孔 寧 孫 娟 楊懿銘 鄒和建 楊 潔 萬偉國

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院風(fēng)濕科，上海 200040)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)毀損、多臟器損害的系統(tǒng)性疾病，也是導(dǎo)致勞動力喪失的主要免疫性關(guān)節(jié)炎之一；T細胞和B細胞均參與了疾病的發(fā)生和發(fā)展[1,2]。B細胞，作為主要的免疫細胞之一，除了體液免疫，還在細胞免疫中發(fā)揮著重要作用。首先，B細胞可以作為抗原提呈細胞激活效應(yīng)性T細胞分泌炎癥因子，并且是效應(yīng)性T細胞激活增殖的必需條件之一。取自μMT-/-NOD小鼠(缺乏B細胞的NOD小鼠模型)的T細胞與NOD小鼠(1型糖尿病的小鼠模型)的T細胞相比，喪失了對其自身抗原肽(GAD65)刺激的反應(yīng)能力，不會進展為1型糖尿病[3]，去除B細胞后，即便有其他抗原提呈細胞的輔助，T細胞的增殖能力仍明顯減弱[4]。其次，B細胞是自身反應(yīng)性CD4+T細胞激活的必需條件[5]。已知，RA經(jīng)典的動物模型—膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis，CIA)的重要發(fā)病機制之一是淋巴細胞對自身抗原Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ，C Ⅱ)的免疫耐受異常，產(chǎn)生了針對CⅡ的特異性應(yīng)答，抗原特異性的自身反應(yīng)性CD4+T細胞被激活，在不同細胞因子的誘導(dǎo)下，分化成不同的效應(yīng)性T細胞，包括Th17細胞、Th1細胞、Th2細胞等，并進一步分泌多種炎癥因子，進而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。尚有研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞激活對B細胞的依賴僅表現(xiàn)在自身免疫性應(yīng)答中[6,7]。再者，自身反應(yīng)性CD4+T細胞尤其對表達共刺激分子(CD80、CD86)和MHC Ⅱ類分子的B細胞的刺激產(chǎn)生應(yīng)答[8-10]。B細胞被激活后細胞表面共刺激分子(CD80、CD86)和MHC Ⅱ 類分子的表達會增加[11]，轉(zhuǎn)而發(fā)揮作為專業(yè)抗原提呈細胞的功能。

調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)作為發(fā)揮免疫抑制作用的T細胞亞群，對維持機體免疫穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用，其數(shù)量和/或功能的異?？蓪?dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[12]，包括RA和CIA[13-18]。既往的研究已發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)的Tregs(induced T regulatory cells，iTregs)有著與體內(nèi)天然的Tregs(natural T regulatory cells，nTregs)相似的表型和抑制功能，對CIA小鼠起到預(yù)防和早期治療的作用[19,20]；并且在已發(fā)病的關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)，foxp3+細胞發(fā)生了明顯的擴增[19]，但擴增的機制尚不明確。有關(guān)Tregs免疫調(diào)節(jié)機制的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥環(huán)境下的BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠(BAFF，B cell activating factor belonging to TNF family，促進B細胞的成熟，維持B細胞的存活)體內(nèi)，foxp3+Tregs擴增明顯增多；而在B細胞缺乏的小鼠中，擴增現(xiàn)象消失[21]；由此可見，炎癥環(huán)境下體內(nèi)Tregs的擴增依賴于B細胞。本研究擬探討在CIA小鼠的炎癥環(huán)境下，iTregs與B細胞間的相互作用，進一步理解iTregs對CIA小鼠的預(yù)防和早期治療作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 8周齡雄性DBA1/J小鼠購自上海斯萊克實驗動物中心，飼養(yǎng)在室溫，相對濕度(55±10)%，照明/黑暗為12 h/12 h環(huán)境中，自由攝食及飲水。

1.1.2實驗試劑 牛Ⅱ型膠原(CⅡ,Chondrex,Redmond,WA,USA)；完全弗氏佐劑(CFA,Difco,Detroit,MI,USA)；不完全弗氏佐劑(IFA,Difco)；CD4+T細胞分選試劑盒(Miltenyi Biotec Technology & Trading,Shanghai,China)；抗CD25-PE單克隆抗體(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)；抗PE的磁珠(Miltenyi)；抗CD62L-PE單克隆抗體、抗CD19-PE單克隆抗體(BD)；10%胎牛血清(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA)；IL-2(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)、TGF-β(R&D Systems)和CD3/CD28單抗偶聯(lián)磁珠(Miltenyi)；CD4-FITC、CD25-PE(BD)和foxp3-APC(eBioscience,San Diego,CA,USA)；CD80-FITC、CD86-FITC、MHCⅡ-FITC和CD19-APC(BD)；羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE，CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit,Invitrogen,Germany)；CTLA-4-PE(CTLA-4，Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，細胞T淋巴細胞相關(guān)抗原4，BD)。

1.2方法

1.2.1CIA模型的誘導(dǎo) 牛Ⅱ型膠原(CⅡ)和完全弗氏佐劑按照1∶1 的體積比充分乳化，50 μl乳化液在小鼠尾根部皮下注射；初次免疫后第21天，CⅡ和不完全弗氏佐劑按照1∶1的體積比充分乳化，50 μl乳化液在小鼠尾根部皮下注射，完成CIA模型的誘導(dǎo)。在二次免疫后，隔天，按既定評分標(biāo)準(zhǔn)[17]進行評分和記錄。

1.2.2細胞制備 CD4+CD62L+CD25-T細胞的制備：無菌分離DBA1/J小鼠的脾臟，研磨得單個細胞懸液，裂解紅細胞，采用CD4+T細胞分選試劑盒分選得CD4+T細胞；分選所得的CD4+T細胞與抗CD25-PE單克隆抗體孵育后，加入抗PE的磁珠，分選出CD4+CD25-T細胞。CD4+CD25-T細胞先后加入抗CD62L-PE單克隆抗體、抗PE的磁珠再次孵育后，分選得到CD4+CD62L+CD25-T細胞。

CIA B細胞(CIA-B)和正常B細胞(N-B)的制備：分別無菌分離DBA1/J小鼠或初次免疫后第35天已有關(guān)節(jié)炎發(fā)作的CIA小鼠的脾臟，研磨得單細胞懸液，裂解紅細胞，加入抗CD19-PE單克隆抗體，然后與抗PE的磁珠共孵育后分選出CD19+細胞。

1.2.3細胞培養(yǎng) 經(jīng)典iTregs的生成：分離自正常DBA1/J小鼠脾臟的CD4+CD62L+CD25-T細胞，采用RPMI1640、10%胎牛血清、40 U/ml IL-2、2 ng/ml TGF-β和CD3/CD28單抗偶聯(lián)磁珠(細胞∶磁珠=4∶1)培養(yǎng)4 d。體外，不同B細胞誘導(dǎo)Tregs的生成：CD4+CD62L+CD25-T細胞分別與N-B和CIA-B以 1∶1 細胞比例在100 U/ml IL-2和5 ng/ml TGF-β條件下共培養(yǎng)3 d；收集細胞，標(biāo)記CD4-FITC、CD25-PE和foxp3-APC，流式細胞儀檢測CD4+CD25+foxp3+細胞的百分比。經(jīng)典iTregs與CIA-B細胞共培養(yǎng)：經(jīng)典iTregs與CIA-B以1∶1比例共培養(yǎng)，同時加入IL-2(100 ng/ml) 和CⅡ(200 ng/ml) 共培養(yǎng) 3 d，3 d后收集培養(yǎng)的細胞，分別標(biāo)記CD80-FITC、CD86-FITC、MHCⅡ-FITC和CD19-APC，流式細胞儀分別檢測CD80+CD19+、CD86+CD19+、MHCⅡ+CD19+細胞的百分比。

1.2.4細胞增殖實驗 經(jīng)典iTregs與CIA-B細胞共培養(yǎng)：iTregs標(biāo)記CFSE，與CIA-B細胞以1∶1比例共培養(yǎng)；同時加入IL-2(100 ng/ml) 和CⅡ(200 ng/ml)共培養(yǎng)3 d，3 d后收集細胞，流式細胞儀檢測CFSE+細胞的百分比。

1.2.5Transwell實驗 經(jīng)典iTregs與CIA-B以1∶1比例共培養(yǎng)，iTregs置于下層，CIA-B細胞置于上層；同時加入IL-2(100 ng/ml)和CⅡ(200 ng/ml) 共培養(yǎng)3 d，3 d后收集培養(yǎng)的細胞。①標(biāo)記抗CTLA-4-PE，流式細胞儀檢測CTLA-4+細胞的百分比；②分別標(biāo)記CD80-FITC、CD86-FITC、MHCⅡ-FITC和CD19-APC，流式細胞儀分別檢測CD80+CD19+、CD86+CD19+、MHCⅡ+CD19+細胞的百分比。

1.2.6抗體染色和流式細胞儀檢測

1.2.6.1約1×106的培養(yǎng)細胞加入抗CD4-FITC和CD25-PE單抗孵育0.5 h后，1×PBS清洗，固定并破膜，加入抗foxp3-APC單抗孵育，1×PBS清洗后上機檢測。

1.2.6.2約1×106的培養(yǎng)細胞分別加入抗CTLA-4-PE單抗孵育半小時，1×PBS清洗后上機檢測；加入抗CD80-FITC和CD19-APC、抗CD86-FITC和CD19-APC、抗MHCⅡ-FITC和CD19-APC抗體，1×PBS清洗后上機檢測。

2 結(jié)果

2.1CIA B細胞(CIA-B)較正常B細胞(N-B)誘導(dǎo)更多Tregs的生成 已知CIA-B共刺激分子表達上調(diào)而具有更強的抗原提呈能力，并且在已發(fā)病的CIA關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)foxp3+細胞可以進一步擴增，由此本研究設(shè)立下述實驗觀察CIA-B對foxp3+細胞(Tregs)的誘導(dǎo)作用。將CD4+CD62L+CD25-細胞分別以CIA-B或N-B作為抗原提呈細胞，加以IL-2和/或TGF-β共培養(yǎng)3 d，收集培養(yǎng)的細胞，流式細胞儀檢測CD25+foxp3+細胞的表達。如圖1所示，CIA-B較N-B誘導(dǎo)更多的CD25+foxp3+細胞的生成[(54.497±1.830)% vs(45.783±0.484)%，P=0.010]。

2.2CIA-B促進iTregs的增殖并上調(diào)iTregs細胞表面CTLA-4的表達 觀察CIA-B作為抗原提呈細胞是否可以直接作用于iTregs。將iTregs標(biāo)記CFSE后與CIA-B按細胞數(shù)1∶1 的比例共培養(yǎng)3 d，實驗分為iTregs組和iTregs+CIA-B組，3 d后收集細胞，流式細胞儀檢測iTregs-CFSE的表達即iTregs的增殖；結(jié)果顯示與CIA-B共培養(yǎng)后，iTregs的增殖明顯增加[見圖2A，(47.920±2.049)% vs(23.960±0.493)%，P<0.000 1]。另一組實驗，將iTregs與CIA-B按細胞數(shù)1∶1的比例共培養(yǎng)3 d，實驗分為iTregs+CIA-B組和iTregs+CIA-B Transwell組(iTregs+CIA-B T)，3 d后收集細胞，流式細胞儀檢測CTLA-4的表達；結(jié)果顯示與CIA-B共培養(yǎng)后，iTregs細胞表面CTLA-4的表達上調(diào)，并且該作用通過iTreg與CIA-B細胞間的直接接觸而實現(xiàn)[見圖2B，(76.147±4.338)% vs(5.910±0.565)%，P<0.000 1]。

圖1 CIA-B較N-B誘導(dǎo)更多Tregs的生成Fig.1 CIA-B induced more Tregs production than N-B

圖2 CIA-B促進iTregs的增殖并上調(diào)iTregs細胞表面CTLA-4的表達Fig.2 CIA-B promoted iTregs proliferation and CTLA-4expression

圖3 iTregs通過細胞直接接觸促進CIA-B細胞表面共刺激分子和MHCⅡ類分子的表達Fig.3 iTregs increased the expressions of co-stimulators(CD80,CD86) and MHCⅡ on CIA-B through a cell-contact pathway

表1iTregs通過細胞直接接觸促進CIA-B細胞表面共刺激分子和MHCⅡ類分子的表達

Tab.1iTregsincreasedtheexpressionsofco-stimulators(CD80,CD86)andMHCⅡonCIA-Bthroughacell-contactpathway

ItemCIA-BiTregs+CIA-BiTregs+CIA-B TCD8029.235±1.386504.645±90.7771)2)77.818±2.261CD8655.443±4.018950.743±97.1023)4)75.900±0.841MHCⅡ641.930±24.3475170.890±309.5905)6)690.165±42.712

Note：1)CIA-B vs iTregs+CIA-B，P=0.001 9；2)iTregs+CIA-B vs iTregs+CIA-B T，P=0.003 3；3)CIA-B vs iTregs+CIA-B，P<0.000 1；4)iTregs+CIA-B vs iTregs+CIA-B T，P=0.001；5)CIA-B vs iTregs+CIA-B，P<0.000 1；iTregs+CIA-B vs iTregs+CIA-B T，P<0.000 1.

2.3iTregs促進CIA-B細胞表面共刺激分子(CD80，CD86)和MHCⅡ類分子的表達 將iTregs與CIA-B細胞按照1∶1 的細胞比例共培養(yǎng)3 d，實驗設(shè)為CIA-B組、iTregs+CIA-B組和iTregs+CIA-B Transwell實驗組(iTregs+CIA-B T)；3 d后，收集細胞，流式細胞儀分別檢測CD80+CD19+、CD86+CD19+、MHCⅡ+CD19+細胞的表達情況。結(jié)果如圖3和表1所示，研究發(fā)現(xiàn)與iTregs共培養(yǎng)后，CIA-B細胞表面共刺激分子(CD80，CD86)和MHCⅡ類分子的表達都顯著升高；在進行Transwell實驗將iTregs與CIA-B細胞隔離開共培養(yǎng)后，三者的表達都顯著回落甚至是接近共培養(yǎng)前的水平。

3 討論

已知，B細胞通過B細胞表面抗原受體和表達于T細胞表面的一些分子配體相結(jié)合，實現(xiàn)兩者間的相互作用[22]，從而調(diào)控效應(yīng)性T細胞的激活、調(diào)節(jié)性T細胞的生成及抑制性免疫應(yīng)答[23]。在這種相互作用中，B細胞被激活而表達更多的共刺激分子，或分化成漿細胞；同時表達更多共刺激分子的B細胞可以作為抗原提呈細胞通過提呈特異性抗原而激活自身反應(yīng)性T細胞[24]。任何對B細胞和T細胞相互作用的影響都可能誘發(fā)自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[22]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，在將iTregs注射入已發(fā)病的CIA小鼠后，iTregs在體內(nèi)明顯擴增，但具體機制不詳[19]；結(jié)合已有的BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠研究結(jié)果[21]，推測在CIA已發(fā)病的關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥環(huán)境下，iTregs的擴增也有賴于B細胞。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，已發(fā)病的CIA小鼠的B細胞較正常DBA1/J小鼠的B細胞誘導(dǎo)更多Tregs細胞(foxp3+細胞)的生成。不僅如此，CIA小鼠的B細胞還可以促進iTregs本身的增殖，并通過細胞直接接觸的方式上調(diào)iTregs細胞表面CTLA-4的表達。

既然B細胞與T細胞存在著明確的相互作用，研究隨后觀察了iTregs對B細胞的可能作用方式。結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)，iTregs顯著上調(diào)了B細胞表面共刺激分子(CD80、CD86)和MHCⅡ類分子的表達，這三者代表著B細胞的激活和抗原提呈能力；這個作用依賴于細胞直接接觸而實現(xiàn)。

iTregs又是如何避免B細胞持續(xù)過度地活化呢？已有研究證實，Tregs可通過CD28/CD80/86/CTLA-4平衡直接抑制B細胞的功能[23]。表達于B細胞表面的CD80/CD86可以通過與兩種表達于T細胞表面的受體分子結(jié)合而分別發(fā)揮抑制或促進T細胞功能的作用，這兩種受體分子包括CTLA-4和CD28。CTLA-4又稱CD152,是下調(diào)免疫應(yīng)答的一種關(guān)鍵蛋白受體，與CD28共享CD80/CD86分子配體，而CTLA-4與CD80/CD86分子結(jié)合后誘導(dǎo)T細胞無反應(yīng)性，參與免疫反應(yīng)的負調(diào)節(jié)[25-29]。CTLA-4可表達于人和小鼠的Tregs表面，是Tregs發(fā)揮免疫抑制功能的重要途徑之一[30-32]。iTregs表面的CTLA-4可以結(jié)合CD80/CD86發(fā)揮對B細胞甚至是效應(yīng)性T細胞的抑制作用；而CD80/CD86則可與T細胞表面的CD28結(jié)合起到促進效應(yīng)性T細胞增殖的作用；已知CTLA-4可以競爭性結(jié)合CD80/CD86。由此可見，iTregs可以通過上調(diào)B細胞表面CD80、CD86和MHCⅡ類分子的表達，增強其抗原提呈的能力，進而促進iTregs本身的增殖并誘導(dǎo)更多Tregs的生成；同時這些B細胞可以上調(diào)iTregs表面CTLA-4的表達，通過CTLA-4與CD80/CD86的結(jié)合直接抑制B細胞并可直接和或間接抑制效應(yīng)性T細胞，而利于免疫抑制功能的發(fā)揮并避免B細胞的過度激活。

本研究探討了CIA關(guān)節(jié)炎小鼠炎癥環(huán)境下iTregs與B細胞的相互作用模式，推動了iTregs對關(guān)節(jié)炎小鼠治療作用機制的研究，將有助于RA細胞免疫治療的發(fā)展。

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