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        野生胡麻愈傷組織誘導(dǎo)及其對NaCl脅迫的生理響應(yīng)

        2018-07-05 14:40:30風(fēng),趙
        甘肅農(nóng)業(yè)科技 2018年6期

        劉 風(fēng),趙 瑋

        (1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,甘肅 蘭州 730070)

        胡麻(油用亞麻)屬于亞麻科(Lianceace)亞麻屬(Linum)[1],主要分布在甘肅、內(nèi)蒙、寧夏、山西、河北等省區(qū)[2]。胡麻油富含α-亞麻酸及各種人體必需的不飽和脂肪酸,具有促進智力發(fā)育、強身健腦、降血脂、預(yù)防血栓等作用,是我國工業(yè)用干性植物油和產(chǎn)區(qū)群眾主要的食用油來源[3-4]。此外,胡麻籽中木酚素質(zhì)量分數(shù)很高,這種物質(zhì)被人體吸收后,可以抑制癌癥,特別是能降低乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌的發(fā)病率。胡麻籽中還富含可溶性植物纖維素,具有降低膽固醇的作用,經(jīng)常食用胡麻籽,可以降低便秘、肥胖、心臟病等發(fā)病率[5]。

        野生胡麻主要生長在海拔1 500~2 000 m的高寒山區(qū),為多年生草本植物,果小粒小易落粒,具有抗旱、抗寒、耐瘠薄、分莖多、生育期短的特性,是良好的抗逆性種質(zhì)資源。野生胡麻種子休眠性強,用常規(guī)方法很難繁殖成功,進行種質(zhì)資源保存頗有難度,不便于育種和遺傳利用研究。近年來,有關(guān)野生胡麻組織培養(yǎng)技術(shù)研究的報道不多,前期的研究多集中在培養(yǎng)基激素配比、外植體取材對栽培胡麻愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)以及再生植株分化的影響等方面。趙瑋等[6]研究優(yōu)化的栽培胡麻組織培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基配方為MS+NAA(0.5 mg/L)+6-BA(1.5 mg/L), 最適宜的外植體為下胚軸;頡瑞霞等[7]發(fā)現(xiàn)KT+2,4-D激素組合對胡麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)效果優(yōu)于KT+NAA;孫上峰等[8]通過對胡麻花藥的各種預(yù)處理的研究,發(fā)現(xiàn)不同基因型在同一處理內(nèi)有不同的出愈率,同一基因型在不同預(yù)處理條件下有不同的出愈率;姬妍茹等[9]對野生亞麻的莖段進行無性擴繁獲得成功,初步確定MS(附加6-BA 0.5 mg/L,NAA 0.05 mg/L)為莖段分化的適宜培養(yǎng)基,1/2MS(附加一定量的激素)培養(yǎng)基為不定芽保存培養(yǎng)基。

        了解植物的耐鹽機理,研究鹽脅迫條件下植物的生理生化變化,對發(fā)展鹽堿地農(nóng)業(yè),緩解糧食壓力具有重要的實踐意義[10]。目前抗鹽生理在胡麻領(lǐng)域相關(guān)研究很少。趙瑋等[11]分析了不同濃度的NaCl脅迫下不同抗旱性胡麻品種苗期和成株期農(nóng)藝性狀以及SOD、POD、MDA質(zhì)量分數(shù),結(jié)果表明,抗旱性強的胡麻品種同樣具有更強的耐鹽特性。本研究通過篩選最佳野生胡麻愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基,繼而將愈傷進行不同濃度NaCl脅迫,分析愈傷增殖率及其生理特性,從而篩選出優(yōu)質(zhì)野生胡麻資源,為抗逆胡麻優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 供試材料

        供試野生胡麻種質(zhì)資源共8個,分別為烏蘭察布藍花、烏蘭察布紅花、張家口藍花、定西藍花、蘭州藍花、平?jīng)鏊{花、臨洮藍花、會寧藍花,均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所品種資源研究室提供。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 培養(yǎng)基配制 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:在MS培養(yǎng)基上分別添加NAA質(zhì)量體積分數(shù)為0、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L,6-BA質(zhì)量體積分數(shù)為0、0.5、 1.0、 1.5、 2.0 mg/L, 編號為 LM1~LM25(表1)。NaCl脅迫愈傷組織培養(yǎng)基:用篩選出的最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ),分別添加NaCl溶液0(CK)、50、100、 150、 200、 250 mmol/L 各 50 mL 于250 mL三角瓶中進行懸浮培養(yǎng)。

        1.2.2 材料處理與指標測定 愈傷誘導(dǎo):將野生胡麻種子分別用70%的酒精表面殺菌30 s,再用0.1%的HgCl2消毒5~6 min,用無菌蒸餾水沖洗4次,然后接種于含有40 mL的MS培養(yǎng)基三角瓶中。每瓶20粒,待其萌發(fā)5 cm后剪切下胚軸1 cm作為外植體,分別接種于裝有不同激素配比濃度培養(yǎng)基的三角瓶中,每瓶接種5個外植體,每組10瓶,3次重復(fù)。觀察并記錄不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)影響。

        NaCl脅迫愈傷組織:篩選出野生胡麻愈傷組織塊,分別接種于裝有不同NaCl脅迫濃度培養(yǎng)基的三角瓶中,每瓶接種5塊愈傷,每組10瓶,3次重復(fù)。記錄初始重量和愈傷組織狀態(tài),培養(yǎng)40 d后觀察并記錄不同濃度NaCl脅迫對愈傷組織增殖的影響。

        生理指標測定:通過不同濃度NaCl脅迫,篩選耐鹽型和敏感型野生資源愈傷組織,分別進行SOD、CAT、POD、MDA等生理指標測定,分析野生胡麻愈傷組織對NaCl脅迫的生理響應(yīng)。

        1.2.3 培養(yǎng)條件 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)為黑暗培養(yǎng)、溫度(23±2)℃。待胚狀體長出、進入分化階段時進行光照培養(yǎng),光照強度1 500~2 000 Lx,光照時間16 h/d,溫度(23±2)℃。愈傷鹽脅迫為液態(tài)懸浮培養(yǎng)[12]:于120 r/min的恒溫旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng),溫度27~28 ℃,全程暗培養(yǎng)7 d后用新鮮液體培養(yǎng)基更換瓶中2/3的培養(yǎng)液,持續(xù)培養(yǎng)40 d[13]。

        表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

        1.3 測定指標及計算方法

        愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果通過愈傷誘導(dǎo)率和愈傷組織增殖率體現(xiàn),計算公式如下。

        愈傷誘導(dǎo)率(%)=(產(chǎn)生愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;

        愈傷組織增殖率(%)=[(培養(yǎng)后愈傷總重-培養(yǎng)前愈傷總重)/培養(yǎng)前愈傷]×100%;

        相對鹽害率=[(對照愈傷增殖率-處理愈傷增殖率)/對照愈傷增殖率]×100%。

        SOD酶活力指數(shù)=(SOD抑制率/2)×(反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)/測定樣本蛋白濃度)

        CAT活力指數(shù)=[(對照OD值-測定OD值)×271]/60×取樣量/待測樣本蛋白濃度

        POD活力指數(shù)=[(測定OD值-對照OD值)/(12×比色光徑)]×反應(yīng)液總體積/取樣量/反應(yīng)時間/勻漿蛋白濃度×1 000

        MDA含量=(MDA濃度×提取液體積)/植物組織鮮重

        2 結(jié)果與分析

        2.1 野生胡麻愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

        在MS培養(yǎng)基上添加不同激素配比的結(jié)果(表2)顯示,不同野生胡麻種質(zhì)愈傷組織的誘導(dǎo)率差別較大。LM19號培養(yǎng)基MS+NAA(0.15 mg/L)+6-BA(1.5 mg/L)對所有供試野生種質(zhì)平均愈傷誘導(dǎo)率在所有處理中最高,達到39.77%。其中烏蘭察布藍花愈傷誘導(dǎo)率最高,為90.00%;烏蘭察布紅花愈傷誘導(dǎo)率最低,只有13.50%。不同野生胡麻在LM19號培養(yǎng)基上的愈傷誘導(dǎo)率從大到小依次為烏蘭察布藍花、張家口藍花、定西藍花、平?jīng)鏊{花、會寧藍花、蘭州藍花、臨洮藍花、烏蘭察布紅花。

        2.2 NaCl脅迫對野生資源愈傷耐鹽性評價

        不同NaCl濃度脅迫下野生胡麻品種資源愈傷相對傷鹽害率結(jié)果(表3)顯示,隨著脅迫濃度的增加,所有種質(zhì)的平均鹽害率均為增長趨勢,NaCl濃度為250 mmol/L時平均鹽害率為96.29%,其中烏蘭察布紅花、定西藍花、平?jīng)鏊{花、臨洮藍花等4份種質(zhì)鹽害率達到100%;烏蘭察布藍花的鹽害率為78.42%,在所有供試材料中最低。以NaCl濃度為200 mmol/L時的相對鹽害率結(jié)果作為野生胡麻資源耐鹽性評價標準,得出野生胡麻資源耐鹽性由大到依次為烏蘭察布藍花、定西藍花、會寧藍花、蘭州藍花、張家口藍花、平?jīng)鏊{花、臨洮藍花、烏蘭察布紅花。對愈傷組織長勢的觀察結(jié)果表明,耐鹽性強的野生胡麻資源愈傷組織長勢更強,愈傷組織致密、顏色深綠、成團性好,而敏感型資源普遍較疏松,顏色清淡、玻璃化嚴重。

        表2 不同激素配比愈傷組織誘導(dǎo)率 /%

        表3 不同NaCl濃度脅迫下相對鹽害率 /%

        2.3 NaCl脅迫對野生胡麻愈傷SOD活性的影響

        SOD是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì),能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì),其活性的高低變化反映了植物對氧化損傷的修復(fù)能力[14]。將耐鹽型野生胡麻種質(zhì)烏蘭察布藍花和敏感型野生種質(zhì)烏蘭察布紅花愈傷組織進行生理指標測定。通過圖1可以看出,隨著NaCl濃度增加,烏蘭察布藍花和烏蘭察布紅花2種野生胡麻愈傷SOD質(zhì)量分數(shù)均呈相同變化趨勢,并且SOD活性均在NaCl濃度為250 mmol/L時達到峰值,其中敏感型野生胡麻烏蘭察布紅花最高值為對照的1.66倍,耐鹽型胡麻種質(zhì)烏蘭察布藍花最大值為對照的1.65倍。

        圖1 不同濃度NaCl脅迫下野生胡麻愈傷SOD活性

        2.4 NaCl脅迫對野生胡麻愈傷CAT活性的影響

        CAT和SOD都能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì),其活性的高低變化同樣反映了植物對氧化損傷的修復(fù)能力[15]。通過圖2可以看出,隨著NaCl脅迫濃度的增加,耐鹽型野生胡麻烏蘭察布藍花平均CAT質(zhì)量分數(shù)高于敏感型野生胡麻資源烏蘭察布紅花1.73倍。敏感型野生胡麻CAT質(zhì)量分數(shù)在NaCl濃度150 mmol/L脅迫下達到最高值,為對照的3.35倍;耐鹽型資源在NaCl濃度200 mmol/L脅迫下達到最高值,為對照的5.21倍。

        圖2 不同濃度NaCl脅迫下野生胡麻愈傷CAT活性

        2.5 NaCl脅迫對野生胡麻愈傷POD活性的變化特征

        POD是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶,可清除植物體內(nèi)SOD催化反應(yīng)的產(chǎn)物過氧化氫,從而使需氧生物體免受過氧化氫的毒害[16]。從圖3可以看出,不同濃度NaCl脅迫后,敏感型野生胡麻烏蘭察布紅花POD質(zhì)量分數(shù)在NaCl濃度為50 mmol/L時達到最高,為對照的2.15倍;NaCl濃度為250 mmol/L時POD質(zhì)量分數(shù)與對照相當。耐鹽型種質(zhì)的POD含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢,且在NaCl濃度為250 mmol/L時POD含量達到最大值,為對照的1.79倍。

        圖3 不同濃度NaCl脅迫下野生胡麻愈傷POD活性

        2.6 NaCl脅迫對野生胡麻愈傷MDA含量的變化影響

        丙二醛(MDA)的質(zhì)量分數(shù)代表植物膜脂過氧化的水平,反映植物受傷害的程度[17]。通過圖4可以看出,不同濃度NaCl脅迫下兩類野生胡麻愈傷組織MDA質(zhì)量分數(shù)均出現(xiàn)增加的趨勢,當NaCl脅迫達到200 mmol/L時,兩類野生種質(zhì)的愈傷MDA質(zhì)量分數(shù)均達到最大值,其中敏感型MDA最大含量是對照的13.00倍,耐鹽型MDA最大含量為對照的2.50倍。

        圖4 不同濃度NaCl脅迫下野生胡麻愈傷MDA活性

        3 結(jié)論與討論

        對野生胡麻培養(yǎng)基配方的優(yōu)化結(jié)果顯示,不同激素配比對野生胡麻愈傷的誘導(dǎo)有顯著差異,其中烏蘭察布藍花愈傷誘導(dǎo)率最高,烏蘭察布紅花愈傷誘導(dǎo)最低,其原因一是紅花野生胡麻種子萌發(fā)率低且作為愈傷誘導(dǎo)外植體材料的下胚軸生長較為細弱,愈傷組織普遍疏松,顏色清淡、玻璃化嚴重,從而影響愈傷誘導(dǎo)。二是目前大田栽培品種以藍花為主,趙瑋等[11]通過對栽培品種隴亞10號的組培誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)其愈傷誘導(dǎo)較為容易,且最高可達100%。因此,藍花野生種質(zhì)可能具有和栽培品種相似的高愈傷誘導(dǎo)結(jié)果。

        不同濃度NaCl脅迫下各種野生資源愈傷相對鹽害率均為增長趨勢。在NaCl濃度為250 mmol/L時平均鹽害率為96.29%,其中有4份種質(zhì)鹽害率達到100%,所以此濃度下的結(jié)果已不具有評價各種資源耐鹽性意義,故選擇NaCl濃度為200 mmol/L時的相對鹽害率結(jié)果作為野生胡麻耐鹽性評價依據(jù)。從觀察結(jié)果來看,愈傷誘導(dǎo)率高的野生種質(zhì)長勢更強,愈傷更加致密、深綠,相對含水量比疏松、玻璃化的愈傷低,受到鹽害時具有更高的防御性,如烏蘭察布藍花愈傷誘導(dǎo)率和耐鹽性均為首位,而烏蘭察布紅花愈傷誘導(dǎo)率和耐鹽性均位列最后。

        在鹽分脅迫條件下,膜系統(tǒng)的變化首先表現(xiàn)為鹽分對膜系統(tǒng)的破壞,也反映其對鹽分的忍耐程度,然后是植物對膜系統(tǒng)的修復(fù)。膜系統(tǒng)的修復(fù)與SOD、CAT和POD酶活性的升高是分不開的[18]。本研究顯示,當受到不同濃度NaCl脅迫下耐鹽型野生種質(zhì)較敏感型種質(zhì)愈傷組織含有較高的SOD和CAT質(zhì)量分數(shù)。敏感型野生胡麻的CAT含量在NaCl濃度為150 mmol/L時達到最高,之后迅速下降;而耐鹽型野生資源含量在NaCl濃度為200 mmol/L時達到最高,且下降幅度明顯平緩,表明其CAT對膜系統(tǒng)的修復(fù)能力和持續(xù)性更強。敏感型種質(zhì)POD質(zhì)量分數(shù)變化趨勢為先上升后降低,NaCl濃度為50 mmol/L時POD質(zhì)量分數(shù)達到最高值,表明敏感型野生胡麻的愈傷組織對于NaCl脅迫更為敏感,而隨著NaCl濃度的增加POD自生的保護性酶濃度越來越低,發(fā)揮的作用越來越小。耐鹽型野生資源POD質(zhì)量分數(shù)總體呈現(xiàn)一直上升的趨勢,在NaCl濃度為250 mmol/L時POD質(zhì)量分數(shù)達到最大值。說明POD保護性酶的作用穩(wěn)定發(fā)揮,提高了其對鹽害的耐受性。

        MDA間接反映膜受損狀況,并兼有反饋植物受傷害程度的作用[19]。本研究中,NaCl脅迫下兩類野生胡麻愈傷組織MDA質(zhì)量分數(shù)均明顯增加,表明兩類野生胡麻種質(zhì)的愈傷組織均受到了一定的傷害,而且隨著濃度的增加受傷害更嚴重。雖然耐鹽型野生種質(zhì)在NaCl脅迫下MDA質(zhì)量分數(shù)平均值遠高于敏感型野生種質(zhì),但是與無脅迫處理相比,MDA質(zhì)量分數(shù)變化幅度不大,最高值也只有對照的1.83倍;而敏感型野生種質(zhì)在NaCl脅迫下MDA質(zhì)量分數(shù)發(fā)生劇烈變化,最高時為無脅迫處理的15.90倍,表明其細胞膜受損更重。

        綜上所述,不同野生胡麻種質(zhì)的愈傷增值率、耐鹽性差異性顯著。耐鹽性野生胡麻愈傷組織在NaCl脅迫下SOD、CAT和POD等酶活性較敏感型更高,MDA含量變化幅度較敏感型小,表明耐鹽性種質(zhì)在鹽脅迫下膜細胞受鹽害程度相對較小,保護酶修復(fù)能力強,保護作用能夠更持續(xù)穩(wěn)定發(fā)揮。

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