 69-72.

[2] 王 飛，李世貴，徐鳳花，等. 連作障礙發(fā)生機制研究進展[J]. 中國土壤與肥料，2013 (5): 7-14.

[3] 馬海燕，徐 瑾，鄭成淑，等. 非洲菊連作對土壤理化性狀與生物性狀的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2011，44(18): 3733-3740.

[4] 魏 巍，許艷麗，朱 琳，等. 長期連作對大豆根圍土壤鐮孢菌種群的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學報，2014，25(2): 497-504.

[5] 何天久,吳巧玉,曾憲浩,等. 馬鈴薯連作障礙形成機制與調(diào)控措施研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2016,44(4):1-4.

[6] EVELIN H，KAPOOR R. Arbuscular mycorrhizal symbiosis modulates antioxidant response in salt-stressedTrigonellafoenum-graecumplants[J]. Mycorrhiza，2014，24: 197-208.

[7] 張文明，岳慧珍，張春紅，等. 連作障礙不同生育期根系分泌物的成分檢測及其自毒作用[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2015，23(2): 215-224.

[8] 雷鋒杰，張愛華，張秋菊，等. 人參、西洋參化感作用研究進展[J]. 中國中藥雜志，2010，35(17): 2221-2226.

[9] YI J H，JIA Z H，LIN Q，et al. Allelopathic effects of decaying tobacco leaves on tobacco seedlings[J]. Allelopathy Journal，2012，29(1): 51-61.

[10] 張新慧，郎多勇，陳 靖，等. 蒙古黃芪植株水浸液的自毒作用研究[J]. 中藥材，2014，37(2): 187-191.

[11] 銀福軍，瞿顯友，曾 緯，等. 黃連不同部位水浸液自毒作用研究[J]. 中藥材，2009，32(3): 329-330.

[12] 張 新，郎多勇，張恩和. 當歸根際土壤水浸液的自毒作用研究及化感物質(zhì)的鑒定[J]. 中草藥，2010，41(12): 2063-2066.

[13] 張子龍，拱健婷，程新宇，等. 三七須根粉碎物土壤添加的自毒效應(yīng)研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2015，31(7): 143-148.

[14] SIRIKANTARAMAS S，YAMAZAKI M，SAITO K. Mechanisms of resistance to self-produced toxic secondary metabolites in plants[J]. Phytochemistry Reviews，2008，7(3): 467-477.

[15] 張重義，林文雄. 藥用植物的化感自毒作用與連作障礙[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2009，17(1): 189-196.

[16] MAZZOLENI S，BONANOMI G，INCERTI G，et al. Inhibitory and toxic effects of extracellular self-DNA in litter: a mechanism for negative plant-soil feedbacks?[J]. New Phytologist，2015，205(3): 1195-1210.

[17] 張麗娟，王永林，王 珍，等. 頭花蓼活性組分化學成分研究[J]. 中藥材，2012，35(9): 1425-1428.

[18] 朱曉雨，張 犁，姜 瑩，等. 頭花蓼水提液對感染性結(jié)石模型大鼠尿液酸化作用的實驗觀察[J]. 新中醫(yī)，2014，46(4): 200-202.

[19] 潘 梅，唐靖雯，陳 真，等. 熱淋清顆粒的一般藥理學研究[J]. 藥學研究，2015，34(4): 187-189.

[20] 周 濤，金艷蕾，吳 鈺，等. 貴州頭花蓼遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 中國中藥雜志，2010，35(12): 1511-1517.

[21] 何佳芳，唐 兵，趙 歡，等. 幾種肥料對頭花蓼連作障礙的調(diào)控[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報，2016，29(12): 2902-2906.

[22] CHIAPUSIO G, SNCHEZ A M, REIGOSA M J, et al. Do germination indices adequately reflect allelochemical effects on the germination process?[J]. Journal of Chemical Ecology, 1997, 23(11): 2445-2453.

[23] 楊 驍. 加拿大蓬水浸液對植物種子萌發(fā)的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40(4): 1983-1986.

[24] 杜 瑋，何池全，陳玉麗，等. 入侵植物互花米草水浸液對萵苣的化感作用[J]. 環(huán)境科學學報，2009，29(4): 869-875.

[25] 趙欣欣，宋麗榮，權(quán)薇竹，等. 高溫高濕老化處理對不同豆類種子活力及生長能力的影響[J]. 作物雜志，2017(5): 168-172.

[26] 朱 慧，馬瑞君，吳雙桃，等. 當歸根際土對其種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J]. 生態(tài)學雜志，2009，28(5): 833-838.

[27] 邱立友，戚元成，王明道，等. 植物次生代謝物的自毒作用及其與連作障礙的關(guān)系[J]. 土壤，2010，42(1): 1-7.

[28] 吳紅淼，吳林坤，王娟英，等. 根際調(diào)控在緩解連作障礙和提高土壤質(zhì)量中的作用和機理[J]. 生態(tài)科學，2016，35(5): 225-232.

[29] 李明杰，馮法節(jié)，張 寶，等. 多元組學背景下地黃連作障礙形成的分子機制研究進展[J]. 中國中藥雜志，2017，42(3): 413-419.

[30] 張秋菊，張愛華，孫晶波，等. 植物體中萜類物質(zhì)化感作用的研究進展[J]. 生態(tài)環(huán)境學報，2012，21(1): 187-193.

[31] 陳愛國，李明杰，張 寶，等. 連作介導的藥用植物及其根際微生態(tài)災(zāi)變機制研究展望[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2016，18(2): 239.

[32] 張 琳，王 曉，史國玉，等. 中藥連作障礙形成及其時空效應(yīng)理論探討[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐，2014，28(5): 80-85.