殷新明，許文林，朱小蘭，劉月琴

(江蘇大學(xué)第四附屬醫(yī)院/鎮(zhèn)江市婦幼保健院婦科，江蘇鎮(zhèn)江 212001)

宮頸癌是世界范圍內(nèi)的第三大女性常見癌癥，伴有較高的病死率[1]。宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是宮頸癌的癌前病變，從CIN發(fā)展到宮頸癌需經(jīng)歷一段較長(zhǎng)的時(shí)間[2]，在這個(gè)過(guò)程中如果進(jìn)行規(guī)范的宮頸癌篩查，及時(shí)早期作出診斷并實(shí)施規(guī)范的治療，發(fā)生宮頸浸潤(rùn)癌的概率會(huì)大大降低[3]。因此，重視CIN的早期診治，可以在CIN階段阻斷宮頸癌的發(fā)生。本文通過(guò)探討各期CIN(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí))及宮頸癌組織中變異型分化抗原簇44(17)(CD44v17)的表達(dá)變化及意義，并進(jìn)一步研究CD44v17與基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原Ki67的關(guān)系，為CIN及宮頸癌的早期診斷、早期治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人宮頸癌Hela和Siha細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～5周齡雌性BALB/c(nu/nu)裸鼠28只，體質(zhì)量14～17 g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，在本院中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為20～22 ℃的屏蔽系統(tǒng)，室內(nèi)相對(duì)濕度為40%～60%，無(wú)特定病原體。裸鼠以高壓滅菌的水和標(biāo)準(zhǔn)飼料飼喂。

1.1.3臨床資料 選取2014年1月至2016年12月于本院婦科陰道鏡室檢查的患者400例，將其分為5組：正常宮頸、CINⅠ級(jí)、CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌，每組80例。所有CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌均經(jīng)后續(xù)的宮頸錐形切除或子宮切除證實(shí)相符。

1.1.4實(shí)驗(yàn)試劑 TRIzol試劑、RNA酶抑制劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司(RR716)。引物均由廣州復(fù)能基因有限公司合成。CD44v17 siRNA序列及CD44v17 shRNA慢病毒顆粒由上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)有限公司合成構(gòu)建。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 患者陰道鏡下活檢時(shí)同時(shí)取材，取材后立即于-80 ℃下凍存。正常宮頸組織取自子宮良性疾病行全子宮切除標(biāo)本，且術(shù)前人乳頭瘤病毒(HPV)檢查陰性、液基薄層細(xì)胞檢測(cè)(TCT)未見異常、術(shù)后病理宮頸無(wú)異常。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法 人宮頸癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。目的基因的檢測(cè)包括：(1)細(xì)胞總RNA的提取。(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)水平。采用2-ΔΔCt法對(duì)目的基因相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行分析，以內(nèi)參基因三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為標(biāo)準(zhǔn)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCt(對(duì)照組)，ΔCt=Ct目的mRNA-CtGAPDH mRNA。計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于校準(zhǔn)內(nèi)參組目標(biāo)基因增加或減少的倍數(shù)。(4)選用前期體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有效的CD44v17 siRNA序列，宮頸癌HeLa和宮頸癌SiHa細(xì)胞干擾CD44v17 siRNA后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Ki67和MMP9的表達(dá)。(5)取BALB/c裸鼠28只，背部皮下接種1×106個(gè)細(xì)胞/只。每隔3 d用測(cè)量裸鼠皮下腫瘤的長(zhǎng)短徑計(jì)算體積并繪制出腫瘤生長(zhǎng)曲線[腫瘤體積(TV)=長(zhǎng)徑(mm)×短徑2(mm2)×0.5]。待所有皮下瘤生長(zhǎng)至最大直徑大于或等于5 mm時(shí)，隨機(jī)分為兩組：CD44v17 shRNA慢病毒顆粒組、siRNA陰性對(duì)照組，每組14只，繼續(xù)飼養(yǎng)。各組瘤體內(nèi)分別注射陰性對(duì)照病毒顆粒(0.5×108TU/mL)、含CD44v17基因慢病毒顆粒(0.5×108TU/mL)相應(yīng)藥物100 μL，每3天1次，共6次。慢病毒顆粒注射后第20天，取腫瘤組織。

2 結(jié) 果

2.1組織中CD44v17的表達(dá) 正常宮頸組織、CIN組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織的CD44v17表達(dá)陽(yáng)性率逐漸升高，呈遞增趨勢(shì)。以正常宮頸組織作為對(duì)照，CINⅠ級(jí)組織CD44v17表達(dá)水平上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056 0)；CINⅡ、CINⅢ級(jí)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織CD44v17表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ級(jí)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織CD44v17表達(dá)水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

*：P<0.01，與正常宮頸組織比較；#：P<0.01，與CINⅠ級(jí)組織比較；△：P<0.01，與CINⅡ級(jí)組織比較；▽：P<0.01，與CINⅢ級(jí)組織比較

圖1 CD44v17在各級(jí)CIN和宮頸癌中的表達(dá)

2.2組織中MMP9的表達(dá) 在CIN向?qū)m頸癌演變進(jìn)展過(guò)程中，組織中MMP9的表達(dá)呈逐漸升高的趨勢(shì)，在CINⅢ級(jí)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織間MMP9的增幅更加明顯。以正常宮頸組織作為對(duì)照，CINⅠ級(jí)組織MMP9表達(dá)水平上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.061 2)；CINⅡ、CINⅢ級(jí)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織MMP9表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ級(jí)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織間MMP9表達(dá)水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(其中CINⅡ級(jí)和CINⅢ級(jí)組織間P<0.05，其余P<0.01),見圖2。

*：P<0.01，與正常宮頸組織比較；#：P<0.01，與CINⅠ級(jí)組織比較；△：P<0.05，▲:P<0.01,與CINⅡ級(jí)組織比較；▽：P<0.01，與CINⅢ級(jí)組織比較

圖2宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中MMP9的表達(dá)

2.3組織中Ki67的表達(dá) 在CIN向?qū)m頸癌演變進(jìn)展過(guò)程中，組織中Ki67的表達(dá)呈逐漸升高的趨勢(shì)，且病變級(jí)別越高，Ki67的增幅越明顯。以正常宮頸癌組織作為對(duì)照，CINⅠ級(jí)組織Ki67的表達(dá)水平上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.079 0)；CINⅡ、CINⅢ級(jí)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織Ki67的表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(正常宮頸與CINⅡ級(jí)組織間P<0.05，其余P<0.01)。CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ級(jí)和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織Ki67的表達(dá)水平兩兩比較，CINⅠ級(jí)和CINⅡ級(jí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.119 5)，其余差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(其中CINⅡ級(jí)和CINⅢ級(jí)間P<0.05，其余P<0.01)，見圖3。

*：P<0.05，#：P<0.01，與正常宮頸組織比較；△：P<0.01，與CINⅠ級(jí)組織比較；▽：P<0.05，▲：P<0.01，與CINⅡ級(jí)組織比較；▼：P<0.01，與CINⅢ級(jí)組織比較

圖3宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌組織中Ki67的表達(dá)

2.4CD44v17對(duì)MMP9、Ki67表達(dá)的影響 人宮頸癌Hela和Siha細(xì)胞干擾CD44v17 siRNA后，MMP9、Ki67的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Hela和Siha細(xì)胞的表達(dá)相似，圖為Hela細(xì)胞表達(dá),見圖4。

2.5CD44v17對(duì)荷瘤裸鼠成瘤的影響 CD44v17 shRNA慢病毒顆粒組的腫瘤體積明顯小于siRNA陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；腫瘤質(zhì)量也明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖5～7。

A：MMP9的表達(dá)；B：Ki67的表達(dá)；*：P<0.000 1，與siRNA陰性對(duì)照比較

圖4干擾CD44v17 siRNA后宮頸癌細(xì)胞MMP9與Ki67的表達(dá)

圖5 兩組荷瘤裸鼠腫瘤體積比較

*：P<0.000 1，與shRNA陰性對(duì)照組比較

圖6兩組荷瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量比較

A：shRNA陰性對(duì)照組；B：CD44v17 siRNA慢病毒顆粒組

圖7兩組荷瘤裸鼠

3 討 論

CD44基因蛋白與透明質(zhì)酸等基質(zhì)中的分子結(jié)合，可以促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。BOURGNIGNON等[4]認(rèn)為，CD44通過(guò)與透明質(zhì)酸結(jié)合，可以激活酪氨酸激酶，從而下調(diào)腫瘤抑制蛋白，重塑細(xì)胞骨架，使癌細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)。研究表明，某些CD44分子表達(dá)異常可顯著提高惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[5-6]，并且與腫瘤惡性程度密切相關(guān)[7]。CD44剪接變異體(CD44v)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要因素，可以作為一個(gè)較好的預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散能力和預(yù)后情況的指標(biāo)[8]。

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的主要障礙，在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中必須水解ECM[9]，這一過(guò)程需要多種蛋白水解酶，其中常見的水解酶有基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs)。這一家族中MMP9是Ⅳ型膠原降解的主要作用酶之一，在其作用下ECM中的Ⅳ型膠原降解，破壞ECM并促進(jìn)腫瘤血管形成，推動(dòng)了惡性腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的進(jìn)程。腫瘤分期、惡性程度、轉(zhuǎn)移能力與MMP9的表達(dá)水平呈正相關(guān)[10-11]。Ki67是一種與DNA結(jié)合的核內(nèi)蛋白，僅表達(dá)于細(xì)胞增殖期，能夠較好地判斷腫瘤的生長(zhǎng)增殖特性，與腫瘤的侵襲性呈正相關(guān)，因此Ki-67可作為判斷腫瘤侵襲性的指標(biāo)之一[12-13]。腫瘤組織Ki67陽(yáng)性率升高，說(shuō)明腫瘤組織中處于增殖周期的細(xì)胞比例越高，即Ki67陽(yáng)性率越高，腫瘤生長(zhǎng)越快、分化越差。

目前普遍認(rèn)為宮頸癌是人類惟一一種可以阻斷的癌癥。CIN為絕大多數(shù)浸潤(rùn)性宮頸癌浸潤(rùn)發(fā)生之前的一個(gè)必經(jīng)時(shí)期，在這個(gè)過(guò)程中如果進(jìn)行規(guī)范的宮頸癌篩查，及時(shí)作出正確診斷并實(shí)施規(guī)范有效的治療，完全可以在該階段阻斷宮頸癌的發(fā)生，發(fā)生宮頸浸潤(rùn)癌的概率會(huì)大大降低[3]，從這一角度顯示出早期診斷治療CIN的重要性。

在本實(shí)驗(yàn)中CD44v17的表達(dá)在正常宮頸組織、逐級(jí)升高的CIN組織和宮頸癌組織中逐漸升高，說(shuō)明CD44v17介入了宮頸癌腫瘤的進(jìn)展過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，CD44v17的表達(dá)發(fā)生改變從CINⅡ級(jí)后開始，在CINⅢ級(jí)與宮頸癌組織間的差異尤為明顯。CINⅠ級(jí)有可能向正常組織轉(zhuǎn)變，臨床傾向于觀察，CINⅡ、CINⅢ級(jí)患者需進(jìn)一步治療。本研究CIN組織中CD44v17、MMP9、Ki67的表達(dá)逐漸升高，在CINⅠ級(jí)組織中表達(dá)升高不明顯，與臨床處置相吻合，病變繼續(xù)升級(jí)后CD44v17、MMP9、Ki67的增幅明顯增加。CD44v17能抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的增殖遷移能力，從而促進(jìn)宮頸癌腫瘤生長(zhǎng)[14]。本研究在宮頸癌細(xì)胞株中干擾宮頸癌細(xì)胞CD44v17 siRNA后MMP9、Ki67的表達(dá)明顯降低，說(shuō)明CD44v17、MMP9和Ki67在宮頸癌腫瘤細(xì)胞增殖和組織浸潤(rùn)過(guò)程中共同起到了重要作用。荷瘤裸鼠體內(nèi)成瘤情況顯示，干擾CD44v17 siRNA后荷瘤裸鼠成瘤的體積和質(zhì)量均明顯降低，成瘤能力明顯降低，說(shuō)明在體內(nèi)CD44v17有促進(jìn)宮頸癌腫瘤組織生長(zhǎng)的作用。

綜上所述，CD44v17可促進(jìn)宮頸癌腫瘤細(xì)胞增殖、組織浸潤(rùn)，在CIN向?qū)m頸癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中可能起到一定的促進(jìn)作用，其機(jī)制將是今后研究工作的重點(diǎn)。CD44v17有望作為判定CIN是否具有惡變潛能及預(yù)后的重要指標(biāo)之一，在臨床工作中，可以通過(guò)檢測(cè)CD44v17、MMP9和Ki67，評(píng)價(jià)CIN及宮頸癌患者的篩查、診斷，并有可能成為宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。

[1]LI D，CHEN L，WANG H,et al．Clinical application of a rapid cervical cancer screening method:folate receptor-mediated staining of cervical neoplastic epithelia[J]．Asia Pac J Clin Oncol，2017，13(1)： 44-52.

[2]TSIKOURAS P，ZERVOUDIS S，MANAV B，et al．Cervical cancer:screening,diagnosis and staging[J]．J BUON，2016，21(2)：320-325．

[3]WRIGHT T C，MASSAD L S，DUNTON C J，et al．2006 consensus guidelines for the managemerit of women with cervical intraepithelial neoplasia or adenocarcinoma in situ[J]．J Low Genit Tract Dis，2007，11(4)：223-239.

[4]BOURGNIGNON L Y，WONG G，EARLE C，et al．Hyaluronan-CD44 interaction promotes microRNA signaling and Rho GTPase activation leading to tumor progression[J]．Small GTPasea，2012，3(1)：53-59．

[5]SHERIDAN C，KISHIMOTO V，F(xiàn)UCHS R K，et al．CD44+/CD24-breast cancer cells exhibit enhanced invasive pmperties,an early step necessary for metastasis[J]．Breast Cancer Res，2006，8(5)：R59.

[6]SLVEN M，KNLPINSKI J，GAFFNEY J，et al．Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease:Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways[J]．Matrix Biol，2006，26(1)：58-68.

[7]劉暉，周赟峰，曾四元，等．黏附分子CD44v6,ICAM-1與早期宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2017，46(22)：605-608．

[8]馮凡，曹衛(wèi)平，陳琦，等．CD44剪接變異體(CD44v)在腫瘤中的研究進(jìn)展[J]．生物學(xué)雜志，2017，34(1)：75-79．

[9]MARTINOU J C，YOULE R J．Mitochondria in apoptosis:Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics[J]．Dev Cell，2011，21(1)：92-101.

[10]薛清華．Rsf-1、MMP-9、TTF-1在肺癌及肺部良性病變中的檢驗(yàn)結(jié)果分析[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2017，14(6)：885-887．

[11]彭海員，馬杰，朱慧芳，等．MMP -9與肺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系[J]．臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，15(4)：322-325．

[12]YILMAZ M，VURAL E，KOC K，et al．Cavenous sinus invasion and effect of immunohistochemical features on remission ingrowth hormone secreting pituitary adenomas[J]．Turk Neurosurgery，2015，25(3)：380-388.

[13]何璐，郭亮，胡春洪，等．垂體腺瘤MRI Knosp分級(jí)與Ki-67、p53、MMP-9的相關(guān)性分析[J]．中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2016，15(5)：410-413．

[14]殷新明，劉月琴，溫堅(jiān)，等．變異型分化抗原簇44(17)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞,Sila細(xì)胞系增殖的影響[J]．中國(guó)婦幼保健，2015，30(20)：3486-3490．