楊 亮，迪力夏提·金斯汗，趙 倩，朱麗萍，吳 濤，李 丹，杜 露，王 波，王喜艷

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科一病區(qū)，烏魯木齊 830000)

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素及多階段復(fù)雜的過程，乳腺癌治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是困擾臨床的難題。惡性腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移機(jī)制一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞間黏附性下降是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的因素之一。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移首先是細(xì)胞黏附性改變，黏附分子介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞彼此之間的黏附力減少，出現(xiàn)上皮間葉性改變，腫瘤開始浸潤及轉(zhuǎn)移。CDH1基因是上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)的編碼基因，而E-cadherin是重要的黏附分子。CDH1基因的失活與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究對250例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織標(biāo)本中CDH1基因啟動子區(qū)域5′-CpG島的甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，探討CDH1基因啟動子甲基化在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年1月至2011年1月本院收治的250例初診原發(fā)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者，年齡 28～75歲，中位年齡48歲；其中絕經(jīng)前患者147例，絕經(jīng)后患者103例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者(患者病理切片均由3位病理學(xué)專家進(jìn)行病理會診)；(2)入院前無放、化療及內(nèi)分泌治療史；(3)卡式功能狀態(tài)評分(KPS評分)≥80分，接受手術(shù)治療；(4)無其他系統(tǒng)惡性腫瘤病史；(5)乳腺癌患者手術(shù)前同意采集標(biāo)本并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除乳腺浸潤性小葉癌及原位癌,術(shù)前行化療、放療或內(nèi)分泌治療，排除乳腺癌轉(zhuǎn)移腫瘤及其他特殊類型乳腺腫瘤(家族性乳腺癌、肉瘤、微乳頭狀癌、淋巴瘤、妊娠期乳腺癌、炎性乳腺癌等)。本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 取患者乳腺癌組織、相應(yīng)癌旁組織、淋巴結(jié)組織及正常乳腺組織。取基因組DNA，提取的DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測E-cadherin 乳腺癌組織標(biāo)本脫蠟、水化，按試劑說明書步驟采用免疫組織化學(xué)SP法染色，抗原修復(fù)采用微波法。E-cadherin染色結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)：由3位病理專科醫(yī)師分別判定免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；免疫組織化學(xué)染色的切片中隨機(jī)選取5個高倍視野(×400倍),計(jì)算鏡下陽性細(xì)胞百分比及著色程度。E-cadherin表達(dá)以半定量法判定：中等以上染色陽性細(xì)胞數(shù)0～<11%記為0 分，11%～<26%記為1分，26%～<51%記為2分，51%～75%記為3分，>75%記為4分；評分≤2分為低表達(dá)或陰性組，評分≥3分為高表達(dá)或陽性組。

1.2.3基因組DNA的亞硫酸氫鈉修飾方法 使用亞硫酸氫鈉法進(jìn)行DNA修飾并純化保存，按使用說明書操作(EpiTect Bisulfite，美國Qiagen公司)。取10 μg DNA加入3 mol/L NaOH裂解液5 μL，37 ℃變性，放置20 min，加入2 mol/L亞硫酸氫鈉(pH 5.0)520 μL和0.2 mol/L氫醌30 μL，50 ℃水浴18 h。在1 mL DNA純化樹脂中加入處理的DNA樣品及8%異丙醇2 mL濾析，100%乙醇與3 mol/L醋酸鈉沉淀，離心，棄去上清液，干燥，加2 μL TE溶解液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4甲基特異性PCR分析 CDH1基因甲基化引物(CDH1-M)，MR：5′-TAA CTA AAA ATT CAC CTA CCG AC-3′，MF：5′-TTA GGT TAG AGG GTT ATC GCG T-3′，擴(kuò)增片段長度112 bp。CDH1基因非甲基化引物(CDH1-U)，UF：5′-TAA TTT TAG GTT AGA GGG TTA TTG T-3′,UR：5′-CAC AAC CAA TCA ACA ACA CA-3′，擴(kuò)增片段長度120 bp。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察試驗(yàn)結(jié)果：電泳中出現(xiàn)甲基化條帶且沒有非甲基化條帶判定為CDH1基因甲基化(M)；條帶中出現(xiàn)非甲基化條帶且沒有甲基化條帶判定為CDH1基因非甲基化(U)；同時(shí)出現(xiàn)甲基化和非甲基化條帶判定為半甲基化(UM)。在體外經(jīng)過甲基轉(zhuǎn)移酶處理過的乳腺組織基因組DNA(美國NEB公司)作為陽性對照，未處理的健康人乳腺組織DNA作為陰性對照，使用蒸餾水作為空白對照。

2 結(jié) 果

2.1CDH1基因啟動子甲基化在散發(fā)性乳腺癌的發(fā)生率 250例患者乳腺癌組織標(biāo)本共發(fā)現(xiàn)113例CDH1基因啟動子甲基化，甲基化率為45.20%；癌旁組織標(biāo)本中有55例CDH1基因啟動子甲基化，甲基化率為22.0%；CDH1基因啟動子甲基化率在乳腺癌組織與癌旁組織中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.156，P<0.01)。見圖1、2。

M：Marker；A、B：CDH1基因啟動子甲基特異性PCR分析；1、2、4～9：CDH1基因啟動子甲基化條帶；3：CDH1基因啟動子未甲基化條帶；NC：陰性對照；PC：陽性對照

圖1 CDH1基因啟動子甲基化與非甲基化電泳圖

圖2 乳腺癌組織與癌旁組織CDH1基因啟動子甲基化情況比較

2.2E-cadherin蛋白在CDH1基因啟動子甲基化與非甲基化乳腺癌組織的表達(dá) 113例患者乳腺癌組織CDH1基因甲基化標(biāo)本中E-cadhenrin高表達(dá)22例(19.47%)，低表達(dá)91例(80.53%)；137例患者乳腺癌組織CDH1基因非甲基化標(biāo)本E-cadhenrin高表達(dá)65例(47.44%)，低表達(dá)72例(52.55%)；E-cadhenrin表達(dá)情況在乳腺癌組織CDH1基因甲基化與未甲基化標(biāo)本中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.360，P<0.01)。見圖3、表1。

表1 乳腺癌組織CDH1基因啟動子甲基化與E-cadherin蛋白表達(dá)的關(guān)系

2.3E-cadherin在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 在正常乳腺組織中E-cadherin主要分布在乳腺導(dǎo)管上皮和乳腺腺泡上皮。免疫組織化學(xué)法染色E-cadherin陽性為細(xì)胞膜呈棕黃色顆粒著色，E-cadherin在乳腺癌組織中多呈低表達(dá)(圖4A),而在癌旁組織中多為高表達(dá)(圖4B)。E-cadherin在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞細(xì)胞膜表達(dá)減弱(圖5B)，甚至缺失(圖5A)。在250例患者乳腺癌組織中E-cadherin高表達(dá)的比率為34.80%(87/250)，低表達(dá)的比率為 65.20%(163/250)，乳腺癌組織E-cadherin高表達(dá)與低表達(dá)在乳腺癌和癌旁組織存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.435，P<0.01)。

圖3 CDH1基因啟動子甲基化與未甲基化乳腺癌組織中E-cadherin蛋白表達(dá)情況比較

A：E-cadherin在乳腺癌組織中低表達(dá)；B：E-cadherin在癌旁組織中高表達(dá)

圖4 E-cadherin在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(SP，×100)

A：E-cadherin不表達(dá)(-)；B：E-cadherin低表達(dá)(+)；C：E-cadherin高表達(dá)(++)；D：E-cadherin高表達(dá)(+++)

圖5乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中免疫組織化學(xué)染色E-cadherin在病灶中表達(dá)(SP，×200)

2.4CDH1基因mRNA的表達(dá)情況 通過反轉(zhuǎn)錄定量PCR法檢測CDH1基因mRNA在原發(fā)性乳腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌和正常乳腺組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，見圖6。CDH1基因mRNA在乳腺癌組織CDH1基因啟動子甲基化標(biāo)本中表達(dá)水平低(0.538±0.108)，在乳腺癌組織CDH1基因啟動子非甲基化標(biāo)本中表達(dá)水平較高(0.734±0.072)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.99，P<0.01 )，見圖7A。CDH1基因mRNA的表達(dá)水平在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組及正常乳腺組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.515，P<0.01)，見圖7B。

2.5乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織CDH1基因啟動子甲基化與患者病理臨床特征的關(guān)系 CDH1基因啟動子甲基化組和未甲基化組在淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、人表皮生長因子受體2(CerbB-2)表達(dá)、分子分型及腫瘤細(xì)胞組織學(xué)分級中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在民族、年齡、是否絕經(jīng)、ER表達(dá)、腫塊直徑及Ki-67表達(dá)等因素中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

E：CDH1基因mRNA(423 bp)；G：內(nèi)部控制基因GAPDH(140 bp)；B：乳腺癌組織；NS：正常乳腺組織

圖6乳腺癌和正常乳腺組織中CDH1基因mRNA的表達(dá)

A：CDH1基因啟動子甲基化與未甲基化乳腺癌組織比較；B：乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移及正常乳腺組織比較

圖7 不同組織CDH1基因mRNA表達(dá)水平比較

續(xù)表2 CDH1啟動子甲基化與乳腺癌患者臨床病理的關(guān)系

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：腋下淋巴結(jié)、前哨淋巴結(jié)鏡下宏轉(zhuǎn)移，同時(shí)包括淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，直徑<2.0 mm 的腫瘤轉(zhuǎn)移病灶、成簇腫瘤細(xì)胞及單個腫瘤細(xì)胞

2.5CDH1啟動子甲基化組和非甲基化組乳腺癌COX回歸生存分析 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌CDH1啟動子甲基化和非甲基化組隨訪60個月， CDH1啟動子甲基化(n=113)和非甲基化(n=137)組COX回歸分析乳腺癌5年生存率存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖8。COX多因素回歸分析提示:淋巴結(jié)陽性、組織學(xué)分級高、CerbB-2陽性、三陰性分子分型、 CDH1基因啟動子甲基化患者乳腺癌死亡危險(xiǎn)性高，見表3、4。

圖8 CDH1基因啟動子甲基化和非甲基化生存分析

變量變量分類及賦值分組非甲基化=0,甲基化=1淋巴結(jié)情況無=0,1～3個=1,≥4個=2組織學(xué)分級Ⅰ級=1,Ⅱ級=2,Ⅲ級=3腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0=0,N1=1,N2=2,N3=3CerbB-2陰性=0,陽性=1分子分型Luminal A=1,Luminal B=2,HER-2(+)=3,三陰性=4

表4 CDH1基因啟動子甲基化和非甲基化患者生存曲線COX多因素回歸分析

3 討 論

乳腺癌的發(fā)病率逐漸增高，已成為女性最常見的惡性腫瘤[1-2]。乳腺癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要原因[3],惡性腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移機(jī)制中首先是細(xì)胞黏附性改變，腫瘤細(xì)胞彼此之間的黏附力減少，腫瘤出現(xiàn)傾向浸潤及轉(zhuǎn)移。因此,細(xì)胞間黏附性改變是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一。E-cadherin是鈣黏附家族中重要的一員,目前研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin參與不同腫瘤的早期發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移[4-6]。其表達(dá)與多種腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移、臨床預(yù)后有密切聯(lián)系[7]。CDH1是E-cadherin蛋白編碼基因,是一種抑癌基因,抑癌基因甲基化是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中基因表達(dá)沉默的主要機(jī)制，且在某些情況下是抑癌基因失活的惟一機(jī)制。在多種腫瘤組織中均有CDH1基因表達(dá)的下調(diào),CDH1基因的表達(dá)下調(diào)除了受基因多態(tài)性、外顯子突變等因素影響外．其啟動子區(qū)域的5′-CpG島異常甲基化作用近年來被越來越多的研究者所關(guān)注[8-9]。

本研究對新疆地區(qū)250例患者乳腺癌組織標(biāo)本CDH1基因甲基化進(jìn)行了檢測,研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中CDH1基因甲基化和E-cadherin蛋白低表達(dá)相關(guān)(χ2=21.360，P<0.01),可能是引起E-cadherin蛋白低表達(dá)的主要因素。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)CDH1基因甲基化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織的甲基化表達(dá)率明顯高于無局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.086，P<0.01)。推測CDH1基因甲基化抑制了E-cadherin蛋白表達(dá),使E-cadherin不能發(fā)揮正常作用維持細(xì)胞形態(tài)及連接，導(dǎo)致細(xì)胞自腫瘤組織中脫落進(jìn)而引起腫瘤的轉(zhuǎn)移，這說明 CDH1基因改變和乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。當(dāng)然，基因表達(dá)下調(diào)除甲基化外，還有其他的一些CDH1基因改變，如基因突變也是引起基因表達(dá)下調(diào)的原因之一。章海波等[10]在肺癌中研究發(fā)現(xiàn)，CDH1基因rs16260C>A遺傳變異可顯著增加非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLS)患者確診時(shí)為晚期并發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率,CDH1基因rs16260C>A遺傳變異可促進(jìn)NSCLS的進(jìn)展[10]。因此，CDH1基因的甲基化也不能完全反映出E-cadherin的表達(dá)缺失程度。也有可能一部分腫瘤細(xì)胞的CDH1基因沒有甲基化而失活，這也可以解釋腫瘤組織中E-cadherin 蛋白表達(dá)的異質(zhì)性。本研究提示:CDH1基因啟動子甲基化和非甲基化乳腺癌患者5年生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) ，和部分研究基本一致[9]。當(dāng)然乳腺癌預(yù)后和多種因素相關(guān)，CDH1啟動子甲基化改變是否與乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)仍需要大量的研究。本研究由于樣本量偏小，研究數(shù)據(jù)尚不能確切說明影響腫瘤預(yù)后，還需要進(jìn)一步大樣本的研究。

CDH1基因甲基化的表觀遺傳學(xué)改變已經(jīng)成為腫瘤研究中重要的分子之一[11-12]，目前，DNA 甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活這一機(jī)制已基本明確，但乳腺癌中CDH1基因甲基化改變的原因及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，需進(jìn)一步積累更多的臨床資料、擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。CDH1基因信號傳導(dǎo)通路及調(diào)控機(jī)制仍需要繼續(xù)深入研究。

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