孫召東，張 婷，霍 娟，李 偉△

(江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.中心實(shí)驗(yàn)室 222001)

胃癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)每年新增胃癌患者數(shù)量高達(dá)40多萬(wàn)，其發(fā)病率及病死率在腫瘤相關(guān)疾病中排第3位[1]。針對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究也因此備受我國(guó)學(xué)者的關(guān)注。目前，腫瘤微環(huán)境對(duì)胃癌的影響已成為研究熱點(diǎn)之一[2-3]。其中，間質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)與巨噬細(xì)胞等微環(huán)境細(xì)胞之間的相互作用對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展的影響引起了科學(xué)家們的廣泛興趣。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織來(lái)源的MSCs(gastric cancer-derived MSCs，GC-MSCs)對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及促血管生成能力具有明顯的促進(jìn)作用，且該作用與非腫瘤組織來(lái)源的MSCs，如胃癌癌旁組織來(lái)源的MSCs(GCN-MSCs)、骨髓來(lái)源的MSCs(BM-MSCs)相比更強(qiáng)[4]。然而，GC-MSCs發(fā)揮促胃癌作用的機(jī)制尚不清楚。大量研究證實(shí)，MSCs具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的作用，而M2亞型巨噬細(xì)胞已被證實(shí)可明顯促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移[5-6]。為此，本研究旨在探討胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，腫瘤組織內(nèi)M2亞型巨噬細(xì)胞對(duì)GC-MSCs促胃癌效應(yīng)的影響，并通過(guò)體外研究驗(yàn)證GC-MSCs誘導(dǎo)胃癌微環(huán)境巨噬細(xì)胞向M2亞型極化的調(diào)節(jié)作用，為研究胃癌的發(fā)病機(jī)制提供更多的理論依據(jù)，并為胃癌的臨床治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源 留取本院胃癌切除手術(shù)患者新鮮胃癌及癌旁組織(距癌變部位5 cm以上，病理檢查無(wú)癌組織)，取材均取得患者家屬同意并簽署知情同意書(shū)。所有患者術(shù)前均未接受任何放化療，術(shù)后經(jīng)病理確診為胃腺癌。

1.1.2主要儀器與試劑 L-DMEM營(yíng)養(yǎng)液、RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；氯磷酸鹽脂質(zhì)體(clodronate liposome，lipo-MBP)和對(duì)照(PBS liposome，lipo-PBS)(荷蘭Nicovan Rooijen公司)；佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA,美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；Transwell板(美國(guó)Corning公司)；兔抗小鼠F4/80抗體和羊抗小鼠Ki67抗體(英國(guó)Abcam公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Roche Diagnostics公司)；PCR試劑盒(日本Takara公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；NanoDrop-2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；PCR儀(Veriti 96)(美國(guó)Applied Biosystems公司)；全自動(dòng)凝膠成像儀(北京吉諾思科貿(mào)公司)。

1.2方法

1.2.1巨噬細(xì)胞體內(nèi)清除 lipo-MBP或lipo-PBS分別按照100 μL/10 g小鼠體質(zhì)量的劑量經(jīng)尾靜脈注射，以清除體內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞，每4天注射1次，直至實(shí)驗(yàn)觀察期結(jié)束(14 d)。

1.2.2裸鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn) 選取3～4周齡雌性BALB/c裸鼠共20只，均購(gòu)自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院[生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蘇)2015-0001]。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于本院神經(jīng)醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心飼養(yǎng)，并分為4組：lipo-PBS+BGC-823組、lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組、lipo-MBP+BGC-823組及l(fā)ipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組。皮下接種細(xì)胞14 d后，脫頸處死小鼠，剝離腫瘤組織，記錄其質(zhì)量與體積后進(jìn)行組織學(xué)分析。

1.2.3免疫組織化學(xué)法 將裸鼠皮下致瘤瘤體浸泡于中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，經(jīng)抗原修復(fù)處理后，依次加入Ki67抗體及生物素標(biāo)記的二抗后孵育并顯色。倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：棕黃色顆粒顯像為Ki67表達(dá)陽(yáng)性反應(yīng)。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 法 收集lipo-PBS+BGC-823組和lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組裸鼠致瘤組織5對(duì)及胃癌患者癌與癌旁組織3對(duì)，TRIzol裂解后抽提組織來(lái)源總RNA。此外，采用20 ng/mL PMA刺激人單核細(xì)胞株THP-1分化為巨噬細(xì)胞后，將其與GC-MSCs進(jìn)行體外共培養(yǎng)。72 h后，收集各處理組細(xì)胞并以TRIzol裂解抽提總RNA。小鼠iNOS、Ym-1和β-actin引物，人iNOS、Ym-1、Fizz-1和β-actin引物采用Primer Software軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)。利用NanoDrop-2000分光光度計(jì)對(duì)總RNA的純度和含量進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)試劑盒提供的方案，以Superscript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶在40 μL反應(yīng)體系內(nèi)對(duì)3 μg總RNA進(jìn)行cDNA合成。25 μL PCR反應(yīng)混合體系中分別含有Premix Ex Taq 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL 及2 μL cDNA模板。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；退火溫度(Tm)30 s，72 ℃ 30 s,25～35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè) 收集小鼠及胃癌患者腫瘤組織，裂解液冰上提取蛋白。此外，將THP-1分化來(lái)源巨噬細(xì)胞與GC-MSCs進(jìn)行72 h體外共培養(yǎng)，收集各處理組細(xì)胞并以裂解液冰上提取蛋白。取等量蛋白，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳進(jìn)行蛋白分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%(質(zhì)量/體積)脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗[抗Arginase-1、趨化因子受體-2(CCR-2)和β-actin]后，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜3次，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯色。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并分析Western blot結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1巨噬細(xì)胞對(duì)GC-MSCs促胃癌效應(yīng)的影響 裸鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組腫瘤體積及質(zhì)量均明顯高于lipo-PBS+BGC-823組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009、0.001)，見(jiàn)圖1。采用lipo-MBP清除裸鼠體內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，lipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組的腫瘤體積及質(zhì)量與lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組相比明顯減小(P=0.028、0.009，圖1)，體內(nèi)清除巨噬細(xì)胞顯著抑制了GC-MSCs的促胃癌效應(yīng)。然而，lipo-PBS+BGC-823組和lipo-MBP+BGC-823組裸鼠皮下致瘤能力相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.251、0.175，圖1)。

2.2巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌組織中腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響 裸鼠腫瘤組織蘇木素-伊紅(HE)染色結(jié)果顯示，lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組腫瘤病理組織學(xué)惡性程度最高，而給予巨噬細(xì)胞清除的lipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組腫瘤惡性程度則明顯降低(圖2)。腫瘤組織Ki67免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯高于lipo-PBS+BGC-823組，而體內(nèi)清除巨噬細(xì)胞后lipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組裸鼠腫瘤組織中Ki67陽(yáng)性增殖細(xì)胞數(shù)量較lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組明顯減少(圖2)。此外，lipo-PBS+BGC-823組和lipo-MBP+BGC-823組胃癌組織中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量并無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2。

2.3裸鼠致瘤組織中M2亞型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，GC-MSCs共注射組腫瘤組織中iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯低于BGC-823單獨(dú)注射組；相反，M2亞型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因Ym-1在GC-MSCs共注射組腫瘤組織中顯著高表達(dá)，見(jiàn)圖3A。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，M2亞型巨噬細(xì)胞主要的兩種相關(guān)蛋白精氨酸酶(Arginase-1)和CCR-2在GC-MSCs共注射組中的表達(dá)水平均明顯高于BGC-823單獨(dú)注射組，見(jiàn)圖3B。

表1 巨噬細(xì)胞M2亞型相關(guān)基因擴(kuò)增上下游引物

A：BGC-823細(xì)胞皮下注射14 d后裸鼠致瘤情況；B：不同處理組腫瘤組織質(zhì)量(n=5)；C：不同處理組腫瘤組織體積(n=5)；*：P<0.01；#：P<0.05

圖1巨噬細(xì)胞清除對(duì)GC-MSCs促胃癌能力的影響

圖2 不同處理組裸鼠致瘤組織HE染色及Ki67免疫組織化學(xué)染色(×200)

A：RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；B：Western blot檢測(cè)結(jié)果

圖3 M2亞型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因在裸鼠腫瘤組織中的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況

2.4胃癌患者腫瘤組織中M2亞型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況 本研究選擇并觀察了3例臨床胃癌患者癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中M2亞型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)情況，由此判斷M2亞型巨噬細(xì)胞與GC-MSCs的組織學(xué)定位相關(guān)性。RT-PCR結(jié)果顯示，M1亞型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因iNOS在3例患者癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于癌組織，而Ym-1在3例癌組織中的轉(zhuǎn)錄均明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，見(jiàn)圖4A。Western blot檢測(cè)結(jié)果也表明，M2亞型巨噬細(xì)胞相關(guān)蛋白Arginase-1和CCR-2在癌組織中表達(dá)水平高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，見(jiàn)圖4B。

A：RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；B：Western blot檢測(cè)結(jié)果

圖4 M2亞型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因在胃癌患者癌及癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況

2.5GC-MSCs體外共培養(yǎng)對(duì)巨噬細(xì)胞向M2亞型轉(zhuǎn)換的影響 本研究分別采用間接與直接接觸共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了GC-MSCs對(duì)巨噬細(xì)胞亞型轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)作用。培養(yǎng)72 h后RT-PCR結(jié)果顯示，GC-MSCs與巨噬細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)后其M2亞型巨噬細(xì)胞相關(guān)基因Ym-1、Fizz-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于對(duì)照組，見(jiàn)圖5A。此外，巨噬細(xì)胞中Arginase-1和CCR-2蛋白的表達(dá)水平在GC-MSCs與巨噬細(xì)胞直接接觸共培養(yǎng)后也明顯升高，見(jiàn)圖5B。

A：RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；B：Western blot檢測(cè)結(jié)果

圖5 GC-MSCs對(duì)巨噬細(xì)胞亞型轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)作用

3 討 論

大量研究表明，基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)為腫瘤細(xì)胞提供有利微環(huán)境而在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。HASHIMOTO等[8]研究報(bào)道，巨噬細(xì)胞和BM-MSCs可被募集入神經(jīng)母細(xì)胞瘤局部并分別活化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞及癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，從而為癌癥的發(fā)生、發(fā)展提供有利的微環(huán)境。同時(shí)，MSCs、巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞三者之間的相互作用也已被證實(shí)在多種不同腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。YANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞活化后的BM-MSCs可獲得促炎表型，且通過(guò)核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路的活化而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖與遷移。CHATURVEDI等[10]則指出，三陰性乳腺癌細(xì)胞與MSCs之間可通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)依賴(lài)的信號(hào)通路相互作用，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞向原發(fā)性乳腺腫瘤局部的遷移富集。然而，腫瘤微環(huán)境局部MSCs、巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互調(diào)節(jié)，尤其基質(zhì)細(xì)胞MSCs與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞之間的相互作用及其對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響尚有待深入研究。

胃癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，同時(shí)也是一類(lèi)典型的炎癥相關(guān)性腫瘤。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，GC-MSCs通過(guò)分泌大量白細(xì)胞介素-8(IL-8)發(fā)揮較強(qiáng)的促胃癌作用[4]。盡管如此，GC-MSCs促腫瘤作用的機(jī)制，尤其是GC-MSCs與其他基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展的影響尚無(wú)報(bào)道。ZHU等[11]研究指出，GC-MSCs與中性粒細(xì)胞之間的相互作用促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的侵襲及促血管生成能力，進(jìn)而促成了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性播散。本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在GC-MSCs的體內(nèi)促胃癌效應(yīng)中發(fā)揮必不可少的作用，清除巨噬細(xì)胞后裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制。REN等[12]認(rèn)為，淋巴瘤組織來(lái)源的MSCs(lymphoma-derived MSCs，L-MSCs)可明顯促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)了單核/巨噬細(xì)胞(而非中性粒細(xì)胞)介導(dǎo)了L-MSCs的促腫瘤效應(yīng)。這一結(jié)論與本研究是一致的。因此，深入研究腫瘤微環(huán)境中MSCs與巨噬細(xì)胞之間的相互作用將為闡明腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供更多的信息。

目前，腫瘤基質(zhì)中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞已被證實(shí)在腫瘤組織維持自身穩(wěn)定及生長(zhǎng)的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。它們主要分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(M1)及替代活化的巨噬細(xì)胞(M2)兩種不同亞型。其中，M2亞型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤增殖并與多種不同腫瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)。盡管如此，腫瘤組織中M2亞型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)制尚不清楚。MATHEW等[14]研究了胰腺癌組織來(lái)源的MSCs，并證實(shí)該MSCs促腫瘤生長(zhǎng)的作用與其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2亞型極化密切相關(guān)。本研究中，聚集了GC-MSCs細(xì)胞的人、小鼠胃癌組織被檢測(cè)出較高比例的M2亞型巨噬細(xì)胞。此外，在GC-MSCs與巨噬細(xì)胞的體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)GC-MSCs直接接觸培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中M2亞型相關(guān)基因Ym-1、Fizz-1的mRNA轉(zhuǎn)錄及Arginase-1和CCR-2蛋白的表達(dá)水平均顯著增高，初步證實(shí)GC-MSCs促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1向M2亞型轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，胃癌微環(huán)境中M2亞型巨噬細(xì)胞參與了GC-MSCs的促腫瘤效應(yīng)。同時(shí)，腫瘤基質(zhì)中GC-MSCs對(duì)巨噬細(xì)胞由M1向M2亞型的極化過(guò)程具有調(diào)節(jié)作用?？梢?jiàn)，GC-MSCs與巨噬細(xì)胞之間的相互作用推進(jìn)了胃癌發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程，有望為臨床靶向治療提供更多的理論指導(dǎo)。

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