鄒純才，宗倩妮，張文芝，鄢海燕

（皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽蕪湖 241002）

瓜蔞為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）或雙邊栝樓（Trichosanthes rosthorniiHarms）的干燥成熟果實(shí)〔1〕，于秋季果實(shí)成熟時(shí)剪下懸掛晾干。瓜蔞含有氨基酸類(lèi)〔2-3〕、黃酮類(lèi)〔4〕、甾醇類(lèi)〔5〕成分等，是《金匱要略》中著名方劑瓜蔞薤白白酒湯的君藥。由于瓜蔞自然晾干過(guò)程大約需要近半年時(shí)間，受外界氣候影響大，瓜蔞損耗較多，現(xiàn)企業(yè)多采用將瓜蔞蒸制后壓扁切條烘干（藥材市場(chǎng)上稱為瓜蔞條），干燥時(shí)間短且易于保存〔6-8〕。但目前文獻(xiàn)未見(jiàn)有關(guān)瓜蔞蒸制前后總氨基酸、總黃酮和總皂苷含量的比較研究。為此，本實(shí)驗(yàn)采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，分別以L-精氨酸、槲皮素和齊墩果酸為對(duì)照品〔9-11〕，對(duì)樣品中總氨基酸、總黃酮和總皂苷的含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)瓜蔞蒸制前后化學(xué)成分的變化進(jìn)行研究，以期為瓜蔞深入加工提供內(nèi)在化學(xué)成分上的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 FA2004型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；UV-2550型紫外-分光光度計(jì)（島津有限公司）；pHS-3C型精密酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司，儀器級(jí)別：0.01級(jí)）；Heidolph-LR4010∕4011jf型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)海道爾夫公司）。

1.2 藥品與試劑 瓜蔞（河北安國(guó)市御顏坊中藥材有限公司，批號(hào)：20140830、20141201、20150801、20151101、20151102），經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院包淑云副教授鑒定為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）的成熟果實(shí)。L-精氨酸（中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，含量≥98.0%，批號(hào)：1012-070114）；槲皮素（中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，含量≥98.0%，批號(hào)：H06-140611）；齊墩果酸（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，含量≥98.0%，批號(hào)：160304）；蒸餾水（自制）；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 瓜蔞蒸制品的制備 將瓜蔞置于蒸籠內(nèi)，武火加熱蒸40 min后，40℃烘干24 h，備用。

2.2 瓜蔞及瓜蔞蒸制品溶液的制備 取瓜蔞或瓜蔞蒸制品一枚，粉碎成粗粉，精密稱定，以10倍量60%乙醇浸泡30 min后，回流提取3次，每次1 h，抽濾，取濾液，合并3次濾液，旋蒸回收溶劑，制成稠浸膏〔12〕。浸膏水洗定容至0.1 g∕mL（相當(dāng)于原藥材），備用。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

2.3.1L-精氨酸對(duì)照品溶液 精密稱取L-精氨酸對(duì)照品12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，得0.5 mg∕mL的L-精氨酸對(duì)照品溶液。

2.3.2 槲皮素對(duì)照品溶液 精密稱取槲皮素對(duì)照品5 mg，置于100 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，得0.05 mg∕mL的槲皮素對(duì)照品溶液。

2.3.3 齊墩果酸對(duì)照品溶液 精密稱取齊墩果酸對(duì)照品6.40 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得0.64 mg∕mL的齊墩果酸對(duì)照品溶液。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示，用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別精密量取各對(duì)照品溶液、瓜蔞（批號(hào)：20151101）供試品溶液，按各樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法處理，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)范圍掃描光譜圖。瓜蔞總氨基酸、總黃酮和總皂苷測(cè)定用供試品和L-精氨酸、槲皮素及齊墩果酸分別在568、445、551 nm處有最大吸收，故選擇568、445、551 nm分別作為總氨基酸、總黃酮和總皂苷的含量測(cè)定波長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

圖1 瓜蔞供試品與對(duì)照品的光譜圖

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.6.1L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取L-精氨酸對(duì)照品溶液（0.5 mg∕mL）0.80、1.00、1.20、1.40、

1.60、1.80、2.00、2.20 mL分別置于50 mL容量瓶中，分別加水5 mL、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液0.5 mL、2%茚三酮溶液0.5 mL，振搖。置于沸水浴中煮沸15 min后，冷卻至室溫，加水定容至50 mL，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法于568 nm處測(cè)定吸光度，以濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，回歸方程為y=0.055 6x+0.222 0，r=0.999 2。結(jié)果表明L-精氨酸在8～22 μg∕mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.6.2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取槲皮素對(duì)照品溶液（0.05 mg∕mL）1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL分別置于25 mL容量瓶中，按照槲皮素對(duì)照品溶液：0.1 mol∕L的三氯化鋁無(wú)水乙醇溶液：pH 6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液＝1：2：1（V：V：V）加入顯色劑和緩沖液，用無(wú)水乙醇定容至刻度，振搖。于30℃水浴鍋中水浴30 min。采用紫外-可見(jiàn)分光光度法于445 nm處測(cè)定吸光度，以濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，回歸方程為y=0.141 1x-0.122 8，r=0.998 5。結(jié)果表明槲皮素在3～8 μg∕mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.6.3 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取0.64 mg∕mL的齊墩果酸對(duì)照品溶液稀釋至0.100 8 mg∕mL，精密量取齊墩果酸對(duì)照品溶液（0.100 8 mg∕mL）0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mL，置于6個(gè)10 mL試管中吹干，取5%香草酸-冰乙酸溶液0.1 mL，加高氯酸0.6 mL，60℃水浴25 min，再立即冰水浴15 min，加乙酸乙酯5 mL。采用紫外-可見(jiàn)分光光度法于551 nm處測(cè)定吸光度，以濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，回歸方程為y=8.144 2x-0.137 7，r=0.999 3。結(jié)果表明齊墩果酸在8.8～30.9 μg∕mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1 精密度試驗(yàn) 取瓜蔞（批號(hào)：20151101）蒸制品溶液0.5 mL至50 mL容量瓶中，按“2.6”項(xiàng)下方法顯色測(cè)定；取瓜蔞（批號(hào)：20151101）蒸制品溶液3 mL，按“2.6”項(xiàng)下方法顯色測(cè)定；取瓜蔞（批號(hào)：20151101）蒸制品溶液適量至容量瓶中，加水稀釋至刻度，得0.005 g∕mL的瓜蔞蒸制品稀釋液。取瓜蔞蒸制品稀釋液0.5 mL，用等量二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，吹干，按“2.6”項(xiàng)下方法顯色測(cè)定。均連續(xù)測(cè)定5次，記錄吸光度值，分別計(jì)算總氨基酸、總黃酮和總皂苷的濃度，結(jié)果RSD分別為0.90%、2.14%和0.90%，表明精密度良好。

2.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取瓜蔞（批號(hào)：20151101）蒸制品溶液，按“2.6”項(xiàng)下方法于顯色0、1、2、3、4、5 h測(cè)定吸光度值，分別計(jì)算總氨基酸、總黃酮和總皂苷的濃度，結(jié)果RSD分別為0.61%、2.00%和2.99%，表明樣品在顯色后5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取瓜蔞（批號(hào)：20151101）蒸制品，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.6”項(xiàng)下方法顯色，分別測(cè)定吸光度值，并計(jì)算總氨基酸、總黃酮和總皂苷的濃度，結(jié)果RSD分別為4.59%、2.22%和2.75%，表明重復(fù)性較好。

2.7.4 加樣回收率試驗(yàn) 精確量取已知含量的瓜蔞（批號(hào)：20151101）蒸制品溶液9份，每份0.5 mL，分別置于50 mL容量瓶中，精密量取0.5、0.7、0.9 mL的L-精氨酸對(duì)照品溶液（0.5 mg∕mL）各3份，分別置于9個(gè)樣品容量瓶中，按“2.6”項(xiàng)下方法顯色處理，用于總氨基酸加樣回收率試驗(yàn)；精確量取已知含量的瓜蔞（批號(hào)：20151101）蒸制品溶液9份，每份1.0 mL，分別置于分液漏斗中，用等量的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯于5 mL EP管并吹干，每組殘?jiān)謩e用0.88、0.78、0.68 mL無(wú)水乙醇溶解，精密量取0.12、0.22、0.32 mL 槲皮素對(duì)照品溶液（0.05 mg∕mL）各3份，分別置于9個(gè)樣品EP管中，按“2.6”項(xiàng)下方法顯色處理，用于總黃酮加樣回收率試驗(yàn)；精確吸取瓜蔞（批號(hào)：20151101）蒸制品溶液9份，每份0.5 mL，分別用等量二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷萃取液，吹干，分別依次精密加入齊墩果酸對(duì)照品溶液（0.64 mg∕mL）0.100、0.125、0.150 mL各3份，按“2.6”項(xiàng)下方法顯色處理，用于總皂苷加樣回收率試驗(yàn)。見(jiàn)表1。

2.8 樣品的測(cè)定 取瓜蔞及其蒸制品，按“2.7”項(xiàng)下方法分別測(cè)定總氨基酸、總黃酮及總皂苷的含量。見(jiàn)表2。

通過(guò)炮制前后所得總氨基酸、總黃酮、總皂苷的數(shù)據(jù)，作方差齊性檢驗(yàn)，其中F值分別為1.083、1.572、0.253，P值分別為0.328、0.245、0.628（P均大于0.05），說(shuō)明方差相等。通過(guò)雙尾檢驗(yàn)，總氨基酸組0.01＜P＜0.05，說(shuō)明炮制前后兩組總氨基酸含量比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；總黃酮和總皂苷組P均小于0.01，炮制前后含量比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 總氨基酸（A）、總黃酮（B）及總皂苷（C）加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 5批瓜蔞及其蒸制品總氨基酸、總黃酮及總皂苷的含量測(cè)定結(jié)果（，n=5）

表2 5批瓜蔞及其蒸制品總氨基酸、總黃酮及總皂苷的含量測(cè)定結(jié)果（，n=5）

注：與瓜蔞比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

總皂苷∕%24.260±0.830 25.850±0.610**樣品瓜蔞瓜蔞蒸制品總氨基酸∕%1.190±0.140 0.980±0.059*總黃酮∕%0.013±0.001 0.010±0.001**

3 討論

蒸制是中藥的一種傳統(tǒng)炮制技術(shù)，具有改變藥物性能、擴(kuò)大藥用范圍等作用。由于瓜蔞不易保存，所以在藥材市場(chǎng)上常見(jiàn)蒸制后的瓜蔞條。瓜蔞經(jīng)蒸制后，可殺死蟲(chóng)卵，且瓜蔞條不易破碎，因此更易于保存?，F(xiàn)有研究表明，瓜蔞中總氨基酸、總黃酮和總皂苷均具有生理活性〔13〕。為深入探討瓜蔞蒸制前后化學(xué)成分的變化，本試驗(yàn)采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，分別以L-精氨酸、槲皮素、齊墩果酸為對(duì)照品測(cè)定瓜蔞蒸制前后總氨基酸、總黃酮和總皂苷的含量。研究發(fā)現(xiàn)，瓜蔞經(jīng)蒸制后內(nèi)在成分含量發(fā)生明顯變化，總皂苷含量增加，總氨基酸和總黃酮含量減少，且與未蒸制的瓜蔞相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。在蒸制過(guò)程中，水蒸氣可破壞瓜蔞中一些酶類(lèi)成分，有效地保護(hù)了苷類(lèi)成分，使得瓜蔞蒸制品總皂苷的含量增加；而瓜蔞蒸制品總氨基酸、總黃酮含量降低，可能與蒸制過(guò)程中水溶性氨基酸、黃酮類(lèi)成分流失有關(guān)〔14〕。不同化學(xué)成分具有不同的生理功能，因此，瓜蔞蒸制后藥效學(xué)是否發(fā)生變化，尚須進(jìn)一步研究。

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