王俊斌，楊文麗，丁 博，吳天文，王海鳳，謝曉東

(1.天津農(nóng)學(xué)院 天津-布里斯托環(huán)境變化對農(nóng)作物影響研究中心，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384；3.天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)業(yè)分析測試中心，天津 300384)

轉(zhuǎn)錄因子作為基因表達的調(diào)控者，在植物的適應(yīng)機制中扮演非常重要的角色。植物通過轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子中的順式元件特異結(jié)合，從而激活或抑制基因的表達，參與代謝過程或啟動防衛(wèi)反應(yīng)。WRKY是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與植物多種生命活動過程，包括萌發(fā)、生長發(fā)育、衰老、生物或非生物脅迫反應(yīng)等。其名稱源于序列中包含一段由約60個氨基酸殘基組成的高度保守的 WRKY結(jié)構(gòu)域，這段區(qū)域包括 N 端的WRKYGQK 序列和C端的鋅指結(jié)構(gòu)，能夠與靶基因啟動子區(qū)域中的 W 盒 TTGACC/T核苷酸序列特異性結(jié)合，進而調(diào)控下游目標(biāo)基因的表達[1-2]。根據(jù) WRKY 保守域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的類型，WRKY 蛋白可分為 3 種類型，其中，Ⅰ型蛋白包含 2 個 WRKYGQK 序列和C2H2鋅指結(jié)構(gòu)；Ⅱ型蛋白包含 1 個 WRKYGQK和 C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，依據(jù)其結(jié)構(gòu)特征可進一步分為 5 個亞組(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe)；Ⅲ型蛋白含有一個 WRKY 保守域，其鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC[1-2]。

WRKY 蛋白在植物的多種生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，包括高等植物的生長發(fā)育、各種脅迫反應(yīng)和代謝等過程。而且，這些調(diào)控作用往往與水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和脫落酸(ABA)等激素介導(dǎo)的信號途徑相互聯(lián)系在一起。研究表明，在不同的生物學(xué)功能中，WRKY蛋白起激活子或抑制子的作用[3-5]。除了調(diào)控植物抗病反應(yīng)外，許多WRKY基因的表達受干旱、高溫、冷害及高鹽等逆境因子誘導(dǎo)表達。因此，普遍認(rèn)為，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與植物非生物脅迫應(yīng)答過程，并在逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中扮演正/負(fù)調(diào)控因子的關(guān)鍵角色[5-8]。例如，擬南芥AaWRKY39在SA和JA介導(dǎo)的熱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮正調(diào)控作用，而擬南芥AtWRKY25和AtWRKY33參與植株對高溫和鹽脅迫的耐性[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)，過表達水稻OsWRKY45基因提高了植株的抗病能力及耐鹽抗旱能力[12]。過表達大豆GmWRKY13、GmWRKY21和GmWRKY54增強植物對多種非生物逆境脅迫的耐受性[13]。

對模式植物耐受脅迫機理的研究，揭示了WRKY轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)答過程中的中心調(diào)控作用。作為重要的糧食作物，小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控非生物脅迫的機理研究卻相對滯后。主要原因是小麥的基因組龐大而復(fù)雜，全基因組測序還沒有完成，而且轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系效率相對較低。盡管如此，小麥WRKY基因克隆及功能研究也取得了一定進展。在擬南芥中過表達小麥TaWRKY51，可以增加擬南芥對ABA、干旱和鹽脅迫處理的敏感性，推測TaWRKY51可能在植物響應(yīng)非生物脅迫信號傳導(dǎo)過程中起負(fù)調(diào)控作用[14]。另一個小麥TaWRKY35基因過表達植株的耐鹽性顯著提高[15]。Wu等[16]報道，有2個小麥WRKY基因(TaWRKY19a和TaWRKY71)的表達受熱脅迫誘導(dǎo)。將小麥TaWRKY10在煙草中異源表達能夠提高植株對多種非生物脅迫的耐性[17]。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是一類龐大的家族，并且功能多樣，調(diào)控機理復(fù)雜。迄今為止，小麥WRKY基因與抗逆關(guān)系的研究報道還較少。因此，需要從小麥中克隆更多的WRKY基因并闡明其作用機制。

本研究從小麥中克隆一個TaWRKY71a基因，并對其進行了生物信息學(xué)和表達分析，以期為小麥抗逆生理機制的闡明及遺傳改良提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

供試材料為普通小麥品種揚麥158(TriticumaestivumL. cv. Yangmai 158)，由天津農(nóng)學(xué)院天津-布里斯托環(huán)境變化對農(nóng)作物影響研究中心保存。小麥種植及處理方式參照文獻[18]的方法。材料用液氮迅速冷凍后保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 植物總RNA采用TIANGEN公司試劑盒提取，按照Invitrogen公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA第1鏈的合成，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2TaWRKY71a基因的克隆 以WRKY保守結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)，到http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/網(wǎng)站上對小麥EST庫進行BlastN查詢，將搜索到的一些高度相似且重疊的ESTs進行序列拼接，組合成序列較長的復(fù)合EST，再以此為查詢序列重復(fù)進行BlastN搜索、聚類、拼接直至無法進行，以達到最有效延伸。利用ORF finder 工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)查找該序列的開放閱讀框，設(shè)計克隆引物F1/R1(表1)并進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系參照文獻[19]。擴增條件為：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后，回收純化，與克隆載體pGEM-T連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中，挑選經(jīng)PCR鑒定正確的陽性克隆送北京博邁德生物公司進行測序。

1.2.3TaWRKY71a基因編碼的氨基酸序列分析 利用NCBI的CDD工具對蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測[20]；利用ProtParam對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行分析[21]；利用SOPMA對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測[22]；利用CELLO對蛋白質(zhì)進行亞細胞定位預(yù)測[23]；利用DNAMAN軟件對蛋白質(zhì)序列進行比對；利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進化樹。核定位信號(NLS)預(yù)測利用NLS Mapper (http：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)進行[24]。其他相關(guān)在線工具和軟件的網(wǎng)址參照文獻[19]。

1.2.4TaWRKY71a基因的表達分析 目標(biāo)基因及小麥Actin基因引物序列見表1。以1.2.1獲得的cDNA為模板，以小麥Actin基因為內(nèi)參進行實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)分析。根據(jù)北京康為世紀(jì)公司熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作。反應(yīng)體系包括：2×UltraSYBR混合液10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，加水補足20 μL。擴增反應(yīng)在ABI 7500 Fast qRT-PCR儀上進行，擴增條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，以相同的試驗方法進行3次生物學(xué)重復(fù)，用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。

表1 用于基因克隆及表達分析的引物Tab.1 Primers for gene cloning and expression analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因克隆

利用引物F1/R1對兩葉一心期揚麥158葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到約1 100 bp的特異性條帶(圖1)。將目的條帶經(jīng)回收純化、克隆和測序后，利用BioEdit軟件進行序列比對和拼接。通過ORF finder軟件分析表明，該序列含有一個長為1 068 bp的完整開放閱讀框，編碼355個氨基酸殘基。序列中包含保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域N端有一個典型的 WRKYGQK序列，C 端有一個 C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)(圖2)。經(jīng)Blast搜索比對，該基因編碼序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中小麥TaWRKY71 (GenBank：ABN43177.1)氨基酸序列的相似度為98.3%，說明它們可能是等位基因，因此命名為TaWRKY71a。

2.2 TaWRKY71a基因編碼的氨基酸序列分析

2.2.1 TaWRKY71a蛋白理化性質(zhì)分析 ProtParam分析可知，TaWRKY71a蛋白分子量為38.77 ku，分子式為C1671H2649N507O528S15，含有38個負(fù)電荷氨基酸殘基，40個正電荷氨基酸殘基，理論等電點為8.15；不穩(wěn)定系數(shù)為60.22，屬不穩(wěn)定型蛋白。ProtScale分析可知，TaWRKY71a蛋白親水性區(qū)域(分值為負(fù))分值較高，而疏水性區(qū)域(分值為正)分值低(圖3)。因此，該蛋白屬于親水性蛋白。

M．DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.TaWRKY71a基因擴增產(chǎn)物。M．DNA Marker；1-3.PCR product of TaWRKY71a.

2.2.2 TaWRKY71a蛋白亞細胞定位分析 序列分析表明，在氨基酸序列123-132位置含有核定位信號序列PSRKRKSEES，CELLO預(yù)測結(jié)果也表明，TaWRKY71a蛋白定位于細胞核(圖4)，這與其作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用是一致的。經(jīng)分析，WRKY71a蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)信號肽，表明該蛋白不是分泌型蛋白。

橫線部分為WRKY結(jié)構(gòu)域；方框內(nèi)部分為C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)。The sequence with underline means WRKY domain； The C2H2 zinc-finger structure are boxed.

圖3 TaWRKY71a蛋白的親水性/疏水性分析Fig.3 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of TaWRKY71a protein

圖4 TaWRKY71a蛋白的亞細胞定位分析Fig.4 Subcellular localization analysis of TaWRKY71a protein

2.2.3 TaWRKY71a蛋白結(jié)構(gòu)分析 CDD工具預(yù)測表明，TaWRKY71a蛋白的WRKYGQK序列位于開放閱讀框的195-253區(qū)間，它是WRKY基因家族的保守結(jié)構(gòu)域。另外還含有一個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，為Cx5Cx23HxH序列(圖2、圖5-A)。這樣的結(jié)構(gòu)特點說明TaWRKY71a屬于WRKY基因家族第二亞族。

SOPMA預(yù)測表明，TaWRKY71a蛋白二級結(jié)構(gòu)含有28.17%的α-螺旋，4.79%的β-轉(zhuǎn)角，延伸鏈占16.34%，無規(guī)則卷曲所占比例達到了50.70%(圖5-B)。

2.3 不同物種間TaWRKY71a蛋白的同源性比較

將TaWRKY71a蛋白與小麥和水稻W(wǎng)RKY71蛋白進行了多序列比對，結(jié)果顯示，這3種WRKY蛋白同源性較高，尤其WRKY結(jié)構(gòu)域氨基酸序列高度保守，都含有同樣的WRKYGQK核心序列和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)(圖6)。將小麥TaWRKY71a與一些禾本科植物及雙子葉模式植物擬南芥的WRKY序列進行系統(tǒng)進化分析表明，TaWRKY71a與小麥WRKY33和WRKY71同源性最高，與其他禾本科植物的WRKY蛋白進化關(guān)系也較近。與擬南芥WRKY家族中的AtWRKY40蛋白同源性最高(圖7)。

A．TaWRKY71a編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析；B. SOPMA預(yù)測的TaWRKY71a蛋白二級結(jié)構(gòu)。圖中豎線按照由長到短遞減依次表示α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。

方框內(nèi)部分為WRKYGQK核心序列和C2H2鋅指結(jié)構(gòu)。The WRKYGQK core sequence and C2H2 zinc finger structure are boxed.

圖7 小麥與其他物種WRKY蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of WRKY from wheat and other species

2.4 TaWRKY71a基因的表達分析

qRT-PCR分析結(jié)果表明(圖8-A)，在根、莖、葉、花和種子中均可檢測到TaWRKY71a的表達，但表達程度不同。其中，在幼葉片中表達量最高，在幼根中的表達量較高，在莖中表達量最低。進一步研究了TaWRKY71a在不同脅迫因素刺激下表達模式，結(jié)果如圖8-B-D，TaWRKY71a基因受ABA、NaCl和PEG脅迫的誘導(dǎo)；PEG處理0.5～1.0 h，TaWRKY71a基因表達明顯增強，而后表達量基本恢復(fù)到對照水平；ABA和NaCl處理2～4 h，TaWRKY71a基因表達量達到最高，隨后表達量降低。

A．不同組織：YL.幼葉；ML.成熟葉；YR.幼根；MR.成熟根；ST.莖；FL.花；SE.種子；B.ABA處理；C.NaCl處理；D.PEG處理。A．Different tissues：YL.Young leaves；ML.Mature leaves；YR.Young roots；MR.Mature roots；ST.Stems；FL.Flowers；SE.Seeds；B.ABA treatment；C.NaCl treatment；D.PEG treatment.

3 討論與結(jié)論

本研究對普通小麥揚麥158進行WRKY基因克隆，得到長為1 068 bp、編碼355個氨基酸的基因序列，其與NCBI中已登錄的小麥WRKY71基因的核苷酸及氨基酸序列相似性很高，因此，將該基因命名為TaWRKY71a。TaWRKY71a基因編碼的氨基酸序列具有植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的典型保守結(jié)構(gòu)域，包括一個WRKYGQK結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，這也說明所克隆的TaWRKY71a是植物WRKY基因家族中第二亞族的成員[1]。這段高度保守的WRKYGQK七肽序列(其有可能被修飾為WRKYGEK或WRKYGKK)，以及其C端包含的鋅指結(jié)構(gòu)域是WRKY特異性與目標(biāo)基因啟動子中的W盒序列TTGACT/C結(jié)合必不可少的組件，WRKY結(jié)構(gòu)域的突變往往會導(dǎo)致與DNA的結(jié)合活性減弱甚至消失[25]。

不同物種的WRKY基因都是多基因家族，而且保守性和同源性很高。系統(tǒng)進化分析表明，TaWRKY71a與小麥TaWRKY33、TaWRKY71、水稻OsWRKY71以及擬南芥AtWRKY40同源性較高。小麥TaWRKY33和TaWRKY71均受ABA誘導(dǎo)，促進植物應(yīng)答高溫、干旱等非生物脅迫過程[26-27]。在水稻中，OsWRKY71參與病原防御反應(yīng)，并且是糊粉細胞中GA信號途徑的轉(zhuǎn)錄抑制子[28-29]。擬南芥AtWRKY40受ABA誘導(dǎo)激活，但在植物應(yīng)答非生物脅迫中起負(fù)調(diào)控作用[30]。因此，TaWRKY71a的功能及作用機制還有待進一步分析鑒定。此外，qRT-PCR結(jié)果表明，TaWRKY71a在小麥不同組織器官中均有表達，在幼葉中表達量最高。受到ABA、NaCl和PEG等脅迫因子的誘導(dǎo)。因此，筆者推測TaWRKY71a可能參與ABA介導(dǎo)的滲透脅迫調(diào)節(jié)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子超家族在植物的脅迫應(yīng)答反應(yīng)及植物生長發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要的作用，后續(xù)筆者將進一步鑒定TaWRKY71a調(diào)控的上下游基因，并進行基因轉(zhuǎn)化，以期深入闡明TaWRKY71a基因的功能及其調(diào)控機制，為小麥分子育種奠定基礎(chǔ)。

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