劉苗苗，吳家文，吳生兵，周美啟

(1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學 新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038；3.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫(yī)藥大學針灸經(jīng)絡(luò)研究所，安徽 合肥 230038)

艾葉是菊科蒿屬植物艾草ArtemisiaargyiLevl.et Vant.的干燥葉，其作為灸法的主材料已有數(shù)千年歷史。艾絨(干燥艾葉研磨后去雜質(zhì)而成)作為灸材，一般來說受制于艾絨的可燃性和單純的溫熱作用，但也包涵著許多其他未知因素，如藥物作用[1]。艾絨的易燃性是艾灸產(chǎn)生臨床治療作用的基礎(chǔ)，與艾葉中的艾葉揮發(fā)油含量豐富[1]、纖維素等有機化合物含量高有一定關(guān)系。艾葉揮發(fā)油主要為單萜類和倍半萜類物質(zhì)[2]。艾葉揮發(fā)油和植物纖維素的合成分別受制于萜類物質(zhì)和纖維素合成的重要功能基因[3]。轉(zhuǎn)錄組測序作為分析功能基因及基因表達的最佳手段，已逐漸應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域。WANG等[4]通過對黃花蒿腺毛組織(青蒿素產(chǎn)生的部位)的轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)萜類和黃酮類物質(zhì)的合成酶基因，表明腺毛是萜類和黃酮類物質(zhì)重要的次生代謝活動的場所。目前，關(guān)于艾葉的生物分子學研究遠遠落后于對其化學及藥理的研究[2]，而艾葉中的功能基因表達與其生物特性的聯(lián)系未見報道。本研究擬通過艾草轉(zhuǎn)錄組測序，比較分析艾草中葉、莖、根組織的基因表達譜，并對這些功能基因進行京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)注釋得到萜類物質(zhì)和纖維素合成的途徑，探求參與這兩條次生代謝途徑的關(guān)鍵酶基因，從基因水平揭示艾草易燃性特性的轉(zhuǎn)組學基礎(chǔ)，同時亦為艾葉作為灸材提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與cDNA文庫的制備 艾草于2016年5月花未開時采摘自安徽中醫(yī)藥大學藥園，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學楊青山老師鑒定為菊科蒿屬植物艾草ArtemisiaargyiLev. et Vant.。將新鮮艾草用滅菌超純水洗凈、濾紙吸干水分，葉、莖、根分開采集，迅速置于液氮中冷凍，保存于-80 ℃冰箱。用RNA試劑盒分別提取3個組織的總RNA，并用Nano Drop和Agilent 2100檢測其純度、濃度和完整性。合格的總RNA用DNase Ⅰ消化后，帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA并片段化處理。以短片段mRNA為模板合成第一鏈cDNA，然后合成第二鏈cDNA，對其進行純化回收、黏性末端修復(fù)，接著在cDNA的3′端加上堿基A并連接接頭，選擇長度合適的片段進行PCR擴增。最后，構(gòu)建好的cDNA文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System進行質(zhì)檢。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序與數(shù)據(jù)組裝 使用Illumina Hiseq 4000平臺(華大基因，武漢)對合格的葉、根、莖cDNA文庫進行測序。對測序后得到的原始讀段中低質(zhì)量、接頭污染及未知堿基N含量過高的讀段進行過濾，從而得到高質(zhì)量讀段并保存為FASTQ格式。使用Trinity軟件[5]通過Inchworm，Chrysalis和Butterfly 3個模塊依次對高質(zhì)量讀段進行de novo組裝，再用TGICL軟件[6]將組裝后的轉(zhuǎn)錄本進行聚類去冗余，最終得到功能基因。功能基因分為clusters和singletons兩部分，其基因家族的編號分別以CL和Unigene開頭。

1.3 功能基因的KEGG注釋與表達量計算 使用NCBI BLAST將功能基因與KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg)進行比對，獲取功能基因注釋信息。根據(jù)注釋的Ko編號查找具體的生物學通路，確定艾草功能基因中參與萜類化合物及植物纖維素合成相關(guān)的基因。運用Bowtie2軟件[7]將高質(zhì)量讀段比對到功能基因上，然后使用RSEM軟件[8]計算3個樣品中基因的表達水平，得到每個功能基因的標準表達量即FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，每1百萬個映射上的讀段中映射到外顯子的每一千個堿基上的讀段個數(shù))值。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果 本研究對艾草進行轉(zhuǎn)錄組測序，共得到33.46千兆(gigabyte，GB)高質(zhì)量讀段，其Q 20%和Q 30%分別大于98%和95%，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可用于下一步de novo組裝。對高質(zhì)量讀段組裝并聚類去冗余后得到99 807個功能基因，其總長度、平均長度、N50分別為92 726、525、929、1 456 bp，GC%為40.79%，說明功能基因完整性較高，可對其進行功能注釋。將功能基因比對到KEGG數(shù)據(jù)庫后，44 750個(44.84%)功能基因得到注釋，共涉及135條代謝通路，主要包括6個方面的分子間相互作用和反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，即新陳代謝、細胞過程、環(huán)境信息加工、遺傳信息加工、人類疾病和生物體系統(tǒng)。筆者按基因獲得注釋的量的多少進行排序，選取前10個代謝通路(見圖1)。涉及代謝途徑的功能基因數(shù)量最多有9 705個，占21.69%，其次是與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的功能基因，有5 578個，占12.46%，其余主要富集于碳代謝、氨基酸生物合成、淀粉與蔗糖代謝、嘌呤代謝、苯丙素生物合成等代謝途徑。

圖1 KEGG功能注釋(橫坐標表示功能基因的數(shù)目，縱坐標表示各種代謝通路)

2.2 代謝途徑分析

2.2.1 單萜類與倍半萜類生物合成相關(guān)基因的鑒定與分析 單萜類與倍半萜類物質(zhì)是艾葉揮發(fā)油的主要成分，兩者生物合成的途徑分為異戊烯焦磷酸(isopentenyl-5-pyrophosphate， IPP)及二甲丙烯焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)前體物質(zhì)的合成階段和牦牛兒基焦磷酸(geranyl diphosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)等萜類骨架構(gòu)建和糖基化、羥基化等修飾反應(yīng)階段[9]。其中IPP與DMAPP通過甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑和2C-甲基-4-磷酸-4D-赤蘚糖醇(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途徑合成[9]，隨后經(jīng)過一系列催化作用生成倍半萜類與單萜類產(chǎn)物，見圖2。

通過對艾草功能基因的KEGG代謝通路的分析，共有241個功能基因映射到萜類骨架合成通路(Ko00900)上，其中116個功能基因編碼萜類骨架合成途徑中16種關(guān)鍵酶，包括乙酰CoA轉(zhuǎn)乙?；?acetyl-CoA-acetyltransferase，AATC)，甲基戊二酰輔A合成酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase，HMGS)等6個 MVP途徑酶；1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS)，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR)等8個MEP途徑酶和催化萜類骨架前體生成單萜類與倍半萜類物質(zhì)的牦牛兒基焦磷酸合成酶(geranyl diphosphate synthase，GPPS)及法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PPS)，見表1。

圖2 單萜類與倍半萜類生物合成途徑

表1 單萜類和倍半萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因

根據(jù)功能基因的FPKM值，將FPKM≥1(FPKM≥1的基因定義為表達基因)作為判斷基因表達的閾值[9]，評估上述16種萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶在艾葉、根、莖中的表達水平?；诒?中編碼萜類合成關(guān)鍵酶的116種基因，篩選得到葉、根和莖中的表達基因分別有56、66和64個，對應(yīng)不同酶的表達基因的數(shù)目在3個組織中的分布見圖3，其中編碼HMGR的表達基因在葉、根、莖中均最多。另外，篩選在3個組織中的FPKM之和不小于3的編碼16種酶的基因共65個，用log2(FPKM+1)表達式的值將這65個基因的表達水平標準化進行層次聚類分析[10](見圖4)，可知根和莖聚類較緊密，說明這兩種組織中基因的整體表達水平更相近。在整個艾草轉(zhuǎn)錄組中，發(fā)現(xiàn)編碼MVD的基因只有1個，命名為Unigene7594；編碼CMS的基因也只有2個，命名為CL7571.Contig1和CL7571.Contig2，它們在3個組織中共表達，且在葉中的表達水平均最高，其次是莖和根，提示這兩種關(guān)鍵酶是MVA和MEP途徑中的限速酶，對酶基因的調(diào)控直接影響次生代謝的速度和終產(chǎn)物的產(chǎn)量。

2.2.2 纖維素合成途徑分析 纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，是人類重要的生物能源原料，具有高度易燃性。植物纖維素的合成是由蔗糖合酶(sucrose synthase，SuSy)催化蔗糖和尿苷二磷酸(uridine diphosphate，UDP)反應(yīng)生成尿苷二磷酸-葡萄糖(uridine diphosphate -glucose，UDP-G)和果糖；UDP-G經(jīng)過纖維素合成酶(cellulose synthase，CesA)和其他輔酶催化，再由細胞骨架蛋白等修飾共同完成的復(fù)雜過程[11]。另外，細胞外蔗糖在葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)、葡萄糖磷酸變位酶(phosphoglucomutase，PGM)、尿苷三磷酸-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶(uridine triphosphate-glucose-1-phosphate uridylyltransferase，UGP2)等酶的作用下也能夠合成UDP-G[12]。根據(jù)艾草轉(zhuǎn)錄組背景，在淀粉與蔗糖代謝途徑(Ko00500)中，發(fā)現(xiàn)有119個編碼蔗糖合酶的基因，且在葉、莖、根中表達基因分別有85、97、90個；另外編碼CesA的基因只有1個并在葉、根、莖中均有表達，其對應(yīng)的FPKM值分別為1.0、1.44、1.0。見表2。

圖3 單萜類和倍半萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因在葉、根、莖中的表達數(shù)目分布情況

注：顏色的強弱表示基因的表達水平，紅色代表低表達水平，黃色代表高表達水平

表2 纖維素合成途徑及相關(guān)基因

3 討論

本實驗對艾草的葉、根、莖3個組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序，de novo組裝后得到99 807個功能基因，再比對到KEGG數(shù)據(jù)庫中得到萜類和纖維素合成的代謝通路，發(fā)現(xiàn)并分析了與萜類物質(zhì)和纖維素合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因。值得關(guān)注的是，艾草的3個組織中僅存在1個MVD表達基因和2個CMS表達基因，并且這3個基因均在葉中表達水平最高，提示它們很可能是萜類代謝途徑的限速酶。已知高等植物的萜類物質(zhì)合成都依賴于MVA和MEP途徑，MVD是MVA途徑中催化形成IPP的最后一個酶，LIAO等[12]基于銀杏的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對MVD基因的表達及功能研究后認為銀杏MVD是MVA途徑中的關(guān)鍵酶；CMS為MEP途徑中的第3個關(guān)鍵酶，在擬南芥中超量表達青蒿CMS基因?qū)е乱訢MAPP為前體物質(zhì)合成的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量顯著增加，表明青蒿CMS對萜類物質(zhì)的合成具有關(guān)鍵作用[13]。MVD與CMS基因的高表達使艾葉中萜類物質(zhì)含量可能比根和莖更多，為艾草中選擇葉組織為灸材提供分子水平支持。根據(jù)KEGG分析，在葉、根和莖中都存在控制萜類和纖維素合成的重要功能基因，說明不僅葉具有可燃性特性，根和莖也有這一生物特性，提示根和莖可能具有開發(fā)為灸材的潛力，進而增加資源利用率，但其燃燒時有無臨床治療效應(yīng)還需進一步研究。

本研究首次對艾葉可燃燒性的相關(guān)基因進行挖掘和分析，初步解釋了艾葉可燃性的物質(zhì)基礎(chǔ)，從基因?qū)用嫔险撌隽税~作為灸材的合理性。此外，艾草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GSE102404)作為一份寶貴的基因資源，也豐富了我國中草藥基因庫。

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(收稿日期：2017-12-04；編輯：曹健)

[Abstract]ObjectiveTo study the flammability characteristics ofArtemisiaargyi(A.argyi) on the basis of transcriptome.MethodsAfter picking freshA.argyi, the total RNA of leaves, roots, and stems was extracted, and the cDNA libraries of the three tissues were established for high-throughput sequencing. High-quality reads were obtained by filtering the raw reads after sequencing, and then were de novo assembled using Trinity software to obtain functional genes, which were annotated by Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), and the expression levels of functional genes were also calculated.ResultsBy high-throughput sequencing ofA.argyi, a total of 99 807 functional genes were obtained. After comparing them with the KEGG database, the metabolic pathways for terpenoids and cellulose syntheses were obtained. It was found that 116 genes were involved in the synthesis of terpenoids, and 16 key enzymes were encoded; 119 genes were involved in cellulose synthesis, and 5 key enzymes were encoded. Among the key enzymes for the synthesis of terpenoids, only one MVD gene and two CMS genes existed in each of leaves, roots, and stems, and the expression levels of these three key enzyme genes were highest inA.argyileaves.ConclusionThere are many key enzyme genes involved in terpenoids and cellulose syntheses inA.argyi, but the expression of the most critical ones, rate-limiting enzymes, inA.argyileaves is higher than that in roots and stems, which may be one of the key factors for the selection ofA.argyileaves as moxibustion material.

[Keywords]Artemisiaargyi; Flammability; Terpenoids; Cellulose; Functional gene