任世龍，楊振立，白 輝，王永芳，全建章，董志平，李志勇，邢繼紅

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 谷子研究所，河北省雜糧重點實驗室，國家谷子改良中心，河北 石家莊 050035；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050051)

由谷瘟病菌引起的谷瘟病是谷子生產(chǎn)中的重要病害之一[1]。近幾年，由于谷子種植品種中抗病品種缺乏及谷瘟病菌生理小種的改變，谷瘟病發(fā)病有逐漸加重的趨勢，在谷子生產(chǎn)上造成嚴(yán)重減產(chǎn)[2]。谷瘟病菌有性態(tài)為Magnaportheoryzae，屬于子囊菌門大角間座殼屬；無性態(tài)為Pyriculariagrisea，屬有絲分裂孢子真菌中的梨孢屬。該梨孢菌除侵染谷子并引致谷瘟病外，還可侵染水稻、大麥、馬唐等多種禾本科作物和雜草[3-4]，寄主為水稻的灰梨孢菌(Magnaportheoryzae)稱為稻瘟病菌。迄今為止，田間仍未發(fā)現(xiàn)谷瘟病菌自然交配形成的有性態(tài)。但是，前人研究表明可以在特定的條件下通過人工配對使稻瘟病菌在培養(yǎng)基上產(chǎn)生子囊孢子[5]。子囊真菌交配型控制菌株的交配親和性及有性生殖，其有性生殖分為同宗配合和異宗配合2種[6-7]。同宗配合的子囊菌的同一株菌株具有2種交配型基因[8]，而異宗配合的大多數(shù)子囊真菌含有一對高度異源的交配型基因座[7]，分別命名為MAT1-1和MAT1-2，其中MAT1-1-1基因中包含一個編碼保守alpha盒子結(jié)構(gòu)域(α-box domain)，而MAT1-2-1編碼高流動蛋白家族(Highly mobility group protein-box，HMG-box)結(jié)構(gòu)域[9-10]。交配型基因編碼蛋白主要作為調(diào)控因子，參與調(diào)控不同交配型菌株在異宗配合時細(xì)胞之間相互識別與融合等過程[11]。通過檢測菌株是否含有MAT1-1-1和MAT1-2-1交配型基因可確定異宗配合的灰梨孢菌交配型[12]。

傳統(tǒng)方法采用標(biāo)準(zhǔn)交配型菌株測定稻瘟病菌交配型，但這種方法具有耗時長，易受溫度、光照及菌株自生育性等因素的影響。近年來，利用PCR分子檢測的方法研究子囊菌的交配型已十分普遍[12-15]。Brewer等[12]利用多重PCR的方法對葡萄白粉病菌的交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1進(jìn)行檢測，明確了不同葡萄白粉病菌菌株的交配型。喬廣行等[13]應(yīng)用PCR技術(shù)檢測灰葡萄孢交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各種植區(qū)交配型菌株所占比例有較大的差異，多數(shù)種植區(qū)灰葡萄孢同時存在這2種交配類型。Sirisathaworn等[14]利用Samanta等[15]設(shè)計的交配型引物對泰國的稻瘟病菌進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，所有供試稻瘟病菌株屬于交配型MAT1-2，表明群體內(nèi)缺乏有性重組。史文琦等[16]根據(jù)白粉病菌的MAT1-1-1與MAT1-2-1部分基因序列設(shè)計并篩選特異性引物，利用PCR擴(kuò)增檢測了516株小麥白粉病菌菌株的交配型，結(jié)果顯示在不同地區(qū)均能檢測出2種交配型基因，且28個地區(qū)的2種交配型菌株約為1∶1。

谷瘟病菌與稻瘟病菌存在寄主?；?，我國不同谷子產(chǎn)區(qū)谷瘟病菌交配型基因類型的分布尚未見報道，為明確我國谷子產(chǎn)區(qū)谷瘟病菌包含的交配型基因及其分布情況，本研究根據(jù)已知的稻瘟病菌交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1的部分序列設(shè)計特異性引物，利用PCR技術(shù)對我國不同采集地的谷瘟病菌的交配型基因進(jìn)行檢測，通過分析不同谷子產(chǎn)區(qū)谷瘟病菌的不同交配型菌株的分布頻率，可用于推測田間谷瘟病菌菌株有性生殖發(fā)生的可能性，為谷瘟病的有效防治提供重要指導(dǎo)作用，同時為進(jìn)一步闡明谷瘟病菌的遺傳變異機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

2010-2016年從河北、山東、山西、陜西、吉林、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、新疆和海南等地采集，經(jīng)過室內(nèi)分離純化后得到的谷瘟病菌單孢菌株186株。

1.2 谷瘟病菌基因組DNA的提取

將谷瘟病菌在PDA固體培養(yǎng)基活化，轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，室溫靜止培養(yǎng)8 d，收集菌絲，采用常規(guī)CTAB法提取谷瘟病菌的基因組DNA。用1.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量及完整性，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 谷瘟病菌菌株交配型基因特異性引物的設(shè)計及篩選

根據(jù)已知稻瘟病菌的交配型基因MAT1-1-1(GenBank登錄號AB080672.2)和MAT1-2-1(GenBank登錄號AB080673.2)的部分基因序列分別設(shè)計3對特異性引物，引物序列參見表1。隨機(jī)挑選16株谷瘟病菌菌株的DNA進(jìn)行特異性引物的篩選，PCR反應(yīng)體系包括2 × Ex Taq Master Mix 12.5 μL，引物各0.5 μL，模板DNA 2 μL(≤200 ng)，ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。擴(kuò)增程序為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min共25次循環(huán)；72 ℃ 6 min。1.2%瓊脂糖凝膠，恒壓110 V電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。通過對部分目的條帶切膠回收，克隆測序確定為非特異性引物，最終篩選得到特異性較好的2對引物，并對提取的186個不同區(qū)域谷瘟病菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測，擴(kuò)增及電泳條件同上。挑選不同交配型谷瘟病菌菌株各4株進(jìn)行克隆測序及比對分析，用于比對分析的稻瘟病菌為菌株Y93-164g-1(GenBank登錄號AB080672.2)。

表1 交配型基因的引物序列Tab.1 Primers sequence of mating type genes

2 結(jié)果與分析

2.1 谷瘟病菌交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1特異性引物的篩選

隨機(jī)挑選16株谷瘟病菌菌株的DNA，進(jìn)行谷瘟病菌交配型基因特異性引物的篩選。檢測結(jié)果如圖1所示，因此，試驗確定引物對JPX1-1-S3/JPX1-1-A3和JPX1-2-S1/JPX1-2-A1為檢測谷瘟病菌交配型基因MAT1-1-1和與MAT1-2-1的特異性引物并利用這對特異性引物對提取的186株不同區(qū)域谷瘟病菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測。

2.2 谷瘟病菌與稻瘟病菌交配型基因編碼蛋白的比對分析

利用2對特異性引物(JPX1-1-S1/JPX1-1-A1和JPX1-1-S3/JPX1-1-A3)克隆了4株谷瘟病菌交配型基因MAT1-1-1的alpha盒子結(jié)構(gòu)域(圖1)并對谷瘟病菌與稻瘟病菌交配型基因MAT1-1-1的alpha盒子結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷瘟病菌菌株交配型基因MAT1-1-1的alpha盒子結(jié)構(gòu)域不存在變異。以HBhd1菌株為代表(GenBank登錄號MF993977)，與已知稻瘟病菌參考菌株Y93-164g-1(GenBank登錄號AB080672.2)的比對發(fā)現(xiàn)，僅在第172位氨基酸存在差異，前者為賴氨酸，后者為谷氨酸(圖2)。利用特異性引物(JPX1-2-S1/JPX1-2-A1)克隆了4株谷瘟病菌交配型基因MAT1-2-1的高遷移率蛋白盒子部分序列，比對表明谷瘟病菌之間并不存在變異，以谷瘟病菌菌株SD1(GenBank登錄號MF993976)的MAT1-2-1的高遷移率蛋白盒子結(jié)構(gòu)域與稻瘟病菌參考菌株Y93-164a-1(GenBank登錄號AB080673.2)之間比對發(fā)現(xiàn)，兩者存在2個位點的差異，分別在77位與438位的氨基酸處，+77位為酪氨酸/組氨酸、+438位為脯氨酸/精氨酸(圖3)，表明谷瘟病菌與稻瘟病菌之間存在差異，及進(jìn)一步研究谷瘟病菌交配型基因的必要性。

M.DL2000 Marker；CK.陰性對照(ddH2O)；1～16.谷瘟病菌菌株樣本。 M.Marker；CK.Negative control(ddH2O)；1-16.DNA samples of Magnaporthe oryzae isolates.

圖2 谷瘟病菌與稻瘟病菌的MAT1-1-1 alpha盒子部分氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of MAT1-1-1 alpha-box partial amino acid sequences of Magnaporthe oryzae of Foxtail millet and Magnaporthe oryzae of rice

圖3 谷瘟病菌與稻瘟病菌的MAT1-2-1高遷移率蛋白盒子部分氨基酸序列比對

2.3 不同地區(qū)谷瘟病菌交配型類型及分布頻率

利用谷瘟病菌交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1的特異性引物對谷瘟病菌交配型基因MAT1-1-1和MAT1-2-1的部分基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，檢測結(jié)果分別用于鑒定交配型基因座 MAT1-1與MAT1-2不同類型的菌株。PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明：谷瘟病菌交配型基因MAT1-1-1引物擴(kuò)增得到大小為713 bp單一條帶(圖4)，MAT1-2-1引物擴(kuò)增得到 809 bp單一條帶(圖5)。通過比對圖4與圖5可知，谷瘟病菌菌株2號、5號和15號(菌株分別為HBsjz1、HN2和HBxt1)為雙交配型菌株。

通過PCR 技術(shù)對谷瘟病菌交配型進(jìn)行地理分布類型檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，186個谷瘟病菌菌株中，交配型為MAT1-1的谷瘟病菌共101株，占比54.30%；交配型為MAT1-2的谷瘟病菌共75株，占比40.32%，總體上接近1∶1；同時具有MAT1-1和MAT1-2的雙交配型菌株共10株，占5.38%。除黑龍江與內(nèi)蒙古地區(qū)只含有單一的交配型菌株外，其余各地區(qū)均含有2種交配型基因。各種植區(qū)間兩交配型菌株所占的比例有較大差異，其中夏谷區(qū)不同交配型菌株所占比例存在明顯差異，其交配型為MAT1-1的谷瘟病菌占69.15%，而交配型為MAT1-2的菌株僅占26.60%，其余4.25%菌株為雙交配型菌株，出現(xiàn)在河北和河南地區(qū)；春谷區(qū)谷瘟病菌交配型基因MAT1-1占38.55%，而交配型MAT1-2占比為56.63%，其余4.82%菌株為雙交配型菌株，出現(xiàn)在山西、陜西及遼寧地區(qū)，但總體水平上谷瘟病菌的2種交配型保持平衡狀態(tài)(表 2)。對表2數(shù)據(jù)分析可知，不同地區(qū)交配型菌株分布也不同，如遼寧MAT1-2交配型菌株占比為50%，吉林省MAT1-2交配型菌株占比75%，黑龍江MAT1-2交配型菌株占比100%。

M.DL2000 Marker；713 bp.MAT1-1-1基因條帶；1～24菌株編號:HBcd1、HBsjz1、SD2、JL1、HN2、Sx4、Sx3、SD1、Hn2、Hn1、LN1、HBhd1、HBxt2、HBsjz2、HBxt1、Sx2、HBxt3、SX1、SX2、HBsjz4、XJ1、XJ2、HLJ1、HN6。圖5同。M.DL2000 Marker；713 bp.MAT1-1-1；1-24.The following isolates in order：HBcd1，HBsjz1，SD2，JL1，HN2，Sx4，Sx3，SD1，Hn2，Hn1，LN1，HBhd1，HBxt2，HBsjz2，HBxt1，Sx2，HBxt3，SX1，SX2，HBsjz4，XJ1，XJ2，HLJ1，HN6.The same as Fig.5.

M.DL2000 Marker；809 bp.MAT1-2-1基因條帶。M.DL2000 Marker;809 bp.MAT1-2-1.

采集地點Location菌株數(shù)No.MAT1-1MAT1-2MAT1-1和MAT1-2MAT1-1 and MAT1-2菌株數(shù)No.頻率/%Frequency菌株數(shù)No.頻率/%Frequency 菌株數(shù)No.頻率/%Frequency 夏谷區(qū) 河北保定844.2644.2600.00Summer sowing region河北張家口222.1300.0000.00河北邢臺211414.8966.3811.06河北石家莊1366.3866.3811.06河北邯鄲131212.7711.0600.00河北滄州222.1300.0000.00河南211718.0922.1322.13山東1488.5166.3800.00合計946569.152526.6044.25春谷區(qū)山西2589.641619.2811.20Spring sowing region陜西1267.2344.8222.41吉林411.2033.6100.00黑龍江500.0056.0200.00遼寧1467.2378.4311.20內(nèi)蒙古333.6100.0000.00新疆422.4122.4100.00河北承德1256.0278.4300.00北京411.2033.6100.00合計833238.554756.6344.82海南Hainan9444.44333.33222.22合計Total18610154.307540.32105.38

3 討論

Hebert[17]從馬唐(DigitariasanguinalisL.)上分離到灰梨孢菌(P.grsiea)，并在人工培養(yǎng)基上成功的誘發(fā)形成子囊殼。隨后Barr[18]根據(jù)稻瘟病菌的形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞學(xué)特征及寄主范圍等多方面來分析，將稻瘟病菌的有性世代修正為Magnaporthegrisea。Couch等[19]根據(jù)稻瘟病菌(M.grisea)的肌動蛋白、β微管蛋白和鈣調(diào)素等基因基于系統(tǒng)發(fā)育分析，將從馬唐中分離株(馬唐瘟菌)有性態(tài)稱為Magnaporthegrisea。其他來自禾本科植物包括水稻和谷子的分離株(灰梨孢菌)有性態(tài)統(tǒng)一命名為新物種Magnaportheoryzae。李成云等[20]對稻瘟病菌有性世代形成能進(jìn)行研究，通過單胞菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株雜交證明MAT1-1型有較強(qiáng)的有性世代形成能力，單株培養(yǎng)能產(chǎn)生子囊殼證明稻瘟病菌是從同宗配合進(jìn)化到異宗配合的。交配型基因(Mating type gene，MAT)作為調(diào)控真菌有性生殖的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，在子囊菌中廣泛存在[21-22]。近年來，關(guān)于交配型基因結(jié)構(gòu)和功能及基于分子進(jìn)化的親緣關(guān)系研究有諸多報道[23-25]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來更多的植物病原菌的交配型通過PCR技術(shù)進(jìn)行了分子測定[13-14，16]。與傳統(tǒng)的方法相比，PCR技術(shù)具有更快速、準(zhǔn)確、可靠的特點。

我國不同谷子產(chǎn)區(qū)谷瘟病菌交配型基因類型的分布尚未見報道，關(guān)于稻瘟病菌交配型基因的相關(guān)研究也都集中在南方地區(qū)。本研究首次利用PCR技術(shù)對來自我國河北、山東、山西、陜西、吉林、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、新疆和海南等不同谷子種植區(qū)186個谷瘟病菌菌株的交配型進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAT1-1、MAT1-2以及雙交配型分別占54.30%，40.32%，5.38%，交配型MAT1-1、MAT1-2總體接近1∶1的比例，推測其原因可能是谷瘟病菌在自然界中存在有性世代。不同省份谷子種植區(qū)中除黑龍江與內(nèi)蒙古外均含有2種交配型基因，黑龍江與內(nèi)蒙古只含有單一的交配型菌株，原因可能為無性分生孢子繁殖占主導(dǎo)地位，也可能是該地區(qū)地理環(huán)境特異性導(dǎo)致。如黑龍江省屬于春谷區(qū)的最北端，是我國谷子栽培區(qū)域的北限，該區(qū)具有氣候寒冷、無霜期短等環(huán)境特征，可能會對谷瘟病菌交配型基因的類型產(chǎn)生影響。以東北三省為例，從南向北遼寧MAT1-2交配型菌株所占比例50%<吉林省MAT1-2交配型菌株所占比例75%<黑龍江MAT1-2交配型菌株所占比例100%。不同谷子種植生態(tài)區(qū)中，谷瘟病菌不同交配型菌株所占比例有較大差異，夏谷區(qū)尤為明顯，其中谷瘟病菌交配型基因MAT1-1占69.15%，而交配型MAT1-2僅占26.60%。春谷區(qū)谷瘟病菌交配型基因MAT1-1占38.55%，而交配型MAT1-2占比為56.63%。春谷區(qū)與夏谷區(qū)中雙交配型菌株占比差別不大分別為4.25%與4.82%。這種不同生態(tài)種植區(qū)存在的交配型菌株的偏好性還需要更多谷瘟病菌菌株進(jìn)行驗證。在河北、河南、山西和陜西等谷子種植區(qū)發(fā)現(xiàn)了雙交配型的谷瘟病菌菌株，谷瘟病菌中雙交配型菌株的發(fā)現(xiàn)證實谷瘟病菌是由同宗配合進(jìn)化到異宗配合的，谷瘟病菌在自然界中可能存在有性世代。通過對谷瘟病菌與稻瘟病菌的交配型基因MAT1-1的alpha盒子部分氨基酸序列和MAT1-2高遷移率蛋白盒子氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，兩者親緣關(guān)系極為接近，但序列并不完全相同，任世龍等[26]對谷瘟病菌和稻瘟病菌IGS序列研究同樣表明，兩者親緣關(guān)系很近，但存在超越種內(nèi)之間的差異。2對引物可完成對186株谷瘟病菌交配型基因的檢測，其余2對MAT1-1-1引物的互補(bǔ)驗證結(jié)果表明，這2對引物特異性較好。史文琦等[16]對利用PCR方法鑒定的不同交配型小麥白粉菌株隨機(jī)選取16個進(jìn)行配對接種，16個雜交組合都能產(chǎn)生閉囊殼，證實了PCR檢測交配型基因的可靠性。

本研究建立了快速PCR檢測谷瘟病菌交配型的方法，通過分子生物學(xué)方法快速測定谷瘟病菌菌株交配型的類型，可對不同交配型遺傳背景的谷瘟病菌進(jìn)行室內(nèi)有目的的有性雜交，對基于不同交配型遺傳背景的谷瘟病菌群體結(jié)構(gòu)與遺傳分化分析具有重要意義。但是對谷瘟菌株交配型鑒定需要通過2對引物擴(kuò)增，分別電泳檢測，步驟比較繁瑣，今后可以摸索建立多重PCR檢測體系，可以更加快速檢測谷瘟病菌交配型基因。另外不同谷瘟病菌即使有不同交配型，也不一定形成有性世代，因此對本研究確定的不同交配型還需要進(jìn)一步對峙培養(yǎng)，以確定其育性。通過有性生殖產(chǎn)生新的遺傳重組后代，是植物病原真菌變異進(jìn)化的重要來源之一，所以了解谷瘟病菌的不同交配型菌株的分布頻率，可用于推測田間谷瘟病菌菌株有性生殖發(fā)生的可能性，這對于該病害的有效防治具有非常重要的指導(dǎo)作用。

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