鄭世楊，黃澤楠，李 璽

(中山大學附屬第三醫(yī)院甲乳外科，廣州 510000)

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，根據全球癌癥報告，2016年全球約249 260人診斷為乳腺癌，約占女性惡性腫瘤新發(fā)病例的29%[1]。探究乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的潛在機制，尋找新的治療靶點仍是目前的研究熱點。染色體結構維持蛋白4(structural maintenance of chromosome 4，SMC4)是SMC的核心成員之一，在有絲分裂過程染色體的凝集和分離中發(fā)揮著重要作用[2-3]。此外，有研究指出SMC4可能參與各種非有絲分裂的染色體功能，如維持基因的沉默狀態(tài)、DNA修復等[4]。近年來研究發(fā)現，SMC4在肝癌、結直腸癌、前列腺癌及膠質瘤等惡性腫瘤中均呈高表達，并與腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲密切相關[5-10]。目前，關于SMC4與乳腺癌的關系國內外鮮有報道。本研究著重檢測SMC4在乳腺癌組織及其對應癌旁組織中的表達，并通過小分子干擾RNA(siRNA)特異性低SMC4表達來研究其對乳腺癌細胞系MDA-MB-231的影響及潛在的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株與組織標本 人乳腺上皮細胞系(MCF10A)由本院疫苗研究所提供，人乳腺癌細胞株(MDA-MB-231、T47D、SK-BR-3、MCF7、MDA-MB-468)由中山大學腫瘤防治中心惠贈。20份組織標本取自2016年11月至2017年3月在本院手術切除的乳腺癌患者，癌旁組織距離癌組織超過3 cm，所有患者均由病理科確診為浸潤性乳腺癌，臨床資料完整。在取得組織標本前患者均未接受過放化療等其他抗腫瘤治療。

1.1.2主要試劑 胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基及蛋白胰酶均購自美國Gibco公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，CCK-8試劑購自日本東仁化學科技公司，反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自德國Roche公司，兔抗人SMC4抗體購自美國Abcam公司，兔抗人磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)抗體均購自美國CST公司。引物由Thermo Fisher Scientific公司合成。SMC4特異性siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司設計合成，其對應的靶序列是：5′-CCA CAA GAG TAG CAT ATC A-3′，轉染試劑購自廣州市銳博生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞(MDA-MB-231、T47D、SK-BR-3、MCF7、MDA-MB-468)于含有FBS(10%)、青霉素(100 U/mL)及鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM高糖培養(yǎng)基中，人乳腺上皮細胞系(MCF10A)于含有馬血清(5%)、胰島素(10 μg/mL)、表皮生長因子(20 ng/mL)、霍亂毒素(100 ng/mL)、氫化可的松(0.5 μg/mL)的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2瞬時轉染 將MDA-MB-231細胞接種到6孔板上，當細胞密度到達50%～60%時即可進行轉染。設si-SMC4組及siRNAsi-NC組，每孔按照10 μL 1×riboFECTTMCP Buffer，5 μL 20 μmol/L siRNA儲存液及10 μL riboFECTTMCP Reagent配置轉染復合物，并在室溫孵育10～15 min。然后將每孔24 μL加入6孔板中，置于37 ℃、體積分數5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后更換培養(yǎng)液，48、72 h后分別提取RNA及蛋白進行后續(xù)實驗。并設未轉染細胞為對照組。

1.2.3RNA提取及反轉錄 將20份乳腺癌組織及其癌旁組織標本在液氮中研磨成粉末，用Trizol試劑提取組織粉末、細胞總RNA，檢測RNA濃度后，按照Roche反轉錄說明書將RNA反轉錄成cDNA。

1.2.4定量PCR(qPCR)檢測SMC4 mRNA在組織及細胞中的表達 以反轉錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，檢測SMC4 mRNA在乳腺癌組織、對應的癌旁組織及各細胞系中的表達情況，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參，反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)，溶解曲線95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 20 s，97 ℃每秒0.11 ℃逐步降溫，42 ℃冷卻。以2-ΔΔCt值表示SMC4 mRNA的相對表達水平。SMC4的上游引物序列為：5′-GAC TGA ACA CGA TGA GGG TAT G-3′；下游引物序列為：5′-CAA CTC TCC GAC ACA AGA CTT TA-3′。

1.2.5蛋白質印跡法(Western blot)檢測細胞內SMC4蛋白的表達 用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，根據二喹啉甲酸(BCA)法檢測到的蛋白濃度調整上樣量，配置濃度為10%的分離膠，每條泳道上樣量為50 μg，依次進行蛋白電泳、轉膜、封閉，加入SMC4一抗(1∶300)、PI3K(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)及GAPDH一抗(1∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜。二抗室溫孵育2 h，暗室內電化學發(fā)光(ECL)顯色拍照。

1.2.6細胞增殖活性檢測 設si-SMC4組、si-NC組及對照組，每組5個復孔。取轉染24 h后細胞，消化重懸使細胞終濃度為1×104cells/mL，按1 000個/孔接種于96孔板中，置于37 ℃、體積分數5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4、5、6、7 d內取出96孔板，每孔加10 μL CCK8，再放回培養(yǎng)箱中孵育3 h，用酶標儀檢測各孔450 nm處吸光度值(A450值)。

1.2.7平板克隆實驗 取轉染24 h后細胞，消化重懸，按1 000個/孔接種于6孔板中，轉動吹打使細胞均勻分布，并置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，肉眼可見細胞集群后取出，磷酸鹽緩沖液(PBS)小心浸洗1次，用冰甲醇固定15 min，再用PBS浸洗1次，用0.1%結晶紫染色30 min，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥后，在顯微鏡下計算克隆數，最終計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?(克隆數/接種細胞數)×100%。

1.2.8細胞遷移及侵襲實驗 將600 μL含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基加入24孔板中，再將Transwell小室放入24孔板中，若為侵襲實驗，則首先需在上室加入用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的Matrigel(每孔40 μL，體積稀釋比例為1︰6)，置于細胞培養(yǎng)箱中3～4 h，待凝固后再將小室轉入已經加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)基的24孔板中。取轉染24 h后細胞消化，用300 μL無血清DMEM培養(yǎng)基重懸5×104個細胞，并接種于Transwell上室，細胞培養(yǎng)12 h后去除小室，PBS小心浸洗1次，用冰甲醇固定15 min，再用PBS浸洗1次，用0.1%結晶紫染色30 min，靜水緩慢洗去染色液，再用棉簽輕輕擦去上室未穿過小室膜的細胞，取放大倍數為100倍，鏡下觀察5個視野，計數平均細胞數。

2 結 果

2.1SMC4 mRNA在乳腺癌組織及細胞水平的表達 應用qPCR法檢測SMC4 mRNA在20例患者乳腺癌組織及對應的癌旁組織中的表達，結果發(fā)現SMC4 mRNA在70%的乳腺癌組織中高表達，其表達水平明顯高于癌旁組織(t=3.265，P<0.05)，見圖1。用同樣的方法檢測人乳腺上皮細胞(MCF10A)及人乳腺癌細胞(MDA-MB-231、T47D、SK-BR-3、MCF7、MDA-MB-468)中SMC4 mRNA的表達情況，結果顯示乳腺癌細胞中的SMC4 mRNA的表達均明顯高于MCF10A，其中MDA-MB-231細胞SMC4 mRNA表達水平最高，與MCF10A比較差異有統計學意義(t=5.09，P<0.05)，見圖2A。

圖1 SMC4 mRNA在乳腺癌組織及其對應的癌旁組織的表達情況

2.2SMC4蛋白在細胞水平的表達 應用Western blot檢測人乳腺上皮細胞(MCF10A)及人乳腺癌細胞(MDA-MB-231、T47D、SK-BR-3、MCF7、MDA-MB-468)中SMC4蛋白表達情況，與qPCR結果一致，乳腺癌細胞中SMC4蛋白表達水平明顯高于MCF10A，其中MDA-MB-231細胞SMC4蛋白水平最高，與MCF10A比較差異有統計學意義(t=4.06，P<0.05)，見圖2B。

A：SMC4 mRNA；B：SMC4蛋白；*：P<0.05，與MCF10A比較

圖2 SMC4 mRNA及蛋白在MCF10A及各乳腺癌細胞系中的表達

2.3干擾MDA-MB-231中SMC4表達效果檢測 用特異性siRNA轉染MDA-MB-231細胞后，與si-NC組相比，si-SMC4組中SMC4 mRNA及蛋白水平明顯降低，差異有統計學意義(t=3.03、4.19，P<0.05)。si-NC組及對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3A、B。

A：SMC4 mRNA；B：SMC4蛋白；*：P<0.05，與si-NC組比較

圖3 siRNA干擾后MDA-MB-231中SMC4 mRNA及

蛋白表達情況

2.4SMC4對MDA-MB-231增殖及克隆能力的影響 CCK8增殖實驗，結果顯示，在干擾后第3天，si-SMC4組(0.540±0.016)較si-NC組(0.960±0.040)增殖率明顯下降，差異有統計學意義(t=3.48，P<0.05)；對照組與si-NC組無明顯差異(P>0.05)，見圖4。干擾SMC4表達可明顯抑制MDA-MB-231細胞的克隆能力，相較于si-NC組[(46.0±2.0)%]，si-SMC4組[(18.0±1.9)%]克隆形成率明顯降低(t=19.01，P<0.05)，見圖5。

圖4 敲低SMC4表達對細胞增殖的影響

2.5SMC4對MDA-MB-231遷移及侵襲能力的影響 在Transwell遷移實驗中，si-SMC4組的穿膜細胞數明顯低于si-NC組，差異有統計學意義(t=10.18，P<0.05)，見圖6；在侵襲試驗中，相較于si-NC組，si-SMC4組的穿模細胞數明顯減少，差異均有統計學意義(t=9.89，P<0.05)，上述兩種實驗中si-NC組及對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖7。

A:平板克隆實驗中細胞克隆的代表圖；B：細胞克隆形成率；*:P<0.05,與si-NC組比較

圖5敲低SMC4表達對細胞克隆形成的影響

2.6干擾SMC4表達后對PI3K/AKT通路的影響 特異性干擾SMC4的mRNA及蛋白表達后，si-SMC4組中PI3K/AKT通路的磷酸化蛋白水平均明顯下降(p-AKT：t=6.01，P<0.05；p-PI3K：t=7.01，P<0.05)，而未磷酸化的AKT及PI3K在3組細胞間的表達均無明顯差異(P>0.05)，見圖8。

A:Transwell實驗中細胞遷移的代表圖(龍膽紫染色，×100);B:穿膜細胞數；*:P<0.05,與si-NC組比較

圖6敲低SMC4表達對細胞遷移的影響

A:侵襲實驗中細胞侵襲的代表圖(龍膽紫染色，×100);B:穿膜細胞數；*:P<0.05,與si-NC組比較

圖7敲低SMC4表達對細胞侵襲的影響

A：AKT蛋白；B：p-AKT蛋白；C：PI3K與p-PI3K蛋白

圖8敲低SMC4表達對PI3K/AKT通路的影響

3 討 論

本研究首次檢測SMC4在乳腺癌組織及細胞中的表達，發(fā)現SMC4 mRNA在乳腺癌組織中異常高表達，在乳腺癌細胞系中，SMC4 mRNA及蛋白表達均高于MFC10A。此外，本研究進一步分析siRNA干擾SMC4表達后對乳腺癌細胞的影響，發(fā)現敲低SMC4后可以抑制MDA-MB-231的增殖、遷移及侵襲，并且可能是通過抑制PI3K/AKT導致。

SMC4是染色體腺苷三磷酸(ATP)酶中SMC家族的重要組成部分之一，研究表明SMC4在真核細胞染色體的凝集和分離中有重要作用[2]，在細胞周期從G1期進展到S期時，SMC4還是維系S期正常進展的重要蛋白之一[3]。有研究指出，SMC4在肝癌組織中異常高表達，并且與腫瘤低分化、血管侵犯明顯相關[6-7]。在結直腸癌中，過表達SMC4可以促進腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲[5，8]。在前列腺癌中，高表達SMC4的患者有更高的腫瘤轉移率及較差的預后[9]。JIANG等[10]的研究顯示，上調SMC4的表達可能通過轉化生長因子β(TGF-β)/Smad信號通路促進膠質瘤細胞的侵襲性。因此，SMC4可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究通過應用qPCR檢測20例患者乳腺癌組織及對應癌旁組織、乳腺上皮細胞系(MCF10A)、乳腺癌細胞系(MDA-MB-231、T47D、SK-BR-3、MCF7、MDA-MB-468)中SMC4的表達情況。結果發(fā)現，組織水平中，SMC4在癌組織中的表達明顯高于癌旁組織(P<0.05)；在乳腺癌細胞系中SMC4的表達高于MCF10A，其中MDA-MB-231表達差異最為顯著。與此同時，本研究應用Western blot檢測SMC4蛋白在細胞系中的表達情況，與qPCR結果一致，SMC4蛋白在乳腺癌細胞系中表達較高，其中MDA-MB-231差異最為明顯。為探究SMC4表達對乳腺癌細胞功能的影響，本研究選用MDA-MB-231細胞進行細胞功能實驗。通過應用siRNA干擾SMC4的表達后，觀察到處理組細胞的增殖速度、侵襲及遷移能力均較對照組明顯降低。

在探究SMC4影響腫瘤細胞侵襲性的潛在機制時，筆者預測可能與PI3K/AKT信號通路相關。目前許多研究表明，PI3K/AKT信號通路在腫瘤細胞的遷移、增殖、侵襲等方面有重要的作用。激活的PI3K使質膜上產生3-磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3與AKT結合使其從細胞質轉移到細胞膜上獲得催化活性，由磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)、激活AKT(磷酸化)，p-AKT從細胞膜脫落后進入細胞質或細胞核，調控下游蛋白從而調控細胞生長、運動和凋亡等[11-12]。在肝癌、胃癌和結直腸癌等許多腫瘤中均有p-AKT的過度表達[13-15]。在本研究中，用特異性SMC4 siRNA轉染MDA-MB-231細胞后，處理組的p-PI3K及p-AKT蛋白表達水平較對照組均明顯減少。因此筆者推測，下調SMC4表達后抑制乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲可能與抑制了PI3K/AKT信號通路的激活相關。

綜上所述，SMC4在乳腺癌組織及細胞中均呈高表達，干擾SMC4 mRNA的表達可抑制MDA-MB-231細胞的增殖、遷移及侵襲能力，其機制可能與PI3K/AKT信號通路的激活相關?；诒敬窝芯康慕Y果，隨著以后相關實驗的開展和研究，SMC4有望成為新的治療靶點。

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