王英杰 王 晶 石 鑫

(承德醫(yī)學(xué)院，承德 067000)

骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種骨髓來源的多功能細胞，具有很強的自我更新和多方向分化的能力；能夠在內(nèi)環(huán)境的作用下遷移至受到損傷的組織部位，對組織的結(jié)構(gòu)和(或)功能進行修復(fù)；并且具有較強的免疫調(diào)節(jié)功能，進行異體移植時可避免免疫排斥反應(yīng)[1]。因此，BMSCs在臨床多種疾病治療中的應(yīng)用得到了很大的重視。

現(xiàn)階段的研究顯示，創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)后，預(yù)防神經(jīng)細胞的死亡是挽救腦創(chuàng)傷患者最直接最有效的手段[2]。當(dāng)TBI發(fā)生后，創(chuàng)傷性的主要作用位置就在大腦的海馬區(qū)，無論是原發(fā)性的創(chuàng)傷，還是出現(xiàn)繼發(fā)性的創(chuàng)傷，這些都是左右海馬區(qū)正常工作的主要誘因[3]。自噬(Autophagy)為所有真核細胞內(nèi)最為普遍的生理表現(xiàn)，是保證機體內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定的狀態(tài)[4]。有研究表明抑制自噬具有減輕TBI和提高神經(jīng)功能恢復(fù)的作用[5]。本實驗通過建立大鼠腦損傷模型，并使用BMSCs進行治療，檢測動物行為學(xué)的變化[6]，以及自噬相關(guān)蛋白的表達，研究BMSCs在不同時間的移植對大鼠腦損傷治療效果的影響，為BMSCs在臨床上治療腦損傷提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物 BMSCs的供體動物：SPF級幼年雄性SD大鼠6只，3～5周齡，體重90～110 g。BMSCs的受體動物：SPF級成年雌性SD大鼠90只，體重180～220 g，均購自于北京維通利華動物公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分離及培養(yǎng) 使用乙醚麻醉大鼠，然后脫頸處死大鼠，在無菌的條件下將股骨和脛骨分離，暴露骨髓腔。用DMEM高糖培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，并收集沖洗液，1 000 r/min低溫離心10 min后棄去上清液，用10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞。計數(shù)后按1×106cm-2密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后進行第一次換液，第二次以后換液間隔2～3 d 1次。待細胞95%融合時，使用0.25%胰酶消化，按1∶2的比例進行傳代，細胞傳至第3代用于實驗[7]。

1.2.2實驗動物與分組 SPF級健康成年雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g。在實驗前讓大鼠自由進食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將50只SD雌性大鼠隨機分為5組，每組10只：對照組、腦創(chuàng)傷模型組、早期治療組、中期治療組、晚期治療組。治療組分別在造模成功后的1 d、28 d、56 d 經(jīng)尾靜脈注射BMSCs與DMEM懸液1.0 ml(1×106ml-1)，對照組以及模型組給予等劑量的生理鹽水。

1.2.3腦組織形態(tài)學(xué)檢測 大鼠采取腹腔麻醉法，使用10%水合氯醛，按照0.3 ml/100 g的劑量對大鼠進行麻醉，麻醉后將大鼠斷頭，分離腦組織，于視交叉后1和6 mm的位置冠狀面切開修整組織塊，最后剩下大鼠腦的海馬位置，在4%多聚甲醛固定液中固定48 h，按照梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片。進行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照留圖。

1.2.4Morris水迷宮測試 對照組、模型組、早、中、晚期治療組大鼠分別于傷后6、7、8、9 d進行水迷宮測試。檢測時，把安全島采取隨機的方式放到水迷宮四個象限(N、S、E、W)中的一個象限中，加水，高過安全島1 cm，水的溫度維持在22℃～24℃，攝像機及計算機會自動追蹤大鼠的活動路線，以及尋找時間。180 s內(nèi)仍沒找到安全島，則潛伏期時間為180 s。

1.2.5免疫印跡法檢測LC-3和Beclin-1的表達量 將所獲取的大鼠腦海馬組織從-80℃超低溫冰箱中取出，然后將腦組織剪碎，按照100 mg/ml的比例加入裂解液，12 000 r/min低溫離心15 min，然后凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。5% 脫脂奶粉37℃ 封閉 1.5 h，一抗孵育，并在4℃環(huán)境下過夜，第二日二抗孵育2 h。用ECL顯色液進行曝光，使用Image J軟件進行分析，以β-actin作為內(nèi)參進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 原代BMSCs在48 h之內(nèi)貼壁，以分散的克隆聚集方式增殖，細胞形態(tài)基本為均勻星形或梭形，核居中，偶有寬大扁平的多邊形細胞。經(jīng)過BMSCs純化，其他非貼壁細胞，通過換液逐漸減少。2 周后原代細胞 95% 融合，進行傳代。傳代后細胞呈現(xiàn)漩渦狀和放射狀集落生長傾向，隨著傳代次數(shù)增加，細胞形態(tài)更為均一，為梭形成纖維細胞樣。見圖1。

2.2HE染色組織形態(tài)學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示，在對照組中腦的組織結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變，血管的管腔中沒有發(fā)現(xiàn)異常，血管的管壁平整，神經(jīng)細胞形態(tài)規(guī)則；在創(chuàng)傷后，模型組神經(jīng)元細胞胞體出現(xiàn)形狀的改變，胞漿染色降低，細胞核出現(xiàn)深度染色，能夠看到在細胞之間出現(xiàn)了明顯的間隙，并且伴有壞死的神經(jīng)元細胞出現(xiàn)，早、中期治療組與模型組比較病理改變明顯減輕，晚期治療組沒有減輕，有加重趨勢。見圖2。

圖1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察(× 200)Fig.1 Morphological observation of BMSC(× 200)Note: A.95% BMSCs；B.Primary cells；C.The third passage BMSCs.

2.3Morris水迷宮結(jié)果 因為在腦創(chuàng)傷后，大鼠的運動能力會受到一定的影響，所以設(shè)置的實驗時間在每組創(chuàng)傷后的第6、7、8以及9天進行Morris水迷宮檢測。實驗結(jié)果顯示，模型組在傷后第8天和第9天搜索安全島潛伏期明顯要比對照組時間增加。早、中期治療組在傷后第8天以及第9天搜索安全島潛伏期要比對照組有顯著的縮短，說明大鼠的記憶功能得到了一定的恢復(fù)，晚期治療組搜索安全島潛伏期與模型組差異不明顯。見圖3、4和表1。

圖2 各組HE結(jié)果(×200)Fig.2 Each group of HE results(× 200)Note: A.Control group;B.Model group;C.Early treatment group；D.Middle treatment group;E.Late treatment group.

2.4LC-3和Beclin-1的Western blot檢測結(jié)果 LC-3結(jié)果顯示出深淺不同的雙條帶LC-3Ⅰ和LC-3Ⅱ。對照組LC-3和Beclin-1蛋白有微量基礎(chǔ)表達。與對照組相比較，模型組LC-3和Beclin-1蛋白的表達有顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，早、中期治療組蛋白表達明顯減弱(P<0.05)，但仍高于對照組表達量，晚期治療組與模型組相比較蛋白的表達沒有明顯的差異。見圖5、6。

圖3 各組水迷宮運動軌跡Fig.3 Moving track of control group in Morris water mazeNote: A.6 d;B.7 d;C.8 d;D.9 d.

表1水迷宮運動變化數(shù)據(jù)

Tab.1Movementdataofwatermaze

GroupsTime6 d7 d8 d9 dControl group15.455 6±3.125 313.465 4±3.606 510.321 2±1.512 17.634 1±1.456 3Model group167.357 9±3.102 7131.764 3±4.262 799.256 7±3.423 51)67.792 2±2.897 51)Early treatment group106.881 9±5.122 091.074 3±4.421 953.563 3±3.784 92)31.432 3±1.516 12)Middle treatment group110.778 5±4.564 186.264 8±3.987 457.126 8±3.058 92)27.985 1±2.013 72)Late treatment group159.657 8±4.569 7125.231 4±4.235 890.236 8±3.289 52)60.157 6±3.046 82)

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs model group.

圖4 各組水迷宮比較Fig.4 Comparison of delitescence in water maze among groups after injuryNote: *.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs model group.

圖5 各組LC-3的蛋白表達Fig.5 Protein expression of LC-3 in each groupNote: Model group vs control group,#.P<0.05;early treatment and middle treatment group vs model group,*.P<0.05.

圖6 各組Beclin-1的蛋白表達Fig.6 Protein expression of Beclin-1 in each groupNote: Model group vs control group,#.P<0.05;early treatment and middle treatment group vs model group,*.P<0.05 .

3 討論

BMSCs是一種來源于骨髓的多功能細胞，具有很強的自我更新和多方向分化的能力，能夠在內(nèi)環(huán)境的作用下遷移到受損傷的組織位置，對組織的結(jié)構(gòu)和功能進行修復(fù)；并且擁有較強的免疫調(diào)節(jié)功能，進行異體移植時能夠避免免疫排斥反應(yīng)[8]。所以，BMSCs在臨床許多疾病的治療中都發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。大量研究證實，BMSCs在心臟、肝臟、肺、腎臟等多個組織器官的損傷中發(fā)揮著重要的治療作用。在心肌梗塞、缺血性心臟病等心臟損傷模型中，發(fā)現(xiàn)BMSCs可以促進心肌細胞再生、增加新生血管的形成，進而促進損傷的修復(fù)[9]。LC-3：微管相關(guān)蛋白輕鏈3(Microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)，是酵母ATG8的同系物，細胞自噬體膜通用標記物，其有兩種分子存在形式，即LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ，其中LC3-Ⅱ是自噬體形成的關(guān)鍵分子被廣泛用作檢測哺乳動物中的自噬活性，LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ的比值與自噬體的多少有直接關(guān)系[10]。通過免疫蛋白印跡的實驗方法能夠看到LC-3蛋白的表達可以形成深淺的雙條帶，即LC-3Ⅰ及LC-3Ⅱ。在正常的細胞里，LC-3Ⅰ和 LC-3Ⅱ都能夠被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)自噬被激活的狀態(tài)下，LC-3Ⅱ的蛋白表達會出現(xiàn)升高的趨勢。這些促使自噬體的進一步形成。所以LC-3Ⅱ的蛋白表達情況就能夠視為自噬是否被激活的標準[11]。

Beclin-1作為自噬的相關(guān)基因同樣也是哺乳動物中酵母Apg6/Vps30的同系產(chǎn)物，是自噬的相關(guān)因子中的重要組成之一，Beclin-1的表達也被用于檢測自噬的活性[12]。Beclin-1和磷酸肌醇3激酶(Vps34)相互作用，是吞噬小體形成的關(guān)鍵因素[13]。

本實驗的實驗結(jié)果顯示：HE染色結(jié)果，模型組神經(jīng)元細胞胞體發(fā)生明顯改變，胞漿染色降低，細胞核出現(xiàn)深度染色，并且伴有壞死的神經(jīng)元細胞出現(xiàn)，早、中期治療組同模型組比較病理可以看到有明顯的減輕，晚期治療組并不明顯，這說明在一定程度上BMSCs的早、中期治療對大鼠腦創(chuàng)傷后的恢復(fù)起到了一定的作用；Morris水迷宮結(jié)果顯示，在腦創(chuàng)傷后，模型組在搜索安全島所用的時間明顯比對照組時間多，早、中期治療組的搜索時間要比模型組有了明顯的好轉(zhuǎn)，晚期治療組效果不明顯，這說明大鼠腦創(chuàng)傷后通過早、中期的BMSCs治療，大鼠的空間記憶功能有了一定程度的改善；Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組LC-3和Beclin-1蛋白表達出現(xiàn)了顯著升高，與模型組相比，早、中期治療組蛋白表達明顯減弱，而晚期治療組與模型組相比較蛋白的表達沒有明顯的差異，這進一步說明大鼠腦創(chuàng)傷后通過早、中期的BMSCs治療對大鼠腦創(chuàng)傷后的恢復(fù)起到了一定的作用。經(jīng)實驗初步證實，大鼠在受到腦損傷后，及時給予BMSCs治療，大鼠在病理改變上有了一定的損傷恢復(fù)，在空間學(xué)習(xí)能力上也有了相對應(yīng)的加強，這進一步說明了BMSCs的及時應(yīng)用能夠給治療帶來積極的作用。另外，本文只對BMSCs治療的時間方面，進行了不同時間點的研究，具體在治療過程中，是否存在著治療劑量的差別，還有待進一步的研究。

綜上所述，本研究證實了BMSCs對創(chuàng)傷性腦損傷的早、中期治療有明顯的作用效果，在創(chuàng)傷性腦損傷的晚期作用效果不明顯，為BMSCs面向臨床的應(yīng)用提供了有力的理論和實驗依據(jù)。

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