周 珊，劉彥婷，趙飛鵬，馮華君，涂曉敏，楊金亮，梁傳余，覃 綱△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川瀘州 646000；2.四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室，成都 610041；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，成都 610041)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種頭頸部常見的惡性腫瘤，多起源于鼻咽黏膜的上皮，在西方國家發(fā)病率極低(0.5/100 000)，但高發(fā)于我國南方(30/100 000)[1]。經(jīng)以放療為主的綜合治療，早期NPC患者5年生存率可達(dá)90%，而晚期NPC患者的5年生存率僅維持在70%左右，甚至更低[2]。因此，研究NPC的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點具有重要的臨床意義。免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)是一類重要的免疫球蛋白分子，經(jīng)典的免疫學(xué)理論認(rèn)為僅由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。近年的研究發(fā)現(xiàn)，上皮來源的組織和細(xì)胞系也可以表達(dá)Ig，如IgA、IgG和IgM[3-4]。研究證實，IgM在多種人上皮來源的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可能參與腫瘤免疫反應(yīng)[5]，在肝癌、前列腺癌和卵巢癌的篩選和診斷方面具有生物標(biāo)志物的潛力[6-8]。然而，IgM在NPC中的表達(dá)和功能尚不明確。本研究旨在探討抗人IgM抗體對NPC HNE-1細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，并構(gòu)建裸鼠移植瘤模型進(jìn)行驗證，為NPC的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人鼻咽癌HNE-1細(xì)胞系由四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗室提供；RPMI-1640和胎牛血清(FBS)購自美國Thermo公司；羊抗人IgM抗體、羊抗IgG純化免疫球蛋白和碘化丙啶(PI)均購自美國Sigma公司；3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)實驗試劑盒和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測試劑盒均購自美國Promega公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購自南京吉凱科技有限公司；兔抗人gp96多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗人IgM多克隆抗體、生物素化羊抗IgG抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫組織化學(xué)SP試劑盒購自美國Santa Cruz公司；BALB/c-nu裸鼠(雌性)購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HNE-1細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的飽和濕度孵箱中采用含10% FBS+1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞增殖檢測 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。濃度梯度檢測：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×103個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，分3組加藥：實驗組(100 μL含不同濃度羊抗人IgM抗體+含2.5% FBS的RMPI-1640)、IgG/磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組(100 μL含相同濃度羊抗IgG或PBS+含2.5% FBS的RMPI-1640)、空白對照組(100 μL 含2.5% FBS的RMPI-1640)，羊抗人IgM抗體、羊抗IgG和PBS設(shè)置的濃度梯度均為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL，設(shè)置校正孔，未接種細(xì)胞，加入100 μL含2.5% FBS的RMPI-1640校正吸光度值(A值)，培養(yǎng)3 d后，加入20 μL MTS，酶標(biāo)儀測490 nm處A值(A490值)。時間梯度檢測：種板、分組同前，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，分3組加藥，每隔24 h加入20 μL MTS，酶標(biāo)儀測A490值，連續(xù)測6 d。空白對照組調(diào)零，每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次；細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-處理組A490/空白對照組A490)×100%。

1.2.3細(xì)胞凋亡檢測 流式細(xì)胞儀檢測：將細(xì)胞以2×105個/孔接種于6孔板中，含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)24 h，棄上清液；分3組，對應(yīng)分別加1 mL含已調(diào)整濃度為200 μg/mL的羊抗人IgM抗體、羊抗IgG或含有相同體積的PBS的2.5% FBS的RMPI-1640，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；收集每孔細(xì)胞制成含(1～5)×106個細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，離心，70%乙醇固定，加1 mL PI染液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/毫升，上機(jī)檢測及鋪片拍照；細(xì)胞凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞總數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。TUNEL試劑盒檢測：按試劑盒說明書進(jìn)行，將細(xì)胞以2×103個/孔接種于96孔板中培養(yǎng)；陰性對照組以1 μL雙蒸水代替rTdT酶，陽性對照組以DnaseⅠ預(yù)處理細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察拍照，將細(xì)胞核呈強(qiáng)藍(lán)色熒光的細(xì)胞作為陽性細(xì)胞；細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)=(一個視野的凋亡細(xì)胞數(shù)/通過視野的細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.4細(xì)胞周期檢測 按照周期試劑盒說明書處理細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/毫升，流式細(xì)胞儀檢測紅色熒光，用Multicycle軟件分析。

1.2.5體內(nèi)移植瘤實驗 將1×106個HNE-1細(xì)胞皮下接種于雌性BALB/c-nu裸鼠(4～5周齡)的右背腹側(cè)；建模成功后，隨機(jī)分成實驗組、IgG對照組和PBS對照組，分別于腹腔注射等量的羊抗人IgM抗體、羊抗IgG及PBS，每3天注射1次，每只裸鼠1.5 mg，共5次；每4天測腫瘤體積；在第5次給藥完成后1周處死裸鼠，剝離移植瘤，稱重。瘤體體積=(D×d2)/2，D為最長徑，d為最短徑。動物實驗得到西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為201605045。

A：培養(yǎng)72 h后，3組細(xì)胞在不同濃度下的A490值曲線；B：培養(yǎng)72 h后，3組細(xì)胞在不同濃度下的增殖抑制率曲線；C：3組細(xì)胞在不同時間下的A490值曲線；D：3組細(xì)胞在不同時間下的增殖抑制率曲線；*：P<0.05，與PBS對照組、IgG對照組比較

圖1抗人IgM抗體抑制HNE-1細(xì)胞增殖

A：3組細(xì)胞PI染色后的凋亡形態(tài)觀察(×200)；B：流式細(xì)胞術(shù)測3組細(xì)胞凋亡的柱形圖；C：3組細(xì)胞TUNEL染色后的凋亡形態(tài)觀察(×200)；D：TUNEL染色后3組細(xì)胞凋亡的柱形圖；*：P<0.05，#：P<0.01，與實驗組比較

圖2抗人IgM抗體誘導(dǎo)HNE-1細(xì)胞凋亡

1.2.6免疫組織化學(xué)檢測 將石蠟包埋的移植瘤組織4 μm切片，按免疫組織化學(xué)SP試劑盒說明書進(jìn)行；雙盲法觀察每張切片的陽性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)呈黃棕色為陽性表達(dá)；每張切片選5個視野，顯微鏡(×400倍)下拍照，Image Pro-Plus 6.0圖像分析軟件檢測平均光密度(MOD)值。

2 結(jié) 果

2.1抗人IgM抗體對HNE-1細(xì)胞增殖的影響 與IgG和PBS對照組比較，不同濃度抗人IgM抗體培養(yǎng)HNE-1細(xì)胞72 h后，隨濃度的增加A490值減小，增殖抑制率增加，從濃度為50 μg/mL開始，A490值和增殖抑制率出現(xiàn)明顯差異，見圖1A、B。含100 μg/mL濃度的抗人IgM抗體培養(yǎng)HNE-1細(xì)胞6 d，結(jié)果顯示：A490值和增殖抑制率隨時間的增加而增加；與IgG和PBS對照組比較，實驗組從第3天出現(xiàn)明顯抑制，見圖1C、D。

2.2抗人IgM抗體對HNE-1細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：濃度為200 μg/mL的抗人IgM抗體作用于實驗組HNE-1細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后顯示，實驗組的凋亡率[(31.10±2.81)%]明顯高于IgG對照組[(6.56±1.14)%]和PBS對照組[(7.79±1.21)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=161.667 3，P<0.05)，見圖2B；并且用PI染色也可觀察到類似結(jié)果，見圖2A。TUNEL檢測結(jié)果：HNE-1細(xì)胞經(jīng)含抗人IgM抗體培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞凋亡明顯，呈較強(qiáng)的綠色熒光，見圖2C；實驗組凋亡指數(shù)[(26.19±2.17)%]明顯高于IgG對照組[(4.18±0.27)%]和PBS對照組[(3.38±0.77)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=281.098 9，P<0.01)，見圖2D。

2.3抗人IgM抗體對HNE-1細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，與IgG對照組和PBS對照組比較，實驗組HNE-1細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比減少、S期細(xì)胞百分比增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

*：P<0.05，與實驗組比較

圖3流式細(xì)胞儀檢測HNE-1細(xì)胞周期分布

2.4抗人IgM抗體對移植瘤的影響 裸鼠皮下接種HNE-1細(xì)胞，成功構(gòu)建移植瘤模型，分3組(每組5只)，3組裸鼠在實驗期間均無死亡。實驗結(jié)果顯示：腹腔注射藥物結(jié)束后1周，實驗組的平均瘤體體積[(26.73±16.51)mm3]明顯低于IgG對照組[(204.97±151.88)mm3]和PBS對照組[(230.16±167.78)mm3]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；實驗組的瘤體平均質(zhì)量[(0.09±0.07)g]明顯低于IgG對照組[(0.35±0.10)g]和PBS對照組[(0.38±0.08)g]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。相對于IgG對照組和PBS對照組，實驗組的瘤體質(zhì)量抑瘤率分別為74.29%和76.32%。

A：瘤體體積；B：瘤體質(zhì)量；*：P<0.05，與PBS對照組、IgG對照組比較

圖4裸鼠移植生長情況

2.5移植瘤中IgM與糖蛋白96(gp96)的表達(dá) 將HNE-1移植瘤組織切片行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示：IgM蛋白和gp96蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色，見圖5；實驗組的IgMMOD值(0.01±0.01)明顯低于IgG對照組(0.06±0.03)和PBS對照組(0.05±0.03)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同樣，實驗組的gp96MOD值(0.05±0.01)明顯低于IgG組(0.10±0.03)和PBS對照組(0.11±0.02)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 免疫組織化學(xué)檢測瘤體中IgM和gp96蛋白的表達(dá)(×400)

3 討 論

目前，上皮來源的惡性腫瘤組織和細(xì)胞中Ig的生物學(xué)活性和潛在機(jī)制已成為腫瘤研究的熱點之一。如ZHENG等[3]研究發(fā)現(xiàn)，人上皮腫瘤細(xì)胞衍生的IgA輕鏈可以誘導(dǎo)S期增加，促進(jìn)細(xì)胞生長。尿道上皮腫瘤中IgG的高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡；抗IgG抗體可誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，IgG也可抑制胰腺癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤生長[9]。QIU等[10]證實了腫瘤細(xì)胞分泌的IgG是細(xì)胞生存和生長所必需的，利用特異性羊抗IgG抗體可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、抑制裸鼠移植瘤的生長，提出腫瘤來源的IgG能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。最近，觀察到含特異性CDR3片段的反義重組載體能夠抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中Ig表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，成功地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，認(rèn)為腫瘤來源的Ig能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖及生長，即腫瘤細(xì)胞衍生的Ig具有生長因子樣活性[11]。

同樣，本實驗結(jié)果也揭示了抗人IgM抗體可能具有抑制HNE-1細(xì)胞增殖和生長的作用，并且抗人IgM抗體能有效地誘導(dǎo)HNE-1細(xì)胞凋亡。ZHENG等[3]發(fā)現(xiàn)抗人Igα單克隆抗體封閉腫瘤細(xì)胞Ig的功能，抑制CNE-1和Hela細(xì)胞的生長活性，隨后進(jìn)一步證實Igα能夠增加其惡性增殖能力，而且發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的Igα可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入S期。本研究結(jié)果顯示，抗人IgM抗體改變HNE-1細(xì)胞周期分布，阻滯于S期，G1期減少，與ZHENG等[3]結(jié)果一致。

gp96屬于熱休克蛋白90(HSP90)家族中的一個成員，能夠參與腫瘤抗原的合成、裝配及抗原提呈，與腫瘤特異性抗原肽結(jié)合形成gp96-肽復(fù)合物，激活抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)[12]。gp96在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可能是惡性腫瘤診斷和免疫的靶點。研究表明，在喉癌組織高表達(dá)的gp96與喉癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)[13]。QIAN等[14]發(fā)現(xiàn)提取不同骨髓瘤細(xì)胞系分泌的gp96混合成疫苗，可抑制小鼠骨髓瘤的侵襲。以上研究證明gp96在腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要的作用。有研究報道，肺癌組織中g(shù)p96和IgG高表達(dá)，可能二者共同參與腫瘤的免疫防御和逃逸[15]。在本實驗中構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)抗人IgM抗體可抑制移植瘤的生長，免疫組織化學(xué)檢測瘤體組織中IgM和gp96表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)實驗組中IgM和gp96表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)，提示抗人IgM抗體能抑制移植瘤的生長可能與抑制IgM和gp96蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，抗人IgM抗體能抑制HNE-1細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于S期，減少細(xì)胞的G1期，并可能通過抑制IgM和gp96蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制裸鼠移植瘤的生長。本研究結(jié)果可能為抗NPC研究提供新的思路。

[1]LEE A W，MA B B，NG W T，et al．Management of nasopharyngeal carcinoma:current practice and future perspective[J]．J Clin Oncol，2015，33(29)：3356-3364.

[2]BENSOUDA Y，KAIKANI W，AHBEDDOU N，et al．Treatment for metastatic nasopharyngeal carcinoma[J]．Eur Ann Otorhinolaryngol Head Neck Dis，2011，128(2)：79-85．

[3]ZHENG H，LI M，LIU H，et al．Immunoglobulin alpha heavy chain derived from human epithelial cancer cells promotes the access of S phase and growth of cancer cells[J]．Cell Biol Int，2007，31(1)：82-87．

[4]LIANG P Y，LI H Y，ZHOU Z Y，et al．Overexpression of immunoglobulin G prompts cell proliferation and inhibits cell apoptosis in human urothelial carcinoma[J]．Tumour Biol，2013，34(3)：1783-1791．

[5]HU F，ZHANG L，ZHENG J，et al．Spontaneous production of immunoglobulin M in human epithelial cancer cells[J]．PLoS One，2012，7(12)：e51423．

[6]MOSSAD N A，MAHMOUD E H，OSMAN E A，et al．Evaluation of squamous cell carcinoma antigen-immunoglobulin M complex (SCCA-IGM) and alpha-L-fucosidase (AFU) as novel diagnostic biomarkers for hepatocellular carcinoma[J]．Tumour Biol，2014，35(11)：11559-11564．

[7]GALLOTTA A，ZIGLIOLI F，F(xiàn)ERRETTI S A，et al．A novel algorithm for the prediction of prostate cancer in clinically suspected patients[J]．Cancer Biomark，2013，13(4)：227-234．

[8]BANDIERA E，ZANOTTI L，F(xiàn)ABRICIO A S，et al．Cancer antigen 125,human epididymis 4,kallikrein 6,osteopontin and soluble mesothelin-related peptide immunocomplexed with immunoglobulin M in epithelial ovarian cancer diagnosis[J]．Clin Chem Lab Med，2013，51(9)：1815-1824．

[9]WAN X，LEI Y，LI Z，et al．Pancreatic expression of immunoglobulin G in human pancreatic cancer and associated diabetes[J]．Pancreas，2015，44(8)：1304-1313．

[10]QIU X Y，ZHU X H，ZHANG L，et al．Human epithelial cancers secrete immunoglobulin G with unidentified specificity to promote growth and survival of tumor cells[J]．Cancer Res，2003，63(19)：6488-6495．

[11]鄧郁青，鄭杰，李國輝，等．免疫球蛋白在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)活性探討[J]．中華腫瘤雜志，2006，28(2)：88-91．

[12]WANG X，WANG Q，LIN H．Correlation between clinicopathology and expression of heat shock protein 72 and glycoprotein 96 in human esophageal squamous cell carcinoma[J]．Clin Dev Immunol，2010(2010)：212537．

[13]陳才偉，賈曉娟，孟頌東，等．Gp96蛋白的免疫學(xué)及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．生物工程學(xué)報，2011，27(5)：704-711．

[14]QIAN J，HONG S，WANG S，et al．Myeloma cell line-derived,pooled heat shock proteins as a universal vaccine for immunotherapy of multiple myeloma[J]．Blood，2009，114(18)：3880-3889．

[15]王慧賢，劉彥仿，楊守京，等．熱休克蛋白70,葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94和IgG在人肺癌組織中的表達(dá)[J]．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2008，24(5)：447-449．