鄭玉榮， 靳軍寶,2， 白光祖， 吳新年*， 劉秋艷,2

（1. 中國科學院蘭州文獻情報中心，甘肅 蘭州 730000；2. 中國科學院大學，北京 100049）

纖維素降解研發(fā)及產業(yè)化是全球熱點方向之一，全球范圍內天然纖維素原料非常豐富（包括農作物秸稈、林業(yè)副產品、城市垃圾等），將纖維素進行轉化生產生物燃料、飼料、食品等生物質產品對于解決環(huán)境污染、資源浪費、食品短缺、能源危機等方面具有現實意義[1-2]。全球纖維素利用主要通過糖平臺（生物法）和熱化學平臺轉化[3-4]，糖平臺先將纖維素原料轉化為可發(fā)酵型糖，再利用酵母發(fā)酵轉化為生物產品，熱化學平臺則先氣化纖維素原料再轉化為生物產品。

圖1 天然纖維素利用流程

纖維素的生物轉化利用分為原料預處理、酶水解、糖發(fā)酵3個階段（如圖1所示），目前主要的技術瓶頸在于預處理技術不夠成熟、纖維素酶活性較低及轉化效率不高等，造成生產成本過高[5]。預處理階段應用較多的是物理化學法（包括蒸汽爆破、氨纖維爆破等）、化學法（酸處理、堿處理、離子液體處理等）、物理法等[6]，在效率相對較高的同時帶來新的環(huán)境污染與能源消耗問題，后續(xù)處理也存在其他方面的問題（如抑制問題）。生物法克服了其他方法的缺點，但存在效率有待提高和成本過高的問題（時間成本和經濟成本），但是從長遠看，通過生物技術和生物工程解決效率和成本問題[7-8]，生物法將得到快速發(fā)展[9-10]。

全球圍繞生物法的效率問題和成本問題進行了大量的基礎研究，經由相關研究機構和企業(yè)合作，建設纖維素產業(yè)化利用示范裝置，推進纖維素的生物轉化進程。我國《可再生能源發(fā)展十三五規(guī)劃》新增投資2.5萬億元發(fā)展包括生物質利用在內的可再生能源，美國和歐盟也以立法形式規(guī)定了將來某時間段纖維素燃料在整個燃料體系中的比例，并且以政策形式進行支持。

本文收集了國內外纖維素降解生物法預處理方面的發(fā)明專利（數據來源：Derwent Innovations Index），應用Thomson Data Analyzer、INNOGRAPHY等主流情報分析軟件，對全球范圍內纖維素降解生物法預處理總體研發(fā)情況、技術研發(fā)脈絡、重點技術方向及核心技術發(fā)展態(tài)勢進行了分析。

1 專利總體研發(fā)進展

1.1 總體研發(fā)態(tài)勢

截止2017年底（檢索日為2017年12月31日），全球纖維素降解生物法預處理專利數為572條，占到整個預處理技術的6.93%（總預處理專利技術8256條），總體上不占優(yōu)勢，處于發(fā)展期（圖1），其中2015年達到74條，為歷年最高（注：因專利數據滯后，2016、2017年的專利數據不全）。

圖2 纖維素降解生物法預處理專利技術年際變化

圖3 纖維素降解生物法預處理專利技術主要研發(fā)國家

如圖2所示，美國是纖維素降解生物法預處理專利主要的研發(fā)國，另外中國、歐洲、日本也是重要的研發(fā)地區(qū)。如表 1，諾維信是纖維素降解生物法預處理專利技術最主要的專利權人（109條，占整個生物法預處理技術的19.06%，下同），其他還包括荷蘭帝斯曼（38條，占6.64%）、加拿大IOGEN（29條，占5.07%）、杜邦丹尼斯克、法國石油與新能源研究院等（如表1所示）。

表1 纖維素降解生物法預處理主要研發(fā)機構

（續(xù)表1）

1.2 主要研發(fā)方向

纖維素降解生物法預處理專利技術主要涉及發(fā)酵技術與工藝（包括產品，占78.40%）、酶工程技術（占43.39%）、菌種選育技術（占38.91%）三個技術方向，其中能產生高效降解酶的菌種選育技術是生物法預處理的關鍵。

如表2，經分析相關專利技術研發(fā)脈絡，上世紀80年代開始，纖維素降解生物法預處理專利技術經歷了酶的分離與培養(yǎng)、微觀層面研發(fā)（包括纖維素細胞壁結構、DNA序列等）、破除木質素結合鍵、減少酶用量及提高發(fā)酵率、同步糖化發(fā)酵、產業(yè)化的經濟性及可行性、基因改造與表達、多階段聯合處理、耐高溫多功能降解菌種等（如表2所示）。

表2 纖維素降解生物法預處理技術演進

誘變選育技術的主要研發(fā)機構包括諾維信、加拿大IOGEN、杜邦丹尼斯克等，技術重點是選育的菌株分泌高效組合酶對木質素進行降解，組合酶的重要特征一是表現出顯著協同作用，二可以全流程作用起作用，減少后期糖化和發(fā)酵階段的外源酶加入量。具體技術點包括極端環(huán)境菌種（寬pH范圍、高熱、低溫等）篩選技術、菌株高通量篩選技術（包括微流控真菌高通量篩選技術、流式細胞儀細菌高通量篩選技術等）、五碳糖六碳糖共利用菌株選育技術、高效物理化學組合誘變技術、高效菌定向選育技術、應用于固態(tài)發(fā)酵菌種選育技術、高效物理（紫外、重離子、等離子輻射等）誘變技術、高耐熱工程菌模擬預測技術、流程化選育平臺、多菌協同培育技術等。

基因工程選育技術是通過遺傳工程對降解木質素（半纖維素）起作用的基因片段進行基因改造，從而提高降解效率。研發(fā)主要集中在兩個方向上，一是對新基因（核酸序列）的篩選、鑒定、分離，二是通過遺傳工程改造基因并進行菌株表達。具體的技術點包括蛋白組學技術、多基因融合技術、菌種突變技術、定向進化集成技術、基因定向突變技術、高效降解菌基因（組）鑒定技術、同源重組增強技術、不需預處理生物降解菌改造技術、活性位點識別技術、高效纖維素菌株基因組（群）融合技術等。

近年來，國內針對纖維素降解生物法預處理在酶種選培育、基因工程改造、成本控制等方面開展了大量的研究，中國石化通過選育木霉屬菌株去除預處理階段引入的多種抑制物[11]、華中科技大學張曉昱團隊通過擔子菌對木質纖維素原料進行預處理、降解與轉化[12]，山東尤特爾采用中性纖維素酶預處理木質纖維素以降低成本[13]，另外青島蔚藍、南京百斯杰、寧夏夏盛、華東師范大學等也有針對性的開展了相關研發(fā)活動。

1.3 后續(xù)研發(fā)重點

引用專利數據集的文獻，稱為該專利數據集的后引文獻，通過后引文獻可以分析該數據集專利技術對后續(xù)專利技術研發(fā)、應用等方面的作用與影響，尤其核心專利技術對后續(xù)研發(fā)的影響具有重要作用，很多后續(xù)研發(fā)的專利技術會圍繞核心專利進行專利布局，其結果會影響產業(yè)布局和經濟利益。

分析相關后續(xù)研發(fā)機構分布，除了諾維信、杜邦丹尼斯克、荷蘭帝斯曼、加拿大IOGEN、私有酶技術公司等研發(fā)主力外，英國石油公司、殼牌石油公司、美國可再生能源國家實驗室、阿本戈生物能源等一些石油和能源公司也對相關技術進行大量引用。

分析后引專利的技術方向可以發(fā)現，后引主要以應用為主，涉及到制備目標產品、所使用的酶、所使用的材料、發(fā)酵的工藝等，其中在堆制有機肥料、肥料與土壤調理劑的混合物、有機廢料回收或加工、動物飼料、添加酶或微生物進行谷物材料發(fā)酵等技術是以后熱點的研發(fā)方向，一定程度上說明降解研發(fā)方向和降解產品趨向多元化。

1.4 研發(fā)基礎分析

科學技術能持續(xù)不斷的向前推進，是因為建立在之前的基礎研究之上。專利數據集所參考的文獻，稱為該專利數據集的前引文獻，是專利技術繼續(xù)研發(fā)的基礎。研究前引文獻可以分析該數據集專利技術所賴以產生的基礎科學研究發(fā)展態(tài)勢，通過研究主題的重點、發(fā)展與變化、對核心技術發(fā)展脈絡等進行分析，可以遴選出具有發(fā)展前景的核心技術方向及其演化路徑。

如表3所示，纖維素生物法預處理技術所參考的科學文獻大約有4 400多篇（主要為期刊論文、會議、報告、圖書等，不包括專利引用），通過被引次數指數曲線和加權指數曲線共篩選出核心參考論文293篇，大約占到整個參考論文總數的 6.6%左右。核心參考論文產出國以美國為主，占了總參考論文的 36%，另外丹麥、瑞典、日本、加拿大、芬蘭也有一定量的核心論文產出。核心參考文獻的研究方向主要集中在嗜熱細菌、高固態(tài)原料直接發(fā)酵、銅離子依賴糖苷酶GH61家族、相關的原理與降解模型等。

表3 部分被專利參考的代表性核心論文

（續(xù)表3）

2 核心專利技術

在專利數據中，針對具體的技術領域會形成一個專利群，專利群中每件專利根據其價值和作用分為核心專利、重要專利和一般專利，其中核心專利處于專利群的核心位置和節(jié)點地位，對整個專利研發(fā)的走向起重要作用，并最終影響產業(yè)的發(fā)展[14]。

本文通過INNOGRAPHY的專利強度特征指標和被引用指標選擇出纖維素生物法預處理技術的核心專利數據，結果表明，核心專利主要集中在美國、歐洲專利局、世界專利組織等，其中美國無論在核心專利優(yōu)先權，還是同族專利數量方面都高于其他國家和地區(qū)。主要研發(fā)企業(yè)包括諾維信、加拿大IOGEN、荷蘭帝斯曼、DYADIC國際等，上述四家企業(yè)的核心專利占全部核心專利量的80%。

纖維素生物降解核心專利涉及到高效菌株選育技術、組合酶及其構建方法、酶性能增強、遺傳工程及其載體表達、聯合協同處理技術等方面。組合酶及其構建方面，DYADIC國際通過酶促水解纖維素構建高效纖維素酶組合物[15]，能高效地將生物質木質纖維素（涉及到常見的各種木質纖維素材料，包括自然界植物、農作物木質纖維素、工業(yè)廢棄物等）轉化為葡萄糖。諾維信[16]研發(fā)的酶組合物包括煙曲霉纖維二糖水解酶Ⅰ、煙曲霉纖維 二糖水解酶Ⅱ、煙曲霉 β-葡糖苷酶或其變體、具有纖維素分解增強活性的青霉屬種GH61多肽等。

高效菌株選育技術方面，MASCOMA[17]培育菌株既可以產生水解纖維素、半纖維素、木質素與碳水化合物之間連接的酶，也可以直接通過高固態(tài)直接生產乙醇等產品，并且減少在同時糖化和發(fā)酵（SSF）過程中水解生物質原料所需加入的外源酶量。DSM I P[18]的Talaromyces突變菌株能高效分解木質纖維素材料生產生物產品，分泌 CBHⅠ、CBHⅡ、EG/CEA、EG/CEB、木聚糖酶、乙?；揪厶酋ッ?、膨脹因子樣蛋白、EG/GH61等酶。

遺傳工程及其載體表達方面，Novozymes Inc[19]通過研發(fā)具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸，如棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶活性多肽[20]，構建載體和宿主細胞。

酶性能增強方面，諾維信研發(fā)了增強纖維素材料降解或轉化的方法，在具有纖維素分解增強活性多肽的存在下用酶組合物處理纖維素材料，組合酶包括半纖維素酶、棒曲霉素、酯酶、木質素分解酶、果膠酶、過氧化物酶、蛋白酶、膨脹素等[21]；也研發(fā)了通過非催化性碳水化合物結合組件（CBM）增強糖基水解酶家族61（GH61）的相關技術[20]；另外諾維信研發(fā)了通過酶活性增強酶組合物在高溫條件（54℃～70℃）下分解纖維素材料[22]。

3 結語

纖維素降解生物法預處理總體上還處于發(fā)展期，研發(fā)力度有限，與其他物理化學法、化學法等預處理方法相比生產成本還處于較高水平，酶解效率也有待提高。目前全球研發(fā)重點有兩個，一是選育分泌高效降解組合酶的菌株，二是通過遺傳工程對降解木質纖維素起作用的基因片段進行基因改造，從而提高降解效率。

美國纖維素降解生物法預處理專利技術研發(fā)特征是以企業(yè)為主，研究型機構在基礎研究上進行配合的局面，有相應的政策規(guī)劃和產業(yè)化示范。中國纖維素降解生物法預處理研發(fā)以研究型機構為主，產業(yè)化示范有限，研發(fā)基礎也相對薄弱。

纖維素生物降解產業(yè)化涉及諸多因素，除了技術層面的問題，還與諸如因素包括原料（如穩(wěn)定的原料價格）、物流交通狀況、生物產品高價值化、生物產品多樣化、以及其他相關配套產業(yè)的發(fā)展等有較大關聯，發(fā)展纖維素生物降解產業(yè)任重而道遠。

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