鄢海燕，宗倩妮，鄒純才，張 娜

（皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽蕪湖 241002）

瓜蔞為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）或雙邊栝樓（Trichosanthes rosthorniiHarms）的干燥成熟果實(shí)（陰干），有清熱滌痰、寬胸散結(jié)、潤燥滑腸之功效，具焦糖氣，味微酸、甜〔1〕。由于瓜蔞陰干時(shí)間較長且易破碎，現(xiàn)多采用將瓜蔞進(jìn)行蒸制后壓片切條的方法進(jìn)行炮制，該方法不僅可以殺死瓜蔞中的微生物且易于保存〔2-3〕。對(duì)于瓜蔞，傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)以“糖味濃者為佳”〔4〕，說明糖分含量的高低對(duì)瓜蔞的質(zhì)量具有評(píng)判價(jià)值。為考察瓜蔞蒸制前后還原糖及總糖的變化，本實(shí)驗(yàn)以D-無水葡萄糖為對(duì)照品，采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）顯色法及苯酚-硫酸顯色法分別測定瓜蔞蒸制前后還原糖和總糖的含量，以期為瓜蔞的炮制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 FA2004型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；6202型高速粉碎機(jī)（北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 藥品 瓜蔞（河北安國市御顏坊中藥材有限公司，批號(hào)：20150830、20151201、20160801、20161102、20161201），經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室包淑云副教授鑒定為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）的成熟果實(shí)。

1.2.2 試劑 石油醚（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150708）；苯酚（無錫市展望化工試劑有限公司，批號(hào)：20110320）；濃硫酸（南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：4061350322）；3，5-二硝基水楊酸（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，批號(hào)：T90937）；D-無水葡萄糖對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，含量≥99.9%，批號(hào)：110833-201504）；蒸餾水（自制）。

2 方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 瓜蔞蒸制品 將瓜蔞置于蒸籠內(nèi)，以30 mL∕min的蒸氣量蒸40 min后，40℃干燥24 h，備用。

2.1.2 瓜蔞及瓜蔞蒸制品溶液 取過40目篩的瓜蔞及瓜蔞蒸制品細(xì)粉0.2 g，精密稱定，加20 mL石油醚水浴回流30 min，過濾并揮干石油醚〔4〕，向?yàn)V渣中加水20 mL，水浴2 h，過濾，水洗濾渣3次，合并濾液于50 mL容量瓶中，定容成4 mg∕mL（相當(dāng)于原藥材），備用。

2.1.3 還原糖和總糖供試品溶液 精密吸取1 mL瓜蔞及瓜蔞蒸制品溶液，作為測定還原糖的供試品溶液；精密吸取還原糖供試品溶液1 mL置25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，作為測定總糖的供試品溶液，備用。

2.2D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液 精密稱取D-無水葡萄糖對(duì)照品5 mg，置10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.5 mg∕mL的D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液，備用。

2.3 顯色試劑的配制

2.3.1 DNS試劑 取DNS0.60 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加2 mol∕L氫氧化鈉溶液32.5 mL和丙三醇4.5 g，加水定容至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 5%苯酚溶液 取苯酚5.00 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 測定波長的選擇 分別精密量取D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液、還原糖和總糖供試品溶液，按還原糖和總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法處理，用紫外-可見分光光度計(jì)于200～800 nm波長范圍掃描吸收光譜。參照文獻(xiàn)〔4〕為消除DNS本身紫外可見吸收對(duì)樣品測定的影響，選擇供試品顯色液-水（水為參照）和供試品顯色液-DNS試劑（DNS試劑為參照）曲線重合的540 nm作為還原糖的測定波長，見圖1，選擇487 nm作為總糖的測定波長，見圖2。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.6.1 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液（0.5 mg∕mL）0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mL于5 mL具塞刻度試管中，加DNS試劑1.5 mL，加水至3.5 mL，水浴7 min，取出放至室溫，補(bǔ)充水至3.5 mL〔5〕。采用紫外-可見分光光度法于540 nm處測定吸光度值，以D-無水葡萄糖質(zhì)量（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，回歸方程為y=6.895 8x-0.146 7，r=0.999 1。結(jié)果表明D-無水葡萄糖在0.04～0.20 mg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 瓜蔞還原糖供試品與對(duì)照品的光譜圖

圖2 瓜蔞總糖供試品與對(duì)照品的光譜圖

2.6.2 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液（0.5 mg∕mL）0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mL，以蒸餾水為溶劑，分別定容至2 mL，再加入5%的苯酚溶液1 mL，搖勻后迅速加入濃硫酸5 mL，放置10 min后沸水浴20 min，取出后以流水冷卻至室溫〔6〕。采用紫外-可見分光光度法于487 nm處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，回歸方程為y=14.879 4x+0.0337，r=0.9995。結(jié)果表明D-無水葡萄糖在0.005～0.080 mg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取瓜蔞（批號(hào)：20151201）蒸制品還原糖及總糖供試品溶液各1 mL，照“2.6”項(xiàng)下操作，連續(xù)測定5次，記錄吸光度值，計(jì)算還原糖和總糖的濃度，結(jié)果RSD值分別為0.76%和0.054%，表明精密度良好。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批瓜蔞（批號(hào)：20151201）蒸制品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液。按“2.6.1”及“2.6.2”項(xiàng)下方法顯色測定吸光度值，計(jì)算還原糖和總糖的濃度，結(jié)果RSD值分別為1.23%和0.68%，表明重復(fù)性良好。

2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取瓜蔞（批號(hào)：20151201）蒸制品還原糖及總糖供試品溶液各1份，照“2.6.1”及“2.6.2”項(xiàng)下方法顯色，分別于第 0、10、20、30、60、90 min測定吸光度，計(jì)算還原糖和總糖的濃度，結(jié)果RSD值分別為1.58%和0.93%，表明樣品顯色后90 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.4 加樣回收率試驗(yàn) 精確量取已知含量的瓜蔞（批號(hào)：20151201）蒸制品還原糖供試品溶液9份，分為3組，每組3份，每份0.2 mL置于5 mL具塞刻度試管中，每組分別按還原糖已知含量的80%、100%、120%精密加入D-無水葡萄糖對(duì)照品。照“2.6.1”項(xiàng)下操作進(jìn)行還原糖回收率試驗(yàn)；精確吸取已知含量的瓜蔞（批號(hào)：20151201）蒸制品總糖供試品溶液9份，分為3組，每組3份，每份1 mL于具塞試管中，每組分別按總糖已知含量的80%、100%、120%精密加入D-無水葡萄糖對(duì)照品，照“2.6.2”項(xiàng)下操作進(jìn)行總糖的回收率試驗(yàn)。見表1。

表1 還原糖和總糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品的測定

2.8.1 還原糖的含量測定 分別取蒸制前后瓜蔞各5份，按“2.1.2”“2.1.3”項(xiàng)下制備還原糖供試品溶液。取瓜蔞還原糖供試品溶液0.5 mL、瓜蔞蒸制品還原糖供試品溶液0.3 mL，照“2.6.1”項(xiàng)下操作，測定吸光度值，計(jì)算瓜蔞及其蒸制品中還原糖的含量。見表2。

2.8.2 總糖的含量測定 分別取蒸制前后瓜蔞各5份，按“2.1.2”“2.1.3”項(xiàng)下制備總糖供試品溶液。取瓜蔞總糖供試品溶液2 mL、瓜蔞蒸制品總糖供試品溶液1 mL，照“2.6.2”項(xiàng)下操作，測定吸光度值，計(jì)算瓜蔞及其蒸制品中總糖的含量。見表2。

表2 瓜蔞及其蒸制品還原糖及總糖的含量測定結(jié)果（ˉ± s，n=5）

表2 瓜蔞及其蒸制品還原糖及總糖的含量測定結(jié)果（ˉ± s，n=5）

注：與瓜蔞比，*P＜0.01。

樣品瓜蔞瓜蔞蒸制品還原糖∕%5.54±0.11 8.07±0.31*總糖∕%6.71±1.05 11.51±0.32*

由表2可知，瓜蔞蒸制后，還原糖和總糖含量均升高，且與瓜蔞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

還原糖本身有還原性，轉(zhuǎn)化糖可經(jīng)多種途徑轉(zhuǎn)化成還原糖，其他碳水化合物如淀粉、蔗糖等水解也生成還原糖。還原糖可反映植物體內(nèi)碳水化合物運(yùn)轉(zhuǎn)情況，在有機(jī)體的代謝中起著重要作用，還能形成其他物質(zhì)如有機(jī)酸等?？偺侵饕妇哂羞€原性的葡萄糖、果糖等和在測定條件下能水解為還原性的單糖如蔗糖、麥芽糖以及可能部分水解的淀粉。瓜蔞多糖是瓜蔞的重要組成部分〔7〕，在抗氧化、抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等方面具有藥理活性〔8〕。且多糖類化合物通常沒有細(xì)胞毒性，不影響正常細(xì)胞功能，具有高效低毒的特點(diǎn)〔9〕。因此，含糖量的多少是瓜蔞品質(zhì)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，自古就有以“糖味濃者為佳”的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)采用DNS和苯酚-硫酸法測定了瓜蔞及其蒸制品的還原糖和總糖含量，發(fā)現(xiàn)與瓜蔞相比，瓜蔞蒸制后還原糖和總糖的含量均升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），在蒸制的過程中也可聞到“焦糖香味”。瓜蔞蒸制前后還原糖和總糖的含量變化源自于蒸制時(shí)的高溫水解。該實(shí)驗(yàn)為采用蒸制方法對(duì)瓜蔞進(jìn)行炮制提供了科學(xué)依據(jù)。前期實(shí)驗(yàn)探討了蒸氣量和蒸制時(shí)間對(duì)瓜蔞中專屬性成分3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇的影響，發(fā)現(xiàn)蒸氣量超過30 mL∕min，蒸制時(shí)間超過40 min會(huì)影響3，29-二苯甲酰基栝樓仁三醇的含量。為此，本實(shí)驗(yàn)采用蒸氣量30 mL∕min，蒸制時(shí)間40 min對(duì)瓜蔞進(jìn)行炮制。有關(guān)蒸氣量和蒸制時(shí)間對(duì)瓜蔞中還原糖和總糖含量變化的影響，特別是對(duì)藥效學(xué)的影響還有待深入的研究。

〔1〕國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部〔M〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：112.

〔2〕巢志茂，何波.瓜蔞的產(chǎn)地烘蒸加工〔J〕.中藥材，1999，22（4）：185-186.

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〔4〕孫文，巢志茂，王淳，等.瓜蔞飲片中總糖及還原糖的含量測定〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（9）：96-99.

〔5〕張志君，孫偉，李永亮，等.3，5-二硝基水楊酸法聯(lián)合苯酚-濃硫酸法測定不同產(chǎn)地黃精中多糖含量〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（6）：106-109.

〔6〕張璐，翁立冬，劉莉，等.苯酚-硫酸法測定烏梅多糖的含量〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（6）：107-109.

〔7〕萬麗娟，盧金清，許俊潔，等.瓜蔞子化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展〔J〕.中國藥房，2015，26（31）：4440-4443.

〔8〕王新新.瓜蔞多糖的提取、純化及其抗氧化、斑馬魚心臟保護(hù)活性研究〔D〕.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

〔9〕王新新，王曉，任鴻遠(yuǎn)，等.超高壓提取瓜蔞多糖體外抗氧化活性研究〔J〕.食品科技，2016，41（1）：170-175.