郝 斐，閆 瑋，郭曉東，朱 兵，劉東軍

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.烏蘭察布市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000)

阿爾巴斯絨山羊是我國(guó)優(yōu)秀的絨山羊品種之一，以其具有潔白、柔軟和纖細(xì)的羊絨而享譽(yù)全球，具有非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但是由于其產(chǎn)量不足，多年來(lái)限制了羊絨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了提升羊絨產(chǎn)業(yè)在我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中的重要地位，對(duì)絨山羊進(jìn)行改良，提升羊絨的產(chǎn)量和品質(zhì)已經(jīng)迫在眉睫。搞清楚羊絨的生長(zhǎng)機(jī)制是我們面臨的首要問(wèn)題。依據(jù)絨山羊皮膚毛囊的發(fā)生時(shí)間和結(jié)構(gòu)特征不同，將其劃分為初級(jí)毛囊和次級(jí)毛囊2種。其中，初級(jí)毛囊發(fā)育形成羊毛，次級(jí)毛囊發(fā)育形成羊絨[1-2]。毛囊是控制毛發(fā)生長(zhǎng)的復(fù)雜皮膚輔助器官，它由表皮和真皮2個(gè)部分組織組成[3]，其結(jié)構(gòu)包括毛球、毛干、內(nèi)根鞘、外根鞘和結(jié)締組織鞘5個(gè)部分[4]。毛球由真皮毛乳頭和毛發(fā)基質(zhì)組成。真皮毛乳頭細(xì)胞位于毛囊底部，它們分泌各種細(xì)胞因子以調(diào)節(jié)鄰近組織，從而調(diào)節(jié)毛發(fā)的生長(zhǎng)和更新[5]。因此，真皮毛乳頭細(xì)胞被大家認(rèn)為是毛囊的“指揮中心”[6]。所以，真皮毛乳頭細(xì)胞可以用作研究毛囊生長(zhǎng)和周期性變化的細(xì)胞模型。

MSX基因?qū)儆贖ox基因家族成員。在脊椎動(dòng)物中MSX分為3種亞形，分別為MSX1、MSX2和MSX3。它們?cè)诩棺祫?dòng)物的皮膚、心臟、乳腺等多個(gè)器官的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。有研究表明，MSX2基因調(diào)控了皮膚中上皮和間充質(zhì)之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響了毛囊的形態(tài)發(fā)生和周期性變化。過(guò)表達(dá)MSX2轉(zhuǎn)基因小鼠，表皮因過(guò)度增殖而變厚，毛發(fā)短且髓質(zhì)干癟。而MSX2基因敲除小鼠的毛母質(zhì)細(xì)胞減少，毛干形成異形，并且在脫毛后再進(jìn)入生長(zhǎng)期會(huì)發(fā)生延遲。因此，MSX2可以獨(dú)立地調(diào)節(jié)毛囊進(jìn)入生長(zhǎng)期[9]。也有研究者發(fā)現(xiàn)，MSX2在毛囊的基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，當(dāng)MSX2缺乏時(shí)，小鼠會(huì)產(chǎn)生彎曲毛發(fā)[10]。由此認(rèn)為，MSX2基因?qū)γl(fā)生長(zhǎng)是必需的，它對(duì)毛囊的生長(zhǎng)和周期性變化具有調(diào)控作用。本研究旨在探究MSX2基因?qū)q山羊真皮毛乳頭細(xì)胞增殖能力的調(diào)控。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

山羊皮膚樣本由內(nèi)蒙古億維白絨山羊有限責(zé)任公司提供，pSIREN-RetroQ-ZsGreen質(zhì)粒和pDsRed2質(zhì)粒在內(nèi)蒙古大學(xué)省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、PBS、0.25%胰酶(Trypsin)購(gòu)自Hyclone；冷凍保護(hù)劑(DMSO)購(gòu)自日本和光；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrigen；質(zhì)粒大提試劑盒EndoFree?Plasmid Maxi Kit購(gòu)自QIAGEN，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser、實(shí)時(shí)定量PCR試劑SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自TaKaRa。α-SMA和CD133抗體購(gòu)自Boster Biotech，MSX2、LEF-1、cyclin D1、β-actin抗體均購(gòu)自abcam。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 絨山羊真皮毛乳頭細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 2017年9月于毛囊生長(zhǎng)期，在內(nèi)蒙古億維白絨山羊有限責(zé)任公司的種羊場(chǎng)中，選擇2～3歲的雌性絨山羊作為皮膚樣本收集的對(duì)象。剃毛消毒后，切取腹部皮膚組織(1～2 cm2)，通過(guò)機(jī)械法分離單根毛囊，然后用濃度為2 g/L的Ⅱ型膠原酶處理上述游離的毛囊約1 h，再通過(guò)機(jī)械分離法分離出真皮毛乳頭細(xì)胞。最后用含有10% 新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌2～3遍，接種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2，100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到80%時(shí)，凍存一部分細(xì)胞，將其他細(xì)胞傳代培養(yǎng)[11]。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué) 免疫細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)的目的主要是對(duì)分離得到的山羊真皮毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將真皮毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)在載玻片上。待細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)匯合度達(dá)90%時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行試驗(yàn)。首先用0.01 mol/L PBS將上述待處理的細(xì)胞清洗3遍，洗去死細(xì)胞和培養(yǎng)液，然后用4%的多聚甲醛于4 ℃孵育30 min進(jìn)行固定處理。固定好的細(xì)胞再用0.01 mol/L PBS清洗3遍，然后用0.5% Triton X-100進(jìn)行通透處理10 min，再用0.01 mol/L PBS清洗3遍。而后用含有5% BSA的PBS 4 ℃過(guò)夜處理上述通透好的細(xì)胞，目的是為了避免抗體的非特異性結(jié)合。再用α-SMA(1∶100 稀釋；Boster Biotech)和CD133(1∶100 稀釋；Boster Biotech)抗體4 ℃過(guò)夜處理上述細(xì)胞。再用0.01 mol/L PBS清洗3遍，再用帶有綠色熒光的二抗37 ℃ 60 min處理上述細(xì)胞。然后用1 mg/L的DAPI染細(xì)胞核5 min。最后將上述處理完畢的細(xì)胞置于載玻片上封片，通過(guò)共聚焦顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞熒光拍攝。

1.2.3 質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 將擴(kuò)增完整的MSX2基因CDS序列通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)連入pDsRed2骨架質(zhì)粒中，完成MSX2的過(guò)表達(dá)載體。同時(shí)也設(shè)計(jì)并完成了骨架載體為pSIREN-RetroQ-ZsGreen的干擾載體的構(gòu)建，干擾片段為5′-GCGGAAACACAAGACCAAT-3′。將上述構(gòu)建好的載體經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)正確后通過(guò)Lipofectamine 2000對(duì)真皮毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后觀察熒光效果，同時(shí)收集上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于下游的試驗(yàn)。

1.2.4 真皮毛乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 取上述生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，按每孔5×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度傳代培養(yǎng)。之后每間隔24 h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)一次，每次計(jì)數(shù)3孔細(xì)胞，計(jì)算平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d。最終根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 Real-time PCR 將上述各組試驗(yàn)細(xì)胞用RNAiso Plus(TaKaRa Biotechnology，Dalian，China)試劑提取總RNA，然后用gDNA Eraser處理提取總RNA，目的是為了去除基因組DNA對(duì)之后試驗(yàn)的干擾，然后取等量的上述各組細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，制備各樣本的cDNA。Real-time PCR試驗(yàn)中選擇GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，用于修正試驗(yàn)數(shù)據(jù)?；騇SX2、LEF-1、cyclinD1、GAPDH的引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。Real-time PCR 試驗(yàn)以SYBR Premix ExTaq酶 (TaKaRa，Dalian，China)，通過(guò)iQ5 系統(tǒng) (Bio-Rad，Hercules，CA，USA)來(lái)完成。通過(guò)用2-ΔΔCt方法來(lái)比較各基因的Ct值，從而完成對(duì)上述樣本中各基因的相對(duì)表達(dá)量分析。

表1 Real-time PCR反應(yīng)各基因引物Tab.1 Primers for Real-time PCR

1.2.6 Western Blot 提取上述各試驗(yàn)細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，選取等量的蛋白進(jìn)行試驗(yàn)。首先用MSX2(1∶500 稀釋；abcam)、LEF-1(1∶500稀釋；abcam)、cyclin D1(1∶500稀釋；abcam)、β-actin(1∶500稀釋；abcam)抗體對(duì)各樣本的蛋白質(zhì)膜4%孵育過(guò)夜處理，然后用二抗(1∶1 000稀釋；abcam)處理。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)通過(guò)Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真皮毛乳頭細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定

本研究這2種細(xì)胞在體外培養(yǎng)中呈長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)5～7 d，這2種細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)凝集生長(zhǎng)現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行α-SMA 和 CD133表面標(biāo)記的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均為陽(yáng)性。由此說(shuō)明，分離得到的細(xì)胞即為山羊的毛乳頭細(xì)胞(圖1)。

圖1 山羊真皮毛乳頭細(xì)胞的鑒定Fig.1 Identification of Cashmere goat DPCs

2.2 真皮毛乳頭細(xì)胞的過(guò)表達(dá)載體和干擾載體轉(zhuǎn)染

分別對(duì)初級(jí)毛乳頭細(xì)胞和次級(jí)毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行MSX2過(guò)表達(dá)載體和干擾載體的轉(zhuǎn)染。通過(guò)熒光的表達(dá)情況監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率(圖2)。通過(guò)Real-time PCR完成對(duì)各樣本中MSX2基因和其他各相關(guān)基因的mRNA表達(dá)檢測(cè)，用2-ΔΔCt方法比較各基因的Ct值，根據(jù)比較結(jié)果從而完成對(duì)各個(gè)試驗(yàn)組中各基因的相對(duì)表達(dá)量的分析。在結(jié)果分析中以未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的細(xì)胞作為試驗(yàn)對(duì)照組，在初級(jí)毛乳頭細(xì)胞MSX2表達(dá)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)試驗(yàn)組的MSX2表達(dá)量是對(duì)照的11.85倍，干擾試驗(yàn)組MSX2表達(dá)量是對(duì)照的0.31倍。同時(shí)，在次級(jí)毛乳頭細(xì)胞MSX2表達(dá)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)試驗(yàn)組的MSX2表達(dá)量是對(duì)照的10.59倍，在干擾試驗(yàn)組中MSX2表達(dá)量是對(duì)照的0.45倍(圖3)。本研究結(jié)果表明，在真皮毛乳頭細(xì)胞中，MSX2基因的過(guò)表達(dá)和干擾細(xì)胞系已被成功建立。

2.3 MSX2在真皮乳頭細(xì)胞增殖中激活了LEF-1和 cyclin D1基因的表達(dá)

A．真皮毛乳頭細(xì)胞；B.轉(zhuǎn)染MSX2過(guò)表達(dá)載體的真皮毛乳頭細(xì)胞；C.轉(zhuǎn)染MSX2干擾載體的真皮毛乳頭細(xì)胞。A.Dermal papilla cells；B.DPCs transfected with the MSX2-overexpressing vector；C.DPCs transfected with the MSX2-interference vector.

圖中不同小寫字母表示不同實(shí)驗(yàn)組間基因表達(dá)差異顯著水平(P<0.05)。Different letters represent significant difference in gene expression(P<0.05).

通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)了MSX2、LEF-1和cyclinD1基因的表達(dá)情況，研究表明，當(dāng)MSX2過(guò)表達(dá)時(shí)，LEF-1和cyclinD1的表達(dá)量也隨之增加。在MSX2干擾試驗(yàn)組中，LEF-1和cyclinD1的表達(dá)量也隨之減少，并且也發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在初級(jí)毛乳頭細(xì)胞還是次級(jí)毛乳頭細(xì)胞中都具有同樣的表達(dá)趨勢(shì)(圖3)。同時(shí)在Western Blot試驗(yàn)中得到的結(jié)果與Real-time PCR檢測(cè)的結(jié)果一致(圖4)。LEF-1蛋白和cyclin D1蛋白的表達(dá)量隨MSX2蛋白的表達(dá)量的增加而增加，隨 MSX2蛋白表達(dá)量的減少而減少，這樣進(jìn)一步印證了Real-time PCR的試驗(yàn)結(jié)果。

2.4 MSX2對(duì)真皮毛乳頭細(xì)胞增殖的影響

1.真皮毛乳頭細(xì)胞；2.轉(zhuǎn)染MSX2干擾載體的真皮毛乳頭細(xì)胞；3.轉(zhuǎn)染MSX2過(guò)表達(dá)載體的真皮毛乳頭細(xì)胞。1．Dermal papilla cells；2.DPCs transfected with the MSX2-interference vector；3.DPCs transfected with the MSX2-overexpressing vector.

通過(guò)各細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線可以發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)3 d后各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線表現(xiàn)差異，MSX2基因過(guò)表達(dá)試驗(yàn)組和干擾試驗(yàn)組分居對(duì)照組兩側(cè)。隨著MSX2基因表達(dá)量的增加，細(xì)胞的增殖速度有所增加，而MSX2基因干擾試驗(yàn)組中細(xì)胞的生長(zhǎng)速度慢于對(duì)照試驗(yàn)組。由此說(shuō)明，MSX2基因的過(guò)表達(dá)促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖能力提高，而MSX2基因的下調(diào)使得毛乳頭細(xì)胞增殖能力下降(圖5)。

圖5 真皮毛乳頭細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig.5 The growth curve of dermal papilla cells

3 討論與結(jié)論

毛囊是皮膚組織中復(fù)雜的亞器官結(jié)構(gòu)，它經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)期、退行期和休止期周期性生長(zhǎng)[12]。毛囊發(fā)生時(shí)位于其基板處的間充質(zhì)細(xì)胞凝聚，緊緊包裹基底細(xì)胞形成了真皮毛乳頭細(xì)胞。真皮毛乳頭細(xì)胞與其周圍細(xì)胞相互作用形成毛球。因此，真皮毛乳頭細(xì)胞被視為毛囊的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中心[13]。所以，本研究選擇真皮毛乳頭細(xì)胞作為細(xì)胞模型來(lái)探究影響毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中相關(guān)信號(hào)分子的調(diào)節(jié)作用。

本研究的目的基因MSX2是參與毛囊發(fā)育和毛干分化過(guò)程中重要的信號(hào)因子之一。MSX2基因在動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中參與并維持了各組織的生長(zhǎng)發(fā)育，它屬于同源異形盒基因家族的成員之一[14-15]。有研究表明，當(dāng)MSX2基因的表達(dá)異常時(shí)，會(huì)使得動(dòng)物皮膚毛囊生長(zhǎng)發(fā)育異常[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，MSX2敲除小鼠脫發(fā)不是由于毛干的斷裂，而是由于整個(gè)毛球的異常。毛球的異常可能是毛乳頭或毛母質(zhì)發(fā)生了異常，因?yàn)樵诿业耐暾Y(jié)構(gòu)中，毛球部分包括真皮毛乳頭細(xì)胞和毛母質(zhì)，其中真皮毛乳頭誘導(dǎo)毛母質(zhì)增殖分化最終形成毛干。還有研究證明，MSX2的缺失將導(dǎo)致構(gòu)成毛干的三層細(xì)胞的缺失，推測(cè)MSX2能夠調(diào)控毛母質(zhì)細(xì)胞的分化，因?yàn)镸SX2在毛母質(zhì)擴(kuò)增遷移成為前皮質(zhì)細(xì)胞和隨后分化成毛發(fā)的區(qū)域中表達(dá)。MSX2不僅參與調(diào)節(jié)毛母質(zhì)細(xì)胞和前皮質(zhì)細(xì)胞之間的分化，還調(diào)控毛發(fā)周期的不同階段之間的轉(zhuǎn)換，影響了毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[17]。因此，本研究就是討論MSX2對(duì)真皮毛乳頭細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，MSX2基因參與真皮毛乳頭細(xì)胞的增殖調(diào)控。在真皮毛乳頭細(xì)胞中，隨著MSX2表達(dá)量的增加，細(xì)胞的增殖能力有所增加；相反，當(dāng)MSX2表達(dá)量減少，細(xì)胞的增殖能力有所下降。這就有力地說(shuō)明MSX2基因在毛乳頭細(xì)胞的增殖過(guò)程中發(fā)揮著一定作用。毛囊的形態(tài)發(fā)生和周期性變化受到多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)，包括：Wnt、Shh、Notch、BMP等[18]。在這些信號(hào)通路中，Wnt信號(hào)通路與毛囊生長(zhǎng)和發(fā)育以及細(xì)胞周期維持密切相關(guān)，所以本研究也重點(diǎn)檢測(cè)了Wnt信號(hào)通路中關(guān)鍵的幾個(gè)信號(hào)分子的表達(dá)變化情況[19]。LEF-1是Wnt信號(hào)通路中關(guān)鍵的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，它們?cè)诿业纳L(zhǎng)發(fā)育和周期性變化中作用顯著，任何表達(dá)異常，都會(huì)使得毛囊生長(zhǎng)發(fā)生變化。研究表明，MSX2的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的活化，進(jìn)而促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。還有研究發(fā)現(xiàn)，MSX2的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致DKK1的表達(dá)減少，從而促進(jìn)Wnt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明，MSX2可以激活Wnt信號(hào)通路，被激活的Wnt信號(hào)通路使得細(xì)胞內(nèi)β-catenin積累并轉(zhuǎn)移進(jìn)入了細(xì)胞核中，LEF-1作為轉(zhuǎn)錄因子與β-catenin結(jié)合，完成轉(zhuǎn)錄功能，對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控[20-21]。cyclinD1是Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)靶基因，它是一個(gè)重要的細(xì)胞周期蛋白，通過(guò)介導(dǎo)CDK4和CDK6調(diào)節(jié)細(xì)胞從G1期向S期的增殖[22]。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，隨著MSX2基因表達(dá)量的增加，LEF-1、cyclinD1基因的表達(dá)量也會(huì)同步增加，最終促進(jìn)了真皮毛乳頭細(xì)胞的增殖。這就表明在真皮毛乳頭細(xì)胞的增殖過(guò)程中，MSX2基因的表達(dá)變化引發(fā)了Wnt信號(hào)通路中LEF-1的表達(dá)變化，進(jìn)而對(duì)cyclinD1基因的表達(dá)產(chǎn)生了影響，最終調(diào)節(jié)了真皮毛乳頭細(xì)胞的增殖。

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