龔永謙，程愛(ài)蘭，劉 潔

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖南衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，湖南衡陽(yáng) 421001)

鼻咽癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤，其侵襲性強(qiáng)，常因出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而危及患者生命安全，導(dǎo)致死亡等不良預(yù)后情況的發(fā)生[1-2]。因此，對(duì)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)行評(píng)估干預(yù)對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。癌癥的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)因子的影響，其中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及血管形成，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移；熱休克蛋白90A(HSP90A)可通過(guò)調(diào)控EGFR等基因影響腫瘤形成和發(fā)展，并促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移；而組織蛋白酶D(cathepsin D)可通過(guò)催化、降解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞移動(dòng)和進(jìn)入血液循環(huán)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[3-4]。因此，EGFR、HSP90A和cathepsin D均可能與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能用于其侵襲轉(zhuǎn)移的評(píng)估與干預(yù)指導(dǎo)，并可能作為侵襲轉(zhuǎn)移干預(yù)的靶基因，目前關(guān)于此方向的研究甚少。本研究檢測(cè)了鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D表達(dá)情況，并分析其與腫瘤T分期、N分期及淋巴管密度(LVD)等的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月至2015年12月南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的60例鼻咽癌患者(A組)及同期30例鼻中隔偏曲患者(B組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：A組患者均行病理活檢檢查，結(jié)合臨床表現(xiàn)和鼻咽部CT檢查，確診為鼻咽癌；B組確診為鼻中隔偏曲，行手術(shù)治療并取其正常鼻甲黏膜組織用于研究；兩組性別不限，年齡大于或等于18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位原發(fā)性腫瘤、轉(zhuǎn)移癌、免疫功能障礙及其他臟器嚴(yán)重疾病患者；哺乳期或妊娠期女性；精神異?；颊叩取Ｆ渲蠥組有1例因合并肺轉(zhuǎn)移排除，1例因妊娠期排除，最終納入58例，均為低分化鱗狀細(xì)胞癌；B組未排除患者，最終納入30例。本研究符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)該院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。兩組患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 兩組基線資料比較

1.2方法

1.2.1治療方法 A組鼻咽癌患者均常規(guī)進(jìn)行同期放化療治療，B組采用鼻內(nèi)鏡手術(shù)結(jié)合抗炎等藥物治療。

1.2.2EGFR、HSP90A和cathepsin D的檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)A組活檢鼻咽癌組織和B組鼻中隔偏曲的正常鼻甲黏膜組織EGFR、HSP90A和cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)率，相關(guān)試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，具體操作如下：常規(guī)將活檢標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋后切成厚度為4 μm的連續(xù)切片，檢測(cè)前微波爐加熱后采用二甲苯液脫蠟處理3次；無(wú)水乙醇、95%和85%乙醇梯度脫水各5 min后流水沖洗3 min；檸檬酸工作液加熱煮沸15 min復(fù)原后采用7.2～7.4 pH值磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍；添加40 μL相應(yīng)的一抗后室溫(20 ℃)孵育60 min，PBS洗滌3遍；添加40 μL相應(yīng)的二抗后室溫(20 ℃)孵育30 min，PBS洗滌3遍。常規(guī)行二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，2 min后顯微鏡下觀察，顯色滿意后以清水終止反應(yīng)；常規(guī)行蘇木素復(fù)染、返藍(lán)，無(wú)水乙醇脫水、吹干、中性樹(shù)脂封片觀察。隨機(jī)選取3個(gè)高倍區(qū)域(×200)進(jìn)行觀察，cathepsin D表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，EGFR和HSP90A表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，出現(xiàn)棕黃色、棕褐色或黃色顆粒判為表達(dá)陽(yáng)性，由同一相關(guān)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)3年以上的醫(yī)師進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果讀取。

1.2.3淋巴管密度(LVD)的檢測(cè) 統(tǒng)計(jì)患者的腫瘤T分期、N分期，采用D240抗體對(duì)活檢標(biāo)本進(jìn)行LVD檢測(cè)，操作嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每份標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)高倍區(qū)域(×200)觀察記錄LVD，并取平均值為最終檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1兩組EGFR、HSP90A和cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)率比較 A組EGFR、HSP90A和cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.21%、82.76%和87.93%，均高于B組(分別為30.00%、26.67%和33.33%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2鼻咽癌組織EGFR表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較 鼻咽癌組織EGFR蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者的腫瘤T3～T4分期百分比、N2～N3分期百分比及LVD均高于EGFR蛋白表達(dá)陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 兩組EGFR、HSP90A和cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)率比較[n(%)]

表3 鼻咽癌組織EGFR蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較

表4 鼻咽癌組織HSP90A蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較

表5 鼻咽癌組織cathepsin D蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較

2.3鼻咽癌組織HSP90A表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較 鼻咽癌組織HSP90A蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者的腫瘤T3～T4分期百分比、N2～N3分期百分比及LVD均高于HSP90A蛋白表達(dá)陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.4鼻咽癌組織cathepsin D表達(dá)陽(yáng)性與陰性患者的T分期、N分期及LVD比較 鼻咽癌組織cathepsin D蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者的腫瘤T3～T4分期百分比、N2～N3分期百分比及LVD均高于cathepsin D蛋白表達(dá)陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

2.5鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D表達(dá)與其T分期、N分期及LVD的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與其T分期、N分期及LVD均呈正相關(guān)(EGFR：r=0.844、0.795、0.785；HSP90A：r=0.862、0.825、0.822；cathepsin D：r=0.842、0.815、0.863，P<0.05)。

3 討 論

鼻咽癌為我國(guó)多發(fā)惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率隨著生活方式和居住環(huán)境的改變而不斷增加，臨床發(fā)病率更是居于耳鼻喉科惡性腫瘤首位，對(duì)其進(jìn)行及時(shí)有效的診治十分重要。鼻咽癌的發(fā)生部位為鼻咽部，其中咽隱窩、側(cè)壁、頂后壁較為常見(jiàn)，臨床可表現(xiàn)為涕中帶血、耳鳴、耳閉塞感等，且其侵襲轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，可累及其他重要組織器官而嚴(yán)重危及患者健康和生命安全[5-6]。本研究亦分析了鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果顯示，鼻咽癌T3～4分期患者比例高，N2～3分期患者比例高，LVD較高，鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全，對(duì)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)行有效的防治具有重要意義。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移均涉及多個(gè)因子，而通過(guò)相關(guān)因子的檢測(cè)對(duì)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)行評(píng)估干預(yù)，從而指導(dǎo)臨床干預(yù)，減少腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移對(duì)預(yù)后造成的不良影響可能有助于其預(yù)后情況的改善。EGFR為與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的因子，可通過(guò)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和促進(jìn)腫瘤新生血管的形成而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[7-8]。HSP90A亦是與腫瘤密切相關(guān)的因子，可通過(guò)調(diào)控下游的EGFR等基因而影響腫瘤發(fā)生和發(fā)展[9]。cathepsin D則可催化和降解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞移動(dòng)和進(jìn)入血液循環(huán)提供便利，從而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[10-12]。因此，EGFR、HSP90A和cathepsin D均可能影響鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移，然而目前關(guān)于此方向的研究仍較少。因此，本研究分析了鼻咽癌患者腫瘤組織EGFR、HSP90A和cathepsin D表達(dá)情況及其與腫瘤T分期、N分期及LVD等侵襲轉(zhuǎn)移指標(biāo)的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，鼻咽癌組織的EGFR、HSP90A和cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)率均在80%以上，遠(yuǎn)高于正常鼻甲黏膜組織陽(yáng)性表達(dá)率(約30%)，提示EGFR、HSP90A和cathepsin D均可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。且本研究中鼻咽癌組織EGFR、HSP90A、cathepsin D蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者的腫瘤T3～4分期百分比、N2～3分期百分比及LVD均高于相應(yīng)蛋白表達(dá)陰性患者，提示鼻咽癌組織的EGFR、HSP90A和cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)率可能與其腫瘤T分期、N分期及LVD等侵襲轉(zhuǎn)移指標(biāo)相關(guān)。進(jìn)一步的Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)率與其T分期、N分期及LVD均密切相關(guān)，鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)患者需確定其侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生，及時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移并進(jìn)行干預(yù)，減少腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移對(duì)預(yù)后造成的不良影響，而采取措施抑制EGFR、HSP90A和cathepsin D表達(dá)可能有助于鼻咽癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療，這需要進(jìn)一步研究探討。

綜上所述， 鼻咽癌組織EGFR、HSP90A和cathepsin D陽(yáng)性表達(dá)率高且與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能用于鼻咽癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的評(píng)估，指導(dǎo)臨床進(jìn)行鼻咽癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的防治，且EGFR、HSP90A和cathepsin D可能作為鼻咽癌基因治療的靶基因。

[1]陳順金，陳靖，吳笑英，等．鼻咽癌EGFL7的表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J]．海南醫(yī)學(xué)，2016，27(16)：2618-2620．

[2]THOMPSON L D，PENNER C，HO N J，et al．Sinonasal tract and nasopharyngeal adenoid cystic carcinoma:a clinicopathologic and immunophenotypic study of 86 cases[J]．Head Neck Pathol，2014，8(1)：88-109．

[3]CARPENTER B L，CHEN M，KNIFLEY T，et al．Integrin α6β4 promotes autocrine epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling to stimulate migration and invasion toward hepatocyte growth factor (HGF)[J]．J Biol Chem，2015，290(45)：27228-27238．

[4]SNIGIREVA A V，VRUBLEVSKAYA V V，SKARGA Y Y，et al．Effect of heat shock protein 90 (Hsp90) on migration and invasion of human cancer cells in vitro[J]．Bull Exp Biol Med，2014，57(4)：476-478．

[5]王園園，賀秋艷，易紅梅，等．RKIP在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究[J]．臨床與病理雜志，2015，35(3)：375-381．

[6]SANG Y，CHEN M Y，LUO D，et al．TEL2 suppresses metastasis by down-regulating SERPINE1 in nasopharyngeal carcinoma[J]．Oncotarget，2015，6(30)：29240-29253．

[7]POSCHAU M，DICKREUTER E，SINGH-MüLLER J，et al．EGFR and β1-integrin targeting differentially affect colorectal carcinoma cell radiosensitivity and invasion[J]．Radiother Oncol，2015，116(3)：510-516．

[8]DA ROSA M R，F(xiàn)ALCO A S，F(xiàn)UZII H T，et al．EGFR signaling downstream of EGF regulates migration,invasion,and MMP secretion of immortalized cells derived from human ameloblastoma[J]．Tumour Biol，2014，35(11)：11107-11120．

[9]王亞飛．組織蛋白酶D在鼻咽癌細(xì)胞中相互作用蛋白的篩選與鑒定[D]．衡陽(yáng)：南華大學(xué)，2014．

[10]PRANJOL M Z，GUTOWSKI N，HANNEMANN M，et al．The potential role of the proteases cathepsin D and cathepsin L in the progression and metastasis of epithelial ovarian cancer[J]．Biomolecules，2015，5(4)：3260-3279．

[11]王亞飛．Cathepsin D與惡性腫瘤的關(guān)系[J]．腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2014，27(1)：79-81．

[12]BACH A S，DEROCQ D，LAURENT-MATHA V，et al．Nuclear cathepsin D enhances TRPS1 transcriptional repressor function to regulate cell cycle progression and transformation in human breast cancer cells[J]．Oncotarget，2015，6(29)：28084-28103．