劉 萍，馬曉霞，周小凱，馬 鵬，常秋燕，李林杰，李凌浩，馬忠仁

(1.西北民族大學 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

衣原體是一類嚴格寄生于細胞內，可感染多種動物和人并引起疾病的原核微生物。衣原體科(Chlamydiaceae)僅含1個屬，即衣原體屬，共有12個已明確鑒定的種，包括以人為天然宿主的沙眼衣原體(C.trachomatis)、肺炎衣原體(C.pneumoniae)和以動物為天然宿主的鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)、流產衣原體(C.abortus)、鼠衣原體(C.muridarum)、豬衣原體(C.suis)、家畜衣原體(C.pecorum)、貓衣原體(C.felis)、豚鼠衣原體(C.caviae)、野鳥衣原體(C.avium)、家禽衣原體(C.gallinacea)以及朱鷺衣原體(C.ibidis)[1]。這些衣原體物種具有相同的生活周期，包括感染和在細胞內增殖2個階段。衣原體的原生小體(Elementary body，EB)代謝不活躍但具有感染性。游離的EB附著在宿主細胞表面后，通過胞吞作用進入細胞并形成包涵體(Inclusion)，在包涵體內EB轉變?yōu)榇x旺盛的網狀體(Reticulate body，RB)，RB通過二分裂的方式增殖。經過一定時間的增殖，RB重新轉變?yōu)镋B并釋放到細胞外完成其發(fā)育周期[2-3]。在感染和增殖過程中，衣原體編碼的多種蛋白可分泌到宿主細胞的細胞漿中并隨成熟的EB顆粒釋放到細胞外，這些分泌性的衣原體蛋白分子與宿主細胞之間發(fā)生復雜的相互作用，對于衣原體的感染和增殖具有重要意義，同時也與衣原體的致病機制密切相關[4-5]。

衣原體蛋白酶樣活性因子(Chlamydial protease like activity factor，CPAF)是由衣原體合成并分泌到宿主細胞內的蛋白，是衣原體和宿主之間相互作用的重要分子之一[6-7]。沙眼衣原體的CPAF能選擇性降解由上皮細胞和嗜中性粒細胞產生的抗菌肽LL-37以及具有抗衣原體活性的其他活性肽，從而增加沙眼衣原體的感染力和致病性[8]。肺炎衣原體的CPAF可能與肺炎衣原體的致病性密切相關，重組肺炎衣原體的CPAF能引起B(yǎng)ALB/c小鼠肺組織的炎癥損傷和炎癥因子TNF-α和IL-6水平的升高[9]。另外，CPAF具有很強的免疫原性，其抗原性明顯強于MOMP和HSP60，可以作為衣原體診斷和疫苗的候選抗原[4，10]。

流產衣原體是綿羊地方性流產(Enzootic abortion of ewes)的主要病原，在全世界范圍內廣泛分布，能夠引起豬、牛、羊等多種動物發(fā)生流產、死胎、弱胎等慢性接觸性疾病，也能夠感染人類，導致孕婦流產，是一種重要的人畜共患病病原[11-13]。近年來，動物流產衣原體病在我國時有發(fā)生，對養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經濟損失[14-15]。由于流產衣原體感染的動物通常癥狀表現不明顯，容易被忽視，而在妊娠后期導致動物流產[12]。早期診斷和疫苗免疫是防控動物流產衣原體病最有效的措施，然而，目前尚無針對流產衣原體病的商品化疫苗。因此，有必要建立特異性高、靈敏性好的流產衣原體抗體檢測方法。

本試驗對流產衣原體的CPAF編碼基因進行克隆并原核表達，為動物流產衣原體病診斷方法的建立奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種和質粒 流產衣原體菌株(GN6)基因組由蘭州獸醫(yī)研究所李兆才博士惠贈，pMD18T為大連寶生物工程有限公司產品，感受態(tài)細胞DH5α、表達菌株BL21(DE3)以及pET30a質粒均由西北民族大學細胞工程中心保存。

1.1.2 主要試劑 2×Ex Taq Master Mix、DNA標準分子量(DL2000)、T4DNA連接酶、限制性內切酶等購自大連寶生物工程有限公司；蛋白質標準分子量(Blueplus Ⅱ Protein Marker)購自北京全式金生物技術有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG、IPTG分別購自北京博奧森生物技術有限公司和Sigma公司；Ni-NTA Superflow購自QIAGEN公司；咪唑購自 BioTech公司。

1.1.3 流產衣原體陽性血清 以流產衣原體GN6菌株感染新西蘭大白兔制備陽性血清。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據流產衣原體GN6菌株全基因序列(CP021996)[16]，設計用于擴增流產衣原體CPAF的編碼基因的引物，上游引物為：5′-GAACATATGAAGCTAAAACAAATTACAGTC-3′(下劃線為NdeⅠ酶切位點)；下游引物為：5′-GTACTCGAGCGACTCAGTGATTTTGTCTGC-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。引物由上海生工生物科技有限公司有限公司合成，-20oC保存，備用。以該引物擴增所得目的片段長度為1 809 bp。

1.2.2 CPAF編碼基因的擴增與克隆 以流產衣原體GN6株基因組為模板，PCR擴增流產衣原體CPAF的編碼基因?；厥占兓康幕蚱?，將其連接到pMD18T上，篩選陽性克隆，將目的片段正確連接的質粒命名為pMD18T-CPAF。

1.2.3 原核表達載體的構建及鑒定 以NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切pMD18T-CPAF和pET30a空載體；瓊脂糖凝膠電泳并回收目的基因和線性化的pET30a載體。將回收的CPAF基因片段與載體片段用T4DNA連接酶于16 ℃過夜連接。篩選陽性克隆，送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4 重組蛋白的誘導表達、純化及鑒定 鑒定為陽性的重組表達載體命名為pET30-CPAF，將其轉化表達菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆，過夜培養(yǎng)后轉接到10 mL LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至菌液OD值為0.8左右，加入IPTG(終濃度為1.0 mmol/L)誘導目的基因表達。在誘導過程中每小時收集菌體一次，用SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況，優(yōu)化誘導條件。最后收集誘導后菌體，經超聲破碎后，取上清液和沉淀，與300 μL Ni-NTA Superflow混勻，4oC過夜，再用咪唑緩沖液洗脫，獲得純化的蛋白。將純化的蛋白進行SDS-PAGE檢測。

1.2.5 重組蛋白的Western Blot分析 將表達產物進行SDS-PAGE后，轉印于PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉后與稀釋于2%脫脂奶粉流產衣原體陽性血清4 ℃過夜孵育，PBST洗膜，再與稀釋于2%脫脂奶粉的HRP標記羊抗兔IgG孵育2 h，PBST洗滌，滴加ECL工作液，暗室壓片曝光。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果及重組原核表達載體的鑒定

以流產衣原體GN6菌株基因組為模板，經PCR擴增得到1 800 bp左右的CPAF編碼基因，與預期大小相符。重組質粒pET30-CPAF經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后出現1 809 bp的目的條帶和5 240 bp的載體條帶，說明重組表達構建成功(圖1)。

M.DL2000 Marker；1.CPAF基因擴增產物；2.pE30-CPAF經NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切。M.DL2000 Marker；1.Amplification of CPAF gene；2.pET30-CPAF digested using NdeⅠ and XhoⅠ.

2.2 CPAF編碼基因的序列分析及蛋白質的結構預測

測序結果顯示，所克隆的CPAF編碼基因與流產衣原體標準菌株S26/3(NC_004552.2)及我國分離株GN6(CP021996.1)全基因組序列中的CPAF編碼基因核苷酸序列100%符合，表明基因克隆正確。利用在線軟件預測CPAF的氨基酸序列，結果顯示，流產衣原體CPAF分子由603個氨基酸殘基組成，相對分子質量為67.6 ku，理論等電點是5.79，理論推導半衰期大于30 h，屬于穩(wěn)定蛋白質。N端前23個氨基酸殘基組成的多肽可能是該蛋白的信號肽，最可能的定位是在宿主細胞的細胞質，C端含有2個保守的S41蛋白酶超家族(Petidase_S41 superfamily)結構域，與其在沙眼衣原體和肺炎衣原體中的同系物一致[4，10]，推測其同樣具有蛋白水解酶活性。將衣原體屬成員具有2個保守的S41蛋白酶超家族(Petidase_S41 superfamily)結構域的基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結果顯示，衣原體各物種的CPAF同系分子序列可分為3類：沙眼衣原體和鼠衣原體聚為一類，它們具有相似的組織嗜性和病理過程；肺炎衣原體和家畜類衣原體聚為一類，它們具有相似的組織嗜性和病理過程；流產衣原體、鸚鵡熱衣原體、貓衣原體、豚鼠衣原體和家禽衣原體聚為一類，它們的親緣關系更近(圖2)。進一步利用SWISS-MODEL 軟件源建模得到的流產衣原體CPAF分子高級結構預測，結果顯示，在25-592位可形成高級結構，其高級結構與沙眼衣原體CPAF 的X 射線衍射晶體結構十分相似(圖3)。因此推測，流產衣原體的CPAF分子在其組織嗜性、致病過程以及其本身適應宿主細胞等方面發(fā)揮重要作用。

圖2 衣原體CPAF同系分子親緣關系Fig.2 Phylogenetic analysis of CPAFs in Chlamydial species

A.流產衣原體CPAF；B.沙眼衣原體CPAF。A.CPAF of Chlamydia abortus；B.CPAF of Chlamydia trachomatis.

對流產衣原體CPAF的親水性分析表明，該蛋白在第46-80位，154-168位，191-215位，257-343位，408-429位，437-454位，467-476位，562-576位，584-603位的氨基酸殘基處有較高的親水性；由抗原表位分析圖4可知，流產衣原體CPAF在第19-25位，46-56位，59-81位，115-121位，131-142位，150-167位，191-215位，228-235位，241-247位，260-298位，304-312位，325-344位，348-367位，376-389位，407-427位，445-454位，467-475位，483-502位，522-547位，584-603位可能存在抗原表位(圖4)。

圖4 流產衣原體CPAF氨基酸序列的親水性、抗原指數和表面分布可能性分析Fig.4 Analysis of hydrophilicity，antigenic index and surface probability of CPAF protein amino acid

2.3 重組蛋白誘導表達條件的優(yōu)化

用終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導不同時間(1～5 h)，SDS-PAGE結果顯示，在誘導1 h后重組CPAF蛋白表達量即明顯增加，在3 h時表達量最大(圖5)；未誘導對照組則沒有重組蛋白的表達。

M.蛋白分子質量標準；1.未誘導的pET30-CPAF；2～6.分別誘導1～5 h的pET30-CPAF；7～8.分別從未誘導和誘導的細胞中純化的重組CPAF蛋白。

M.Protein Marker；1.Uninduced cells containing pET30-CPAF；2-6. Cells containing pET30-CPAFinduced for 1-5 h respectively；7-8.Purified recombinant CPAF from uninduced and induced cells containing pET30-CPAFrespectively.

圖5重組CPAF的誘導表達及純化
Fig.5ExpressioninductionandpurificationofrecombinantCPAF

2.4 重組蛋白的Western Blot分析

Western Blot結果顯示，重組流產衣原體CPAF蛋白能與抗His標簽單克隆抗體和流產衣原體陽性血清發(fā)生特異性反應(圖6)。

M.蛋白分子量標準；1.pET-30a對照菌；2.重組CPAF與His-tag抗體反應；3.pET-30a對照菌；4.重組CPAF與流產衣原體陽性血清反應。M.Protein Marker；1.pET-30a control；2.Reaction of recombinant CPAF with His-tag anibody；3.pET-30a control；4.Reaction of recombinant CPAF with positive serum.

3 討論

流產衣原體主要寄生于多種動物的生殖系統(tǒng)黏膜上皮細胞中，引起母畜流產、產死胎或弱仔胎，公畜生殖系統(tǒng)炎癥等慢性接觸性傳染病[17]。因流產衣原體感染引起家畜流產在全世界范圍內每年都有發(fā)生，給全球畜牧業(yè)的發(fā)展都造成了較為嚴重的影響[18-20]。在我國，流產衣原體引起綿羊、奶牛、牦牛、豬等家畜流產的報道較多，由此造成經濟損失十分嚴重[14-15]。目前，國內外關于衣原體感染及致病等的研究主要集中在感染人的沙眼衣原體和肺炎衣原體上。沙眼衣原體的CPAF曾被認為能夠降解細胞內與凋亡、抗原呈遞及炎癥反應等相關的關鍵蛋白，在一定程度上揭示了衣原體與宿主細胞互作及致病機制[21-23]。但目前的研究表明，CPAF可中和補體，降解細胞外抗菌肽，增加沙眼衣原體的感染力和致病性[7-8]。沙眼衣原體CPAF在衣原體各物種間均存在同系分子，流產衣原體的CPAF分子為CAB712基因編碼的一個假定蛋白，其蛋白質一級結構與沙眼衣原體和肺炎衣原體的CPAF同源性均為50%左右，N端具有分泌型信號肽，C端具有一個蛋白酶活性結構域，據此推測，它們可能具有相同的生物學功能。因此，深入研究流產衣原體CPAF分子的生物學功能對于揭示流產衣原體的感染及致病機制具有重要意義。另外，研究也表明，流產衣原體的CPAF可與感染流產衣原體的綿羊血清發(fā)生特異性免疫反應[24]，提示該分子可作為動物流產衣原體病的血清學診斷及亞單位疫苗研究的候選抗原分子。

本研究成功克隆流產衣原體GN6株CPAF全長編碼基因，在線生物軟件預測顯示，流產衣原體CPAF蛋白具有較高的親水性，含有多個可能抗原表位，可作為臨床上診斷流產衣原體血清抗體的理想抗原使用。pET-30a(+)為高效原核表達載體，將外源基因插入其NdeⅠ和XhoⅠ之間，所表達的融合蛋白中僅引入一個His標簽，既為融合蛋白的純化提供保障，又不會額外引入冗余的抗原成分，可最大限度地表達抗原。本試驗將流產衣原體CPAF編碼基因連接在pET-30a原核表達載體中，使其與載體末端His-Tag同框融合，成功構建了原核表達載體，并在宿主菌BL21(DE3)中成功誘導表達。通過對誘導條件的優(yōu)化，確定誘導表達的最佳條件為IPTG終濃度1 mmol/L，誘導3 h，可大量獲得重組目的蛋白。Western Blot檢測顯示，重組蛋白能與抗His-Tag的單克隆抗體特異性結合，也能與流產衣原體陽性血清特異性結合，在膠片上顯示出一條特異性條帶，這表明重組蛋白具有良好的反應原性。本試驗為建立動物流產衣原體病的血清學檢測方法提供一種候選抗原。

近年來，動物衣原體性流產在我國的發(fā)生率有逐年增加的趨勢，盡管已有成功研制的衣原體疫苗，但尚未在市場上流通，動物衣原體性流產疫情的防控形勢不容樂觀，因此，疫病的診斷就顯得尤為重要。目前，在我國用于動物衣原體病的臨床診斷方法主要為間接血凝試驗(Indirect haemagglutination assay，IHA)[25]。國內也有以流產衣原體主要外膜蛋白(MOMP)等為抗原開發(fā)的ELISA方法，但尚未在臨床上推廣使用。國外也有以流產衣原體多形外膜的蛋白(POMP)為抗原的針對牛、羊的流產衣原體ELISA試劑盒，可用于臨床大規(guī)模檢測[26]。而成本低、特異性高、操作簡便對動物疫病的診斷非常重要。CPAF蛋白的抗原穩(wěn)定性高，基因在種內高度保守，可作為流產衣原體的特異性檢測抗原使用。所以本試驗對我國流產衣原體分離株(GN6)的CPAF編碼基因序列進行克隆、分析及原核表達，旨在為將來建立動物流產衣原體病的血清學診斷方法奠定基礎。

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