李 娜，熊 姣，王東紅

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，貴州遵義 563003)

微RNAs(microRNAs，miRNAs)是一種小分子非編碼RNA，由20～25個(gè)核苷酸組成[1]。miRNAs最早于1993年在真核生物中被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)的研究表明其能通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與目的基因mRNA的5′端或3′端相結(jié)合，介導(dǎo)目的基因mRNA的降解或者抑制其與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而降低目的基因mRNA的翻譯過(guò)程，miRNAs通過(guò)其基因調(diào)控的功能，廣泛參與真核生物細(xì)胞內(nèi)多種生物過(guò)程，包括細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞周期的調(diào)控等，同時(shí)也與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，因此對(duì)于miRNAs在生物體生長(zhǎng)發(fā)育及癌癥中的研究已成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)[2-5]。早期已有研究表明，miRNA-1285(miR-1285)在組織中的異常表達(dá)可能和多種類型的腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，如胰腺癌、肝癌等[3-5]。為探討miR-1285的表達(dá)水平在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，筆者利用熒光定量PCR的方法檢測(cè)miR-1285在卵巢癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，分析其與癌癥發(fā)生的關(guān)系；同時(shí)運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察miR-1285在人源的卵巢癌細(xì)胞(SKOV3、OVCAR3)增殖和凋亡過(guò)程中的作用，為探討其在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源 選取40例2014年9月至2015年9月來(lái)本院婦科就診的卵巢癌患者組織切片標(biāo)本，包括卵巢癌組織切片及對(duì)應(yīng)癌旁組織切片，癌組織是指取自患者卵巢癌組織區(qū)域的細(xì)胞，癌旁組織是指在患者卵巢癌組織周圍未發(fā)生壞死或癌變的正常卵巢組織細(xì)胞。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，參與此次研究的所有患者均簽署知情同意書(shū)，且均在術(shù)前3個(gè)月未接受任何關(guān)于抗癌治療的藥物或其他相關(guān)性治療的手段。

1.1.2細(xì)胞株及試劑 兩株人源的卵巢癌細(xì)胞株(SKOV3、OVCAR3)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基(貨號(hào)：SH30809)、DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：SH30033)、胎牛血清(FBS，貨號(hào)：SH30084)、0.25%的胰酶消化液(貨號(hào)SH30042)及10×磷酸鹽緩沖液(PBS，貨號(hào)：SH30256))均購(gòu)自美國(guó)Hycolone公司；TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription試劑盒(貨號(hào)：4366596)、TaqMan?Universal PCR Master Mix(貨號(hào)：4324018)均購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Lipofectamine?2000 Transfection Reagent(貨號(hào)：11668027)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：556547)購(gòu)自美國(guó)BD公司；噻唑藍(lán)(MTT，貨號(hào)：M2128)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；TRIzol試劑(貨號(hào)：15596-026)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 (1)細(xì)胞復(fù)蘇：首先取出凍存的兩株人源卵巢癌細(xì)胞(SKOV3、OVCAR3)，迅速放置于37 ℃水浴鍋中融化，然后四度低速(300 r/min)離心3 min，棄去上清液，加入1 mL含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，然后置于培養(yǎng)皿中，放入含有5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)至合適的細(xì)胞密度(70%～80%)時(shí)，對(duì)其進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：其中miR-1285 mimics及mimics control均在生工生物進(jìn)行合成(表1)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照美國(guó)Invitrogen公司的Lipofectamine?2000 Transfection Reagent說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2卵巢癌細(xì)胞系全RNA的抽提 對(duì)轉(zhuǎn)染48 h后的卵巢癌細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，收集消化后的細(xì)胞懸液于15 mL離心管中；進(jìn)行4 ℃低速(1 000 r/min)離心2 min，棄去上清液，置于冰上；加入1 mL Trizol裂解液，重懸并混勻細(xì)胞，置于冰上；向Trizol裂解液中加入200 μL氯仿，劇烈震蕩細(xì)胞懸液，室溫放置5～10 min，然后采用四度，12 000 r/min離心15 min；取離心之后的上層水相，于RNase-free的1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇，充分震蕩混勻后，于冰上放置30～40 min；取出離心管，然后再四度，12 000 r/min離心15 min，得到RNA沉淀；采用500 μL 75%乙醇對(duì)RNA沉淀進(jìn)行兩次洗滌，然后風(fēng)干；加入50 μL RNase-free的水，室溫溶解RNA；采用NanoDrop對(duì)總抽提的RNA進(jìn)行濃度測(cè)定，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 miR-1285 mimics與mimics control的序列信息

1.2.3RNA的反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 按照美國(guó)ABI公司的TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，對(duì)抽提的RNA進(jìn)行體外反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，得到Cdna產(chǎn)物；反應(yīng)條件為：16 ℃孵育30 min，42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 min，4 ℃保存。以得到的cDNA為模版，進(jìn)行熒光定量PCR，采用TaqMan?Universal PCR Master Mix 20 μL反應(yīng)體系，在羅氏LightCycler480儀器上操作，以U6作為表達(dá)檢測(cè)的內(nèi)參，ΔCT表示miR-1285的相對(duì)表達(dá)，其中ΔCT=|CTmiR-1285-CTU6|；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。

1.2.4癌細(xì)胞增殖活力的MTT檢測(cè) 首先對(duì)消化后的卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，然后將轉(zhuǎn)染miR-1285 mimics及mimics control的細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板上，其中每孔接種約5×103個(gè)細(xì)胞；在含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行一段時(shí)間的培養(yǎng)后(分別是0、24、48、72 h)，加入20 μL 5 mg/L MTT，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h；取出96孔培養(yǎng)板，將每孔中的液體吸出并加入120 μL二甲基亞砜進(jìn)行溶解；混合均勻后，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)其在570 nm處的吸光值(A570)，以反映細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱。

1.2.5癌細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染miR-1285 mimics及mimics control 24 h后的人源卵巢癌細(xì)胞取出，更換其培養(yǎng)液為不含F(xiàn)BS的無(wú)血清培養(yǎng)液，并將培養(yǎng)皿置于37 ℃，含低濃度CO2(1% CO2)的環(huán)境中，將卵巢癌細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至48 h；然后通過(guò)100 μL 0.25%胰酶對(duì)貼壁的細(xì)胞進(jìn)行消化，收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，并在避光環(huán)境中依次加入5 μL Annexin V、5 μL PI，充分混勻后，在避光環(huán)境中室溫孵育20 min，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌組織中miR-1285的表達(dá)水平 以癌細(xì)胞的U6作為內(nèi)對(duì)照，對(duì)卵巢癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中miR-1285的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁組織(5.41±1.25)，卵巢癌組織細(xì)胞中miR-1285 表達(dá)水平(2.73±1.04)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.42，P<0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染miR-1285 mimics后人卵巢癌細(xì)胞的增殖活性 根據(jù)轉(zhuǎn)染人源卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、OVCAR3的情況不同，依次分為轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染miR-1285 mimics)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染mimic control)和空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染任何microRNA)。在轉(zhuǎn)染后的4個(gè)時(shí)間段(0、24、48、72 h)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取15份平行設(shè)置的細(xì)胞樣品進(jìn)行觀察，對(duì)細(xì)胞采用MTT法檢測(cè)其A570值。結(jié)果表明，在SKOV3細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染組的A570值在24 h之后明顯低于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組(P<0.05)，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的A570值比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2；在OVCAR3細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞其A570值在48 h之后明顯低于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組(P<0.05)，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的A570值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表2 SKOV3細(xì)胞系在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的A570值(n=15,±s)

*:P<0.05，與轉(zhuǎn)染組比較

表3 OVCAR3細(xì)胞系在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處的A570值變化(n=15,±s)

*:P<0.05，與轉(zhuǎn)染組比較

圖2 OVCAR3細(xì)胞系流式分選結(jié)果

2.3轉(zhuǎn)染miR-1285 mimics后促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞凋亡 對(duì)轉(zhuǎn)染miR-1285 mimics 48 h后的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分選發(fā)現(xiàn)(圖1)，SKOV3細(xì)胞系的凋亡率升高，明顯高于轉(zhuǎn)染mimic control的陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表4。在OVCAR3細(xì)胞系中(圖2)，轉(zhuǎn)染miR-1285 mimics 48 h后，細(xì)胞的凋亡率也升高，明顯高于轉(zhuǎn)染mimic control的陰性對(duì)照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率則與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 細(xì)胞凋亡率的比較(n=15,±s，%)

*:P<0.05，與轉(zhuǎn)染組比較

3 討 論

卵巢癌在女性生殖系統(tǒng)中發(fā)病率較高，屬于常見(jiàn)惡性腫瘤，約占女性生殖系腫瘤的三分之一，其發(fā)病十分隱匿，對(duì)患者的早期診斷造成了較大的困難，臨床上被診斷為卵巢癌的患者70%以上已發(fā)生了盆腔等多處組織的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其5年生存率低于30%[6]。臨床上關(guān)于卵巢癌的發(fā)病病因還不是十分清楚，其病理也較為復(fù)雜，缺少有效的治療手段，目前還未有明確的臨床指標(biāo)可對(duì)卵巢癌的診斷及治療提供參考[7]。因此，對(duì)卵巢癌發(fā)病機(jī)制的研究顯得尤為關(guān)鍵。miRNAs是一類存在于細(xì)胞內(nèi)，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，自從20世紀(jì)90年代LEE等[5]在真核生物中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA(Lin4)之后，學(xué)者們對(duì)miRNAs進(jìn)行了一系列的后續(xù)研究，發(fā)現(xiàn)miRNAs通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，與其靶基因結(jié)合，可調(diào)控基因的表達(dá)，從而參與細(xì)胞的增殖和分化[8]。在對(duì)癌癥細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNAs在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用，其通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的傳導(dǎo)，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡過(guò)程等[9]。有研究報(bào)道，通過(guò)利用miRNA芯片技術(shù)，分別檢測(cè)人源卵巢癌細(xì)胞系及正常卵巢上皮細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，一共檢查到173個(gè)miRNAs的表達(dá)，其中在兩種細(xì)胞系中共同表達(dá)的miRNAs共160個(gè)，有35個(gè)miRNAs表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中表達(dá)下調(diào)的miRNAs有31個(gè)，表達(dá)上調(diào)的miRNAs有4個(gè)，在這4個(gè)下調(diào)的miRNAs中，包含兩個(gè)具有抑制腫瘤發(fā)展的miRNAs，分別是let-7d與miRNA-127，暗示著miRNAs與卵巢癌的發(fā)生有一定的相關(guān)性[10]。有學(xué)者對(duì)106例卵巢癌患者進(jìn)行分期，即早期組卵巢癌和晚期組卵巢癌患者，采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)卵巢癌組織中miRNAs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩組存在44個(gè)miRNAs基因的表達(dá)差異，且在晚期卵巢癌患者中表達(dá)均下調(diào)，包括具有腫瘤抑制功能的miR34a及miR15a等，表明在卵巢癌的發(fā)展過(guò)程中miRNAs起著重要的作用[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-1285與卵巢癌的發(fā)生十分相關(guān)，其在卵巢癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織；除此之外，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，miR-1285的表達(dá)升高，會(huì)致使癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降，同時(shí)導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡率明顯升高，表明miR-1285與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，miR-1285可能作為卵巢癌細(xì)胞中的抑癌因子，在癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程中發(fā)揮功能。分析其發(fā)揮功能的可能機(jī)制：有研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中miR-1285與相關(guān)蛋白結(jié)合，以miRNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(miRISC)蛋白復(fù)合體的形式與靶基因YAP1的mRNA相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平抑制其翻譯過(guò)程，從而達(dá)到抑癌的作用[12]；另有研究報(bào)道，miR-34c與miR34b通過(guò)調(diào)控靶基因P53的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致卵巢癌的發(fā)生[13]；miR214則通過(guò)負(fù)調(diào)控第10號(hào)染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源物基因(PTEN)的表達(dá)，參與蛋白激酶B(AKT)通路，從而在卵巢癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中起作用[14]；miR-210通過(guò)對(duì)靶基因組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的調(diào)控，參與腫瘤轉(zhuǎn)移時(shí)血管的生成[15]。

綜上所述，miRNAs通過(guò)調(diào)控不同的靶基因參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。本文通過(guò)對(duì)40例卵巢癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，miR-1285與卵巢癌的發(fā)生、卵巢癌細(xì)胞的增殖及凋亡密切相關(guān)，表明其在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，但是至于該過(guò)程中的具體分子機(jī)制，還有待進(jìn)一步的探索。本研究為了解miR-1285與卵巢癌發(fā)生的關(guān)系奠定了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]ZHANG B H，PAN X P，COBB G P，et al．MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J]．Dev Bio，2007，30(2)：1-12．

[2]CHENG H Y，OBRIETAN K．Revealing a role of microRNAs in the regulation of the biological clock[J]．Cell Cycle，2007，6(24)：3034-3035．

[3]李澤夏，劉海玲，呂輝，等．與卵巢癌轉(zhuǎn)移有關(guān)的microRNA研究進(jìn)展[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，11(14)：2793-2796．

[4]朱清，許波，劉雨生．microRNA在卵巢和卵巢癌中的表達(dá)及功能[J]．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49(5)：694-697．

[5]LEE R C，F(xiàn)EINBAUM R L，AMBROS V．The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]．Cell，1993，75(5)：843-854．

[6]李楠，張夢(mèng)真．MicroRNA在卵巢癌中的研究進(jìn)展[J]．現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2013，22(9)：765-766．

[7]IORIO M V，VISONE R，DI LEVA G，et al．MicroRNA signatures in human ovarian cancer[J].Cancer Res，2007，67(18)：8699-8707．

[8]KAWAMATA T，SEITZ H，TOMARI Y．Structural determinants of miRNAs for RISC loading and slicer-independent unwinding[J]．Nat Struct Mol Biol，2009，16(9)：953-960．

[9]CORNEY D C，F(xiàn)LESKEN-NIKITIN A，GODWIN A K，et al．MicroRNA-34b and MicroRNA-34c are targets of p53 and cooperate in control of cell proliferation and adhesion-independent growth[J]．Cancer Res，2007，67(18)：8433-8438．

[10]NAM E J，YOON H，KIM S W，et al．MicroRNA expression profiles in serous ovarian carcinoma[J]．Clin Cancer Res，2008，14(9) ：2690-2695．

[11]NICOLOSO M S，SPIZZO R，SHIMIZU M，et al．MicroRNAs--the micro-steering wheel of tumour metastases[J]．Nat Rev Cancer，2009，9(4)：293-302．

[12]雙婷，吳建磊，朱彥麗．耐藥與敏感卵巢癌組織中microRNA表達(dá)差異譜檢測(cè)及分析[J]．中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2013，29 (1)：33-35．

[13]黃華．MiR-1285對(duì)胰腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制[D]．北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2015．

[14]LAIOS A，O′TOOLE S，F(xiàn)LAVIN R，et al．Potential role of miR-9 and miR-223 in recurrent ovarian cancer[J]．Mol Cancer，2008，7：35．

[15]田姝．MicroRNA-1285靶向調(diào)控p53的實(shí)驗(yàn)研究[D]．上海：復(fù)旦大學(xué)，2010．