賈苗苗 齊莉莉 李 慧 高 翔 劉文宣 賈嫻嫻

(河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,石家莊 050017)

樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞,能通過模式識別受體高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，繼而激活na?ve T 細胞[1]。DC處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，DC失控將會導(dǎo)致嚴重的疾病狀態(tài)[2-4]。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是一類重要模式識別受體，人類CD1c-CD123highCD303+CD304+漿細胞樣DC(plasmacytoid dendritic cells,pDC)選擇性表達TLR7和TLR9[5]。CD1c+CD123low傳統(tǒng)的DC(conventional DC,cDC)包括循環(huán)中的髓樣DC(myeloid dendritic cells，mDC)表達TLR1、TLR2、 TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7[6]，和在體外產(chǎn)生的單核細胞來源的DC(moDC)表達TLR1、TLR2、 TLR3、TLR4、TLR5、TLR8[7]。在人類，TLR9只在pDC上表達，一旦暴露到病毒觸發(fā)器，pDC快速生產(chǎn)大量的Ⅰ型IFN[8]，不僅可以直接抑制病毒的復(fù)制，而且還誘導(dǎo)NK細胞、B細胞、T細胞、cDC的激活，誘導(dǎo)和放大抗病毒免疫應(yīng)答。恰當(dāng)?shù)墓逃忻庖邞?yīng)答可以防止病原體的感染，維持機體的健康，但是TLR信號的無限制活化將會引起機體功能的嚴重紊亂，導(dǎo)致嚴重的免疫病理損傷。因此，TLR信號系統(tǒng)必須得以嚴格的控制，以達到免疫穩(wěn)態(tài)和避免免疫相關(guān)的病理損傷。大量研究表明柯薩奇病毒B(Coxsackie virus B，CVB)觸發(fā)的pDC活化在導(dǎo)致病毒性心肌炎患者嚴重組織病理損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[9，10]，但目前關(guān)于pDC功能調(diào)控機制的研究卻并不深入。

膽囊收縮素(Cholecystokinin,CCK)是一種典型的腦腸肽和免疫調(diào)節(jié)肽。在體內(nèi)以多種分子形式存在，八肽膽囊收縮素(Cholecystokinin octapeptide,CCK8)是體內(nèi)含量最高且具有CCK全部生物活性的最小分子形式。它通過內(nèi)分泌、旁分泌以及自分泌等多種方式作用于靶細胞，與CCK1受體(CCK1R)或CCK2受體(CCK2R)結(jié)合，介導(dǎo)相應(yīng)的適應(yīng)性細胞保護作用。近幾年來，本課題組做了許多有關(guān)CCK8抗內(nèi)毒素休克和抗炎維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的研究工作[11-13]。在炎癥刺激因素作用下，單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等多種細胞可以分泌PGE2，這表明體內(nèi)炎癥反應(yīng)局部的pDC是暴露于PGE2的環(huán)境中的。PGE2可以調(diào)節(jié)DC的多種生物學(xué)功能,比如成熟細胞因子的生產(chǎn)、T細胞的活化和凋亡。所以,本研究旨在體外模擬體內(nèi)，探討PGE2存在時免疫調(diào)節(jié)肽CCK8能否參與調(diào)控柯薩奇病毒B誘導(dǎo)的人外周血漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)的活化，以期對CVB導(dǎo)致的病毒性心肌炎的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 CCK8、PGE2購自Sigma公司，CVB為本實驗室保存，Human CD304 MicroBeads、LS Columns購自Miltenyi Biotec公司，重組人白細胞介素3(Recombinant human interleukin 3,IL-3)購自Pepro Tech公司，Rabbit anti-human CCK1R及Mouse anti-human CCK2R購自Santa Cruz公司，F(xiàn)ITC anti-human CD303、PE anti-human CD1c、PE/Cy5 anti-human CD123、FITC anti-human CD80、FITC anti-human CD86和FITC anti-human MHC class Ⅱ以及其所需相應(yīng)的同型對照抗體均購自BD公司，PrimescriptTMRT reagent kit、SYRP Premix Ex TagTMKit購自大連寶生物公司，TRIzol Reagent購自Invitrogen公司，Human IFN-α ELISA Kit購自eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1細胞來源及培養(yǎng) 新鮮分離的健康志愿者抗凝外周血白細胞由河北省血液中心提供，通過淋巴細胞分離液密度梯度離心，獲得外周血單個核細胞(PBMC)，加入 Human CD304 MicroBeads，采用 mini MACS 免疫磁珠分離系統(tǒng)分離純化CD304+pDC。分離純化的pDC在含IL-3(10 ng/ml)的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，37℃ 5%CO2，培養(yǎng)4 d，分化為靜息狀態(tài)的pDC，然后離心棄上清，加入CVB(100 TCID50)攻擊pDC 30 min，離心棄上清后加入含有CCK8或PGE2的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。具體分為五組：control組；CVB組；CVB+CCK8組；CVB+PGE2組；CVB+PGE2+CCK8組。

1.2.2流式細胞技術(shù)檢測pDC純度 收集Human CD304 MicroBeads 分選的pDC，用PBS洗1次，分別加入FITC anti-human CD303、PE anti-human CD1c、PE/Cy5 anti-human CD123抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗2遍，流式細胞儀檢測鑒定CD1c-CD123highCD303+pDC細胞純度。

1.2.3RT-PCR檢測膽囊收縮素受體mRNA的表達 收集免疫磁珠分選純化的pDC和經(jīng)CVB 體外攻擊的pDC，根據(jù)Trizol說明書提取細胞總RNA，檢測RNA純度和完整性后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，在ABI 7500 Real-time PCR儀上進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，檢測CCK1R和CCK2R mRNA的表達；瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證PCR產(chǎn)物的特異性。引物由上海生物技術(shù)工程有限公司合成如表1。

1.2.4免疫熒光技術(shù)檢測膽囊收縮素受體的表達 收集免疫磁珠分選純化的pDC和經(jīng)CVB體外感染的pDC，4%多聚甲醛固定，分別加入一抗(兔抗人CCK1R抗體和鼠抗人CCK2R抗體)，二抗(FITC標(biāo)記的山羊抗兔和texas red標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG)，另外采用DAPI復(fù)染細胞核，PBS代替一抗作陰性對照，PC12細胞做陽性對照細胞。甘油封片后，于激光共聚焦顯微鏡下采集圖像，觀察CCK1R和CCK2R 蛋白的表達。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞表型 分組培養(yǎng)pDC，control組；CVB組；CVB+PGE2(10-7mol/L)組；CVB+CCK8(10-8mol/L)組；CVB+PGE2(10-7mol/L)+ CCK8(10-8mol/L)組，收集不同處理組的pDC，用PBS洗1次，分別加入 FITC anti-human CD80、FITC anti-human CD86、FITC anti-human MHC class Ⅱ和FITC anti-human CCR7抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗2遍，流式細胞儀檢測。每次實驗用同型抗體作為對照。用平均熒光強度(mean)表示CD80、CD86、MHC Ⅱ和CCR7蛋白表達量。

1.2.6ELISA技術(shù)檢測細胞因子的含量 純化pDC按上述不同因素處理培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)上清，按ELISA試劑盒說明書操作流程檢測人IFN-α的含量。

1.2.7RT-PCR檢測IFN-α mRNA的表達 收集不同處理組的pDC，根據(jù)Trizol說明書提取細胞總RNA，檢測RNA純度和完整性后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，在ABI 7500 Real-time PCR儀上進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，檢測IFN-α mRNA的表達。引物由上海生物技術(shù)工程有限公司合成，如表2。

2 結(jié)果

2.1CCK受體在pDC上的表達 免疫磁珠分選純化的pDC，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示CD303陽性細胞大于99%，同時高表達CD123，提示CD1c-CD123highCD303+pDC純度大于99%，結(jié)果如圖1所示。分選獲得的pDC在含IL-3(10 ng/ml)的RPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，分化為靜息狀態(tài)的pDC，然后給予CVB(100 TCID50)體外攻擊30 min。收集細胞，檢測不同狀態(tài)的pDC CCK1R和CCK2R表達。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CCK1R、CCK2R蛋白表達及mRNA表達在CVB體外攻擊后均增加(P<0.05 vs control)，結(jié)果如圖2、3所示，提示CCK8系統(tǒng)可能參與了CVB體外攻擊人外周血pDC的調(diào)控。然而，我們在人外周血pDC中并沒有檢測到CCK mRNA，也未發(fā)現(xiàn)CCK蛋白的表達。提示，CCK8并非通過自分泌而是旁分泌或內(nèi)分泌的方式作用于pDC，參與免疫調(diào)節(jié)作用。

2.2CCK8和PGE2對CVB誘導(dǎo)的協(xié)同刺激分子表達的影響 未經(jīng)CVB誘導(dǎo)的pDC表達較低水平的CD80、CD86及HLA-DR；經(jīng)CVB誘導(dǎo)的pDC協(xié)同刺激分子CD80、CD86和HLA-DR的表達顯著增高(P<0.05)；CCK8(10-8mol/L)可以抑制CVB誘導(dǎo)的CD80、CD86和HLA-DR的表達，提示CCK8可抑制CVB誘導(dǎo)的pDC表型成熟(P<0.05 vs CVB組)；然而PGE2(10-7mol/L)對CVB誘導(dǎo)的協(xié)同刺激分子CD80、 CD86和HLA-DR的表達增高有促進作用(P<0.05 vs CVB組)。提示CCK8和PGE2雙向調(diào)控CVB誘導(dǎo)的pDC協(xié)同刺激分子的表達，結(jié)果如圖4所示。

圖1 流式細胞技術(shù)檢測pDC純度Fig.1 Detect purity of pDC by flow cytometryNote:The purity of CD1c-CD123highCD303+pDC was 99%.

表1CCK1R和CCK22R引物序列

Tab.1PrimersequencesofCCK1RandCCK2R

GenesAccession No.PrimersCCK1RNM_000730.2Forward primer:5'-GACGCTTCGGTCATTAGA-3'Reverse primer:5'-AGGGAGGAGTGAAGTTGC-3'CCK2RNM_176875.2Forward primer:5'-CCCACTCCCTCCATTGCT-3'Reverse primer:5'-CTGCTCCATTCTTATTCCTCTT-3'β-actinNM_031144Forward primer:5'-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3'Reverse primer:5'-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'

表2IFN-α引物序列

Tab.2PrimersequencesofIFN-α

GenesAccession No.PrimersIFN-αNM_002171Forward primer:5'-GGAGGAAGGATTGAAAACTGG-3'Reverse primer:5'-GATGAAGTGAGACATCAGAATGG-3'

2.3CCK8和PGE2對CVB誘導(dǎo)趨化因子受體表達的影響 未經(jīng)CVB誘導(dǎo)的pDC表達較低水平的CCR7；經(jīng)CVB誘導(dǎo)的pDC協(xié)同刺激分子CCR7的表達顯著增高(P<0.05)；CCK8(10-8mol/L)可以促進CVB誘導(dǎo)的CCR7的表達，提示CCK8可促進CVB誘導(dǎo)的pDC的趨化(P<0.05 vs CVB組)；PGE2(10-7mol/L)對CVB誘導(dǎo)的趨化因子受體CCR7的表達增高也有促進作用(P<0.05 vs CVB組)。提示CCK8和PGE2均可促進CVB誘導(dǎo)的pDC趨化，結(jié)果如圖5所示。

2.4CCK8和PGE2對CVB誘導(dǎo)pDC產(chǎn)生IFN-α的調(diào)控 收集不同因素作用后的各組細胞的培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測IFN-α的含量，RT-PCR檢測IFN-α mRNA的表達。未經(jīng)CVB誘導(dǎo)的pDC，表達較低水平的IFN-α mRNA；經(jīng)CVB誘導(dǎo)的pDC，IFN-α mRNA的表達顯著增高(P<0.05)；CCK8可以劑量依賴性抑制IFN-α mRNA表達的增高(P<0.05 vs CVB組)，且對pDC存活無明顯影響；PGE2(10-7mol/L) 對CVB誘導(dǎo)IFN-α mRNA的表達有促進作用(P<0.05 vs CVB組)。同時，培養(yǎng)上清中IFN-α含量檢測結(jié)果也證明體外給予CCK8(10-8mol/L)，可以抑制CVB誘導(dǎo)的pDC分泌IFN-α(P<0.05 vs CVB組)，相反PGE2可以促進pDC分泌IFN-α(P<0.05 vs CVB組)。提示CCK8和PGE2參與了CVB誘導(dǎo)pDC產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的雙向調(diào)控作用，結(jié)果如圖6所示。

圖2 RT-PCR檢測CCK1R和CCK2R mRNA的表達Fig.2 Detect CCK1R and CCK2R mRNA by RT-PCRNote:The mRNA expression of CCK1R and CCK2R was up-regulated by CVB attack.*.P<0.05.

圖3免疫熒光技術(shù)檢測CCK1R和CCK2R蛋白的表達

Fig.3ExpressionofCCK1RandCCK2Rproteindetectedbyimmunofluorescencetechnique

Note: Green fluorescence stands for CCK1R protein；Red fluorescence stands for CCK2R protein.A.Control group;B.CVB group;C.Control group;D.CVB group.The expression of CCK1R and CCK2R was up-regulated by CVB attack.*.P<0.05 vs Control,t-test.

圖4 流式細胞技術(shù)檢測協(xié)同刺激分子的表達Fig.4 Expression of costimulatory molecules detect by flow cytometryNote:CCK8 repressed the expression of costimulatory molecules on CVB-attacked pDC.P<0.05，CVB+CCK8 vs CVB,t-test,while PGE2 promoted it(*.P<0.05).

圖5 流式細胞技術(shù)檢測CCR7的表達Fig.5 Expression of CCR7 detected by flow cytometryNote:CCK8 and PGE2 promoted the expression of CCR7 on CVB-attacked pDC.*.P<0.05.

圖6 RT-PCR和ELISA 法檢測IFN-α的合成和分泌Fig.6 Synthesis and secretion of IFN-α detected by RT-PCR and ELISANote:A.Exogenous CCK8 inhibited the IFN-α synthesis,dose-dependently,in vitro;B.CCK8(10-8mol/L)inhibited CVB induced IFN-α mRNA expression,while PGE2 promoted;C.CCK8(10-8mol/L)inhibited CVB induced IFN-α secretion,while PGE2 promoted.*.P<0.05.

3 討論

CVB是一種常見的腸道病毒，感染后大部分患者表現(xiàn)為隱性感染或只表現(xiàn)為一般感冒癥狀，少數(shù)患者則表現(xiàn)為嚴重的心肌炎，甚至導(dǎo)致猝死，也可發(fā)展為擴張性心肌病[14]。有研究證實,CVB 感染導(dǎo)致的心肌炎并非由CVB 直接破壞心肌細胞引起,很大程度上是由于過強的免疫應(yīng)答導(dǎo)致的心肌損傷[15]。因此,不同的臨床表現(xiàn)與不同的免疫反應(yīng)有關(guān)。病毒感染，可以激活漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)，并迅速產(chǎn)生大量Ⅰ型IFN，這不僅可以直接抑制病毒復(fù)制而且還可誘導(dǎo)NK細胞、B細胞、T細胞、cDCs發(fā)生免疫應(yīng)答。但Ⅰ型IFN的大量產(chǎn)生和免疫系統(tǒng)的過度活化也將對機體組織造成免疫病理損傷[16]。CVB觸發(fā)的pDCs細胞活化在導(dǎo)致病毒性心肌炎患者嚴重組織病理損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，但目前關(guān)于pDCs細胞功能負向調(diào)控機制的研究卻并不深入。有研究提示餐后釋放的膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)類物質(zhì)，除了干預(yù)消化系統(tǒng)功能外，還能干預(yù)神經(jīng)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫應(yīng)答反應(yīng)，之間存在異常復(fù)雜的相互作用。CCK是一個激素家族，CCK8是擁有完整生物活性的最小片段。人外周血pDC是病毒感染的主要防御者。我們的研究證明體外給予CVB，刺激活化人外周血pDC，CCK1R和CCK2R的表達顯著升高，pDCs的活化對它們的表達有明顯的正向調(diào)節(jié)作用。CCK受體表達的增加可能是人體應(yīng)激狀態(tài)下神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)的一種保護性機制或者是它們之間進行的信息傳遞。我們的研究結(jié)果表明作為一種免疫調(diào)節(jié)因子的CCK8，體外可以抑制CVB刺激誘導(dǎo)的pDCs表型的成熟，而且，CCK8會抑制CVB誘導(dǎo)的IFN-α的合成與分泌。體外由CCK8所誘導(dǎo)的對人pDC活化的調(diào)節(jié)，也許將為CVB感染后引起的病毒性心肌炎提供以調(diào)控免疫為基礎(chǔ)的新療法。機體存在精密的負向免疫調(diào)控機制以保證 TLR 信號的適度活化，CCK8因此將會被用于免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)，以防止TLR 通路過度活化引發(fā)的免疫應(yīng)答紊亂。

在炎癥刺激因素作用下，單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等多種細胞可以分泌PGE2，這表明體內(nèi)炎癥反應(yīng)局部的pDC是暴露于PGE2的環(huán)境中的。PGE2可以調(diào)節(jié)DC的多種生物學(xué)功能[17],比如成熟細胞因子的生產(chǎn)、T細胞的活化和凋亡。同時也觀察了在PGE2存在時CCK8對pDCs表型成熟的影響。結(jié)果表明，體外PGE2單獨作用可以促進抑制CVB刺激誘導(dǎo)的pDCs表型的成熟和IFN-α的合成與分泌。而CCK8(10-8mol/L)能抑制PGE2(10-7mol/L)對CVB誘導(dǎo)的pDC協(xié)同刺激分子CD80、CD86和HLA-DR的表達以及IFN-α的合成與分泌的促進作用。提示CCK8和PGE2可以雙向調(diào)控CVB誘導(dǎo)pDC的免疫應(yīng)答水平。

CCK8作為一種免疫抑制劑或細胞激素參與調(diào)控CVB誘導(dǎo)的人類pDCs活化，從而防止發(fā)生免疫過度引發(fā)的免疫病理損傷，這已非常清楚。我們前期研究結(jié)果證明CCK8可以通過CCK2R調(diào)節(jié)重要的信號分子TRAF6的表達，進而抑制TLR9誘導(dǎo)的pDC的活化。TRAF6是NF-κB、MAPK、IRF7等激活過程中重要的銜接蛋白，CCK受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，TLR-MyD88-TRAF6和GPCR-PI3K/PKA/PKC/CAMK信號通路之間的相互聯(lián)系機制尚未明了，這需要更深入的研究來解決。但所有這些結(jié)果提醒我們，CCK8對于pDCs免疫功能的調(diào)節(jié)不容忽視，這將為CVB 感染導(dǎo)致的心肌炎提供新的治療手段。

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