李 燕 白立煒 王 濤 曹 萌 翟倩倩

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，新鄉(xiāng) 453100)

糖尿病是由多種因素引發(fā)的復(fù)雜的慢性疾病，且伴有多種并發(fā)癥。糖尿病患者容易出現(xiàn)高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血脂異常、心肌梗死、中風(fēng)、眼病、腎病及神經(jīng)性疾病等癥狀。隨著生活現(xiàn)代化程度的加大，越來(lái)越多的人正遭受糖尿病的折磨，1980年美國(guó)患糖尿病的人數(shù)為560萬(wàn)，2011年就增加到了2 090萬(wàn)，且糖尿病的發(fā)生帶來(lái)了巨大的財(cái)政負(fù)擔(dān)[1]。中國(guó)糖尿病的發(fā)病率從1980年的0.9%上升到2010年的11.6%，2013年中國(guó)糖尿病患者占全球糖尿病患者的四分之一，且有將近50.1%的人患有前驅(qū)糖尿病[2]。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟估計(jì)糖尿病的患病數(shù)將從2011年的3.66億增加到2030年的5.52億[3]。糖尿病治療是醫(yī)療健康事業(yè)的重大課題。白藜蘆醇是一種天然的多酚類(lèi)物質(zhì)，可從多種植物中提取[4]。白藜蘆醇在新陳代謝及心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病及癌癥中具有重要的保護(hù)作用[5-8]。本文主要研究在高糖高脂喂養(yǎng)下鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，白藜蘆醇對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及主要試劑 40只8周齡成熟雄性清潔級(jí)大鼠購(gòu)自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。白藜蘆醇和STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。Masson 三色染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、B淋巴瘤2蛋白(B cell lymphoma 2,Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)蛋白X (Bcl-2-associated X protein,Bax)及PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1糖尿病大鼠模型的建立及藥物處理 40只大鼠隨機(jī)平均分為4組，分別為對(duì)照組(n=10)、對(duì)照+白藜蘆醇組(n=10)； STZ誘導(dǎo)的糖尿病組(n=10)、STZ+白藜蘆醇組(n=10)。STZ誘導(dǎo)的糖尿病組和STZ+白藜蘆醇組用高糖高脂飼料和小劑量腹腔多次連續(xù)注射STZ，連續(xù)5 d，每次60 mg/kg，從尾靜脈采集全血分析血糖水平。若血糖水平連續(xù)3 d 超過(guò)12 mmol/L則判定為糖尿病。對(duì)照組給同等體積檸檬酸鹽緩沖液。在大鼠確診為糖尿病后，白藜蘆醇組立即給予白藜蘆醇灌胃[10 mg/(kg·d)]，并開(kāi)始從1計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)天數(shù)，對(duì)照組和糖尿病組同期均接受同等體積蒸餾水灌胃處理，持續(xù)到第9周時(shí)，每組小鼠應(yīng)用頸椎脫臼法處死，取上腔靜脈血液。

1.2.2實(shí)時(shí)定量PCR (Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) RNA提取試劑盒提取血清中總RNA后反轉(zhuǎn)成cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。MCP-1上游引物：GCTCGCTCAGCCAGATGCAAT，MCP-1下游引物：TGGGTTGTGGAGTGAGTGTTC。MIF上游引物：GGCCTCACTT-ACCTGCACC，MIF下游引物：ACCATTTATTTCT-CCCGACC。IL-18上游引物：ATATCGACCGAACAGCCAAC，IL-18下游引物：TGGCACACGTTTCTG-AAAGA。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR，用公式2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3蘇木素伊紅(HE)染色和Masson染色 白藜蘆醇處理9周后，頸椎脫臼法處死大鼠后取左心室心肌組織用多聚甲醛進(jìn)行固定，經(jīng)脫水石蠟包埋后進(jìn)行切片(4 μm)。切片脫蠟至水后按照蘇木素伊紅(HE)染色液說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蘇木素伊紅(HE)染色。光鏡下觀察心肌纖維化情況。為了進(jìn)行Masson染色，首先將切片(4 μm)脫蠟至水，然后按照Masson 三色染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，鏡下觀察并拍照。細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿、肌肉、紅細(xì)胞呈紅色，膠原纖維/蛋白呈藍(lán)色。

1.2.4血管平滑肌細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)及藥物處理 首先取出對(duì)照組和STZ誘導(dǎo)的糖尿病組主動(dòng)脈放入裝有無(wú)菌的D-Hank′s液培養(yǎng)皿中進(jìn)行洗滌。體式顯微鏡下去除血管外膜，縱向切開(kāi)血管壁，刮除內(nèi)膜留下中膜，去除中膜外組織雜質(zhì)。然后將剝離出來(lái)的中膜放入DMEM培養(yǎng)基并剪碎，離心去上清，取沉淀加入0.5%EDTA鈉鹽消化30 s，加入DMEM培養(yǎng)基終止消化。最后離心棄上清并用新鮮培養(yǎng)基重懸，再移入培養(yǎng)瓶中貼附于底面。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h后，組織塊貼壁后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液使組織塊全部浸沒(méi)在培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)8～12 d后觀察，當(dāng)80%細(xì)胞已融合后便可進(jìn)行細(xì)胞傳代。取生長(zhǎng)良好的對(duì)照組和STZ誘導(dǎo)的糖尿病組血管平滑肌細(xì)胞分別接種于96孔板中培養(yǎng)24 h后，分為對(duì)照組、對(duì)照+白藜蘆醇組、STZ誘導(dǎo)的糖尿病組、STZ+白藜蘆醇組。對(duì)照+白藜蘆醇組和STZ+白藜蘆醇組添加50 μmol/L的白藜蘆醇；對(duì)照組和STZ誘導(dǎo)的糖尿病組添加等量的無(wú)菌水。處理24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 收集各組血管平滑肌細(xì)胞，用1×Binding buffer將細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml的懸液。用Annexin V-fluorescein isothiocyan-ate(FITC)，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色15 min后利用流式細(xì)胞儀對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6蛋白印跡 首先收集各組血管平滑肌細(xì)胞，PBS洗3次后加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取。然后等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%的BSA進(jìn)行封閉后依次孵育相應(yīng)的一抗和二抗。最后進(jìn)行顯色，并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為存在明顯差異。

2 結(jié)果

2.1白藜蘆醇在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中對(duì)血清細(xì)胞因子的影響 利用qRT-PCR檢測(cè)糖尿病大鼠血清中細(xì)胞因子MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平。如圖1A～C所示，與對(duì)照組相比，STZ誘導(dǎo)糖尿病組大鼠血清中MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平明顯升高(P<0.05)。對(duì)照組與對(duì)照+白藜蘆醇組的MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平無(wú)明顯差異。與STZ誘導(dǎo)糖尿病組相比，STZ+白藜蘆醇組血清中MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平明顯降低(P<0.05)。上述數(shù)據(jù)表明，白藜蘆醇可抑制STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中細(xì)胞因子MCP-1、MIF和IL-18表達(dá)。

2.2白藜蘆醇在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中對(duì)心肌纖維化的影響 通過(guò)HE染色和Masson染色觀察心肌組織纖維化情況，如圖2所示，對(duì)照組與對(duì)照+白藜蘆醇組藍(lán)色膠原纖維很少，排列規(guī)則；STZ誘導(dǎo)糖尿病組大鼠心肌組織藍(lán)色膠原纖維含量明顯增多且排列紊亂，STZ+白藜蘆醇組心肌組織藍(lán)色膠原纖維減少，排列趨于規(guī)則。上述結(jié)果表明，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，白藜蘆醇具有抗心肌纖維化的作用。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)血清中細(xì)胞因子的mRNA水平Fig.1 mRNA levels of serum cytokines were detected by qRT-PCRNote: *.P<0.05,#.P<0.05.

2.3白藜蘆醇對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目的影響 倒置顯微鏡下觀察從主動(dòng)脈中分離出的血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目。如圖3A所示，白藜蘆醇可改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)的異常。圖3B顯示，STZ誘導(dǎo)糖尿病組大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞數(shù)目明顯少于對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)照組與對(duì)照+白藜蘆醇組血管平滑肌細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯差異。與STZ誘導(dǎo)糖尿病組相比，STZ+白藜蘆醇組大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.05)。由此可見(jiàn)，白藜蘆醇可改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目的異常。

圖2 HE和Masson染色分析心肌纖維化水平(×100)Fig.2 Myocardial fibrosis was analyzed by hematoxylin-eosin (HE) staining and Masson staining(×100)

圖3 白藜蘆醇對(duì)主動(dòng)脈的血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目的影響Fig.3 Effect of resveratrol on cell morphology and number of vascular smooth muscle cells of aortaNote: *.P<0.05,#.P<0.05.

2.4白藜蘆醇對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響 運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細(xì)胞凋亡情況。圖4A顯示，STZ誘導(dǎo)糖尿病組細(xì)胞凋亡數(shù)最多，STZ+白藜蘆醇組次之，對(duì)照組與對(duì)照+白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡數(shù)最少。由圖4B可知，STZ誘導(dǎo)糖尿病組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組與對(duì)照+白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化。STZ+白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率明顯低于STZ誘導(dǎo)糖尿病組(P<0.05)。由此可見(jiàn)，白藜蘆醇可抑制STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡。

2.5白藜蘆醇對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響 為分析白藜蘆醇對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響，蛋白印跡檢測(cè)Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax和Bcl-2的表達(dá)。圖5A顯示，在STZ誘導(dǎo)糖尿病組Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax的表達(dá)水平高于其他三組，Bcl-2的表達(dá)則低于其他三組。統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，如圖5B所示，STZ誘導(dǎo)糖尿病組Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，Bcl-2的表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組與對(duì)照+白藜蘆醇組Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax和Bcl-2的表達(dá)無(wú)明顯差異。與STZ誘導(dǎo)糖尿病組相比，STZ+白藜蘆醇組Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax表達(dá)明顯降低，Bcl-2的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，白藜蘆醇可抑制STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細(xì)胞凋亡。

2.6白藜蘆醇對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 通過(guò)蛋白印跡分析平滑肌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的蛋白水平。圖6A顯示，PI3K和AKT在各組細(xì)胞中的蛋白水平無(wú)明顯變化，p-PI3K和 p-AKT在STZ誘導(dǎo)糖尿病組中的表達(dá)量最低。如圖6B、C所示，STZ誘導(dǎo)糖尿病組中p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組與對(duì)照+白藜蘆醇組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比率無(wú)明顯差異。與STZ誘導(dǎo)糖尿病組相比，STZ+白藜蘆醇組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比率明顯升高(P<0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細(xì)胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比率下降，白藜蘆醇處理可抑制p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比率的下降，激活PI3K/AKT信號(hào)通路。

圖4 白藜蘆醇對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of resveratrol on apoptosis of vascular smooth muscle cellsNote: *.P<0.05,#.P<0.05.

圖5 白藜蘆醇對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of resveratrol on expression of apoptosis related proteins in vascular smooth muscle cellsNote: *.P<0.05,#.P<0.05.

圖6 白藜蘆醇對(duì)血管平滑肌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of resveratrol on expression of PI3K/Akt related proteins in vascular smooth muscle cellsNote: *.P<0.05,#.P<0.05.

3 討論

糖尿病主要包括1型糖尿病和2型糖尿病，2型糖尿病約占95%。目前同時(shí)治療1型糖尿病和2型糖尿病的藥物主要為胰島素類(lèi)似物和普蘭林肽，針對(duì)2型糖尿病的治療藥物主要包括：二甲雙胍、磺酰脲類(lèi)藥物、氯茴苯酸類(lèi)藥物、噻唑烷二酮類(lèi)藥物、胰高血糖素樣肽1、二肽基肽酶4、鈉依賴(lài)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2及溴麥角環(huán)肽等[9,10]。這些藥物大多數(shù)都為化學(xué)合成，副作用較大。尋找天然安全的藥物對(duì)糖尿病的治療具有重要意義。越來(lái)越多的研究表明許多植物提取物在各類(lèi)疾病的治療中起著積極作用。

在各類(lèi)疾病的進(jìn)程中常常伴有各類(lèi)細(xì)胞因子的變化，許多植物提取物可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞因子的變化。有研究顯示白藜蘆醇可減弱草酸誘導(dǎo)的人原發(fā)性腎上皮細(xì)胞MCP-1 mRMA水平的升高[11]。Zagotta等[12]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可降低發(fā)炎的脂肪組織中MCP-1 mRMA的水平。據(jù)報(bào)道臥莖景天提取物可抑制馬兜鈴酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷模型中MIF的表達(dá)[13]。有文獻(xiàn)報(bào)道在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型中，白藜蘆醇可抑制IL-18 mRMA水平的升高[14]。Xiao等[15]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可抑制糖尿病缺血性急性腎損傷大鼠模型中IL-18 mRMA水平的升高。本研究表明，白藜蘆醇可抑制STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血清中MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平的升高。

糖尿病患者常會(huì)發(fā)生各種并發(fā)癥，心肌纖維化加劇在這個(gè)過(guò)程中起著重要作用。許多植物提取物可改善心肌纖維化病變。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注大鼠模型中芪參益氣滴丸可改善心肌纖維化紊亂。有文獻(xiàn)報(bào)道參芪化合物可降低糖尿病大鼠心肌纖維化水平[17]。有研究表明山楂果提取物可減輕肥胖癥大鼠心肌纖維化程度[18]。據(jù)報(bào)道隱丹參醌可降低1型糖尿病大鼠模型中心肌纖維化程度[19]。Dong等[20]發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷大鼠模型中，白藜蘆醇處理可改善心肌纖維紊亂。本研究結(jié)果顯示，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，白藜蘆醇可改善心肌纖維化加劇。

白藜蘆醇還具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用。Sui等[21]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可抑制H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)細(xì)胞凋亡。有研究表明白藜蘆醇可抑制丙酮醛誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡，減弱Cleaved caspase-3表達(dá)的升高[22]。據(jù)報(bào)道白藜蘆醇可抑制β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減弱Bax表達(dá)的升高[23]。有數(shù)據(jù)顯示白藜蘆醇可降低高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，減弱Bax的表達(dá)，提高Bcl-2表達(dá)[24]。本文結(jié)果表明，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，白藜蘆醇可抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡及凋亡標(biāo)記蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和Bax表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)。

PI3K/AKT信號(hào)通路在各類(lèi)疾病中都發(fā)揮著重要作用。大量文獻(xiàn)報(bào)道植物提取物可影響PI3K/AKT信號(hào)通路的活化。Ren等[25]發(fā)現(xiàn)從桑葉中提取的多糖可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路使高脂喂養(yǎng)STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠肝葡萄糖代謝及胰島素轉(zhuǎn)運(yùn)正?；Ｓ醒芯堪l(fā)現(xiàn)在高脂喂養(yǎng)STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠中，決明子可提高AKT磷酸化水平，減輕心肌缺血再灌注損傷[26]。Liu等[27]研究表明在糖尿病大鼠模型中柑橘果膠可通過(guò)上調(diào)p-AKT表達(dá)激活PI3K/AKT信號(hào)通路起到抗糖尿病的作用。據(jù)報(bào)道在早期腦損傷大鼠模型中，白藜蘆醇可提高AKT磷酸化水平，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[28]。有數(shù)據(jù)顯示白藜蘆醇可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路提高高糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡[29]。Wu等[30]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路減輕糖尿病性心肌病變大鼠模型中心肌細(xì)胞的纖維化，抑制心肌細(xì)胞凋亡。本文結(jié)果顯示，白藜蘆醇可提高STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中血管平滑肌細(xì)胞PI3K和Akt的磷酸化水平，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡。

本研究表明，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，白藜蘆醇可抑制血清中細(xì)胞因子MCP-1、MIF和IL-18的mRNA水平的升高；改善心肌纖維化的加劇；減弱血管平滑肌細(xì)胞凋亡及凋亡標(biāo)記蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和Bax表達(dá)，提高Bcl-2表達(dá)；提高血管平滑肌細(xì)胞PI3K和AKT的磷酸化水平。綜上所述，白藜蘆醇可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路起到抑制糖尿病平滑肌細(xì)胞凋亡的作用。下一步計(jì)劃研究白藜蘆醇對(duì)眼病、腎病及神經(jīng)性疾病等糖尿病并發(fā)癥的影響，為開(kāi)發(fā)糖尿病新藥提供理論依據(jù)。

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