朱 穎 王中江 李 楊 齊寶坤 隋曉楠 江連洲

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白(SPI)作為一種營養(yǎng)價值豐富的食用蛋白資源，由于其較高的蛋白含量以及優(yōu)良的功能特性，目前已經(jīng)被廣泛地應用于食品加工中[1]。為拓寬其應用前景與開發(fā)價值，大豆分離蛋白的天然改性已經(jīng)成為學者們的研究熱點[2-3]?；ㄇ嗨刈鳛橐环N黃酮類含量豐富、廣泛應用于食品中的植物色素[4]，由于其可清除DPPH自由基，具有很強的抗氧化作用[5]，因而可以延緩衰老。此外花青素還具有抑菌、預防癌癥、抗心血管疾病等多種功能[6-8]。由于花青素是一種小分子活性物質，并且具有較強的蛋白親和性，因此可以通過滲入到蛋白微原纖間，與多肽鏈形成多種交聯(lián)點[9]。在食品的生產(chǎn)加工過程中，蛋白質不可避免地會受到這類小分子的影響，研究表明蛋白可與多酚類發(fā)生交互作用[10]，由于蛋白、多酚結構的差異性，蛋白與多酚交互作用可形成氫鍵、疏水作用、范德華力、離子作用力及共價鍵等[11-12]。

目前已有文獻對多酚類物質與蛋白質的相互作用進行了部分研究。KANAKIS等[13]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚可以與牛奶蛋白通過疏水作用發(fā)生反應，并且茶多酚的加入會改變牛奶蛋白的結構構象，使牛奶蛋白結構更加穩(wěn)定。WANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)橘皮苷對牛血清白蛋白的猝滅機制為靜態(tài)猝滅，并且通過疏水相互作用與牛血清白蛋白發(fā)生作用。HE等[15]研究發(fā)現(xiàn)錦葵色素-3-葡萄糖苷可誘導β-乳球蛋白通過疏水作用與其發(fā)生交聯(lián)，這些相互作用會影響蛋白質的二級結構，同時提高錦葵色素-3-葡萄糖苷的穩(wěn)定性。劉勤勤等[16]研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白與茶多酚通過范德華力和氫鍵發(fā)生相互作用，且茶多酚的加入導致大豆分離蛋白的二級結構發(fā)生改變。但相關研究尚未涉及大豆分離蛋白與花青素的交互作用。

黑米花青素的主要成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥色素-3-葡萄糖苷[17]，本文利用多重光譜技術研究大豆分離蛋白(SPI)與純化黑米花青素(AN)的相互作用，通過熒光光譜研究黑米花青素對大豆分離蛋白的猝滅類型，判斷花青素與大豆分離蛋白是否存在相互作用，并計算花青素與大豆分離蛋白的結合常數(shù)、結合位點數(shù)以及相應的熱力學參數(shù)，探討花青素與大豆分離蛋白間的相互作用機制。使用同步熒光光譜、紫外光譜研究花青素對大豆分離蛋白構象變化的影響，探究花青素對大豆分離蛋白中酪氨酸、色氨酸所處微環(huán)境的極性的影響。使用多重光譜探究花青素對大豆分離蛋白二級結構組成的影響，進一步驗證花青素與大豆分離蛋白間相互作用的存在，為開發(fā)新的大豆蛋白產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(GlycinemaxL.)，東北大豆；黑米(OryzasativaL.，indica Black rice)花青素質量分數(shù)為35%；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉，北京新光化工試劑廠；正己烷、乙酸乙酯、甲醇，天津北科化學品有限責任公司；其他化學試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

F-4500型熒光分光光度計，日本HITACHI 公司；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司；Jasco J-815型圓二色光譜儀，日本分光公司；Cary 50 型紫外光譜儀，美國Varian公司。

1.3 實驗方法

1.3.1大豆分離蛋白制備

參考MEINLSCHMIDT等[18]的方法。將新鮮大豆碾碎成粉后，與正己烷按照液料比3 mL/g混合，室溫(20℃)下攪拌2 h進行3次脫脂。將脫脂豆粉與去離子水按照液料比10 mL/g混合后，用NaOH(2 mol/L)將溶液的pH 值調節(jié)至8.5，室溫下攪拌2 h后，溶液9 000g離心20 min，取上清液用HCl(2 mol/L)將溶液pH值調節(jié)至4.5。溶液靜置2 h后6 000g離心20 min得到蛋白沉淀，最后將蛋白沉淀溶于去離子水，用NaOH(2 mol/L)將蛋白質pH值調節(jié)至7.0。將蛋白溶液冷凍干燥后得粉末狀大豆分離蛋白。

1.3.2花青素提純

參照SUI等[19]的方法，將富含花青素的黑米提取物粉末溶于去離子水，使用固相萃取技術去除黑米提取物中的雜質。具體純化步驟為：首先用2倍體積的酸化水去除不溶性成分，如糖、酸等，然后用 2倍體積的乙酸乙酯去除多酚類化合物，如酚酸、黃酮等，最后用甲醇洗脫吸附在吸附柱上的花青素。使用旋轉蒸發(fā)器在 40℃的條件下除去甲醇，即可得純化后的花青素(AN)，在-20℃條件下貯存，直至使用。在 280 nm處使用高效液相色譜法(HPLC-DAD)檢測花青素的純度。

1.3.3大豆蛋白-花青素溶液制備

將大豆分離蛋白(SPI)粉末用 0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH值 7.4)配置成 0.01 g/mL 的大豆分離蛋白溶液，為SPI對照樣品。按照大豆蛋白與純化后花青素的質量比100∶1、80∶1、60∶1、40∶1、20∶1將純化后的花青素(質量分數(shù)約為20%)加入到大豆分離蛋白溶液中，室溫下磁力攪拌90 min制成大豆分離蛋白-花青素復合體系，分別表示為SPI-AN-1～SPI-AN-5。

1.3.4熒光光譜測定

向10 mL大豆分離蛋白溶液(1.0×10-6mol/L)中分別逐滴加入100 μL 2.0×10-6、4.0×10-6、6.0×10-6、8.0×10-6、1.0×10-5mol/L濃度的花青素溶液，漩渦震蕩后，分別在25、33、41℃恒溫水浴鍋中保溫5 min。選擇激發(fā)波長為280 nm、激發(fā)狹縫為5 nm、掃描速率為12 000 nm/min，連續(xù)掃描，記錄發(fā)射波長為300～500 nm。樣品的同步熒光光譜測定條件如下：室溫條件下，分別固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，Δλ表示兩波長差，進行同步熒光光譜掃描。

1.3.5紫外-可見光譜分析

移取3 mL的大豆分離蛋白溶液于石英比色池中，掃描250～350 nm波長范圍內的吸收光譜。掃描完畢后，將SPI-AN-1～ SPI-AN-5分別于石英比色池中掃描吸收光譜。以相同質量濃度的大豆分離蛋白溶液作空白，記錄大豆分離蛋白溶液的紫外-可見吸收光譜。

1.3.6傅里葉變換紅外光譜分析

將大豆分離蛋白溶液和大豆分離蛋白溶液與花青素的混合溶液SPI-AN-1～SPI-AN-5冷凍干燥，按樣品粉末與溴化鉀粉末質量比1∶100的比例混合，研細均勻后，置于模具中壓片，在32 cm-1分辨率條件下掃描32 次，4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內掃描紅外光譜。

1.3.7圓二色譜分析

將樣品在190～250 nm遠紫外區(qū)進行掃描，掃描速度為60 nm/min，光譜分辨率為0.2 nm，響應時間為0.25 s，狹縫寬度為1 nm。采用Origin 8.0 作圖，并使用CDpro 軟件擬合蛋白質二級結構的組成與含量。

1.3.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組數(shù)據(jù)均重復3 次，利用Origin 8.5 軟件處理數(shù)據(jù)作圖。利用SPSS V17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA 差異顯著性分析及相關性分析。

2 結果與討論

首先采用熒光光譜法，測定大豆分離蛋白和花青素間的相互作用方式，再通過同步熒光光譜法、紫外-可見光譜探究花青素對大豆分離蛋白氨基酸殘基微環(huán)境的影響，進而得出花青素對大豆分離蛋白構象的影響，最后通過傅里葉變換紅外光譜法和圓二色譜法分析花青素對復合物中大豆分離蛋白二級結構組成的變化。熒光光譜分析可以明確花青素與大豆分離蛋白的作用方式，同步熒光光譜和紫外-可見光譜的測定是通過測量發(fā)射波長偏移來直觀反映花青素對大豆分離蛋白構象的影響。紅外光譜法和圓二色譜法可直接測量計算出蛋白質各類型二級結構的含量，可以定量測定加入花青素前后大豆蛋白二級結構含量的變化，直觀地分析花青素對互作體系中蛋白質二級結構的影響，進一步驗證花青素與大豆分離蛋白的相互作用。

2.1 熒光分析

2.1.1花青素對大豆分離蛋白內源熒光光譜的影響

蛋白質的內源熒光主要依賴于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)，在激發(fā)波長為280 nm時，只考慮色氨酸和酪氨酸，苯丙氨酸可以忽略[13]。圖1表示在25℃、pH值7.4的條件下，固定激發(fā)波長為280 nm，掃描300～500 nm波長范圍內隨花青素的增加內源熒光發(fā)射光譜的變化。從圖1可以看出，固定SPI 溶液濃度，隨著花青素的不斷加入，SPI熒光強度逐漸降低，說明花青素對SPI的內源熒光產(chǎn)生了猝滅作用。同時發(fā)現(xiàn)SPI的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生了紅移，SPI從342 nm紅移至352.8 nm，紅移了10.8 nm，這說明花青素與大豆分離蛋白發(fā)生了結合，從而改變了 SPI的結構構象，Trp和 Tyr的微環(huán)境發(fā)生改變，由疏水環(huán)境變?yōu)橛H水環(huán)境，肽鏈結構舒展[14]。

圖1 花青素對SPI熒光光譜的影響Fig.1 Effect of AN on fluorescence spectrum of SPI solutions

2.1.2表觀結合常數(shù)和結合位點數(shù)

熒光猝滅一般可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種作用機制。可以應用Stern-Volmer 方程判斷猝滅類型[20]，公式為

(1)

式中F0、F——未加入和加入猝滅劑花青素時SPI溶液的熒光強度

Q——花青素的濃度，mol/L

Kq——雙分子猝滅速率常數(shù)，L/(mol·s)

Ksv——動態(tài)猝滅常數(shù)，L/mol

τ0——猝滅劑不存在時熒光體的壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s[21]

根據(jù)Stern-Volmer方程，以Q為自變量，F(xiàn)0/F為因變量，作圖2，根據(jù)圖中直線的斜率可以計算出花青素-SPI復合物的Ksv和Kq，結果見表1。對于動態(tài)猝滅，隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)增大，即Stern-Volmer曲線斜率增大。如果是靜態(tài)猝滅則相反。通過圖2和表 1可以看出，隨著溫度的升高，大豆分離蛋白的Stern-Volmer曲線斜率逐漸變小，說明花青素對SPI的熒光猝滅機制是靜態(tài)猝滅。猝滅劑對于生物大分子最大猝滅速率常數(shù)一般為2×1010L/(mol·s)，而花青素對SPI的熒光猝滅速率數(shù)量級均為1012，這進一步表明花青素對SPI的作用機制為靜態(tài)猝滅。

圖2 不同溫度條件下花青素猝滅SPI的Stern-Volmer圖Fig.2 Stern-Volmer plot for quenching on SPI by AN at different temperatures

溫度/KKsv/(L·mol-1)Kq/(L·(mol·s)-1)R22988.11×1048.11×10120.99453067.89×1047.89×10120.99053146.89×1046.89×10120.9883

對于靜態(tài)猝滅過程，結合位點數(shù)n滿足公式

(2)

式中Ks——表觀結合常數(shù)，L/mol

以lg((F0-F)/F)對lgQ作圖得圖3，根據(jù)直線斜率和截距可以得到花青素與熱處理SPI間的表觀結合常數(shù)Ks和結合位點數(shù)n(表2)。從表2可以看出，花青素與SPI間的表觀結合常數(shù)Ks數(shù)量級為104，說明花青素與大豆分離蛋白發(fā)生了緊密的結合，且均形成了結合位點數(shù)接近于1的復合物。

圖3 不同溫度條件下花青素猝滅熱處理SPI的雙對數(shù)圖Fig.3 Double logarithmic curves of SPI quenched by AN at different temperatures

2.1.3熱力學參數(shù)和作用力

生物小分子和蛋白質之間的相互作用力包括氫鍵、靜電作用、范德華力和疏水作用力4種。研究表明，蛋白質和配體之間的作用力可根據(jù)熱力學參數(shù)來進行表征：當焓變ΔH>0、熵變ΔS<0時，分子間作用力主要是靜電引力和疏水作用力；當ΔH>0、

表2 不同溫度SPI-AN復合物的結合位點數(shù)、表觀結合常數(shù)及其決定系數(shù)Tab.2 Apparent binding constants, binding sites numbers and correlation coefficients of SPI-AN complex at different temperatures

ΔS>0時，分子間作用力主要是疏水作用力；當ΔH<0、ΔS<0時，分子間作用力主要是范德華力、氫鍵或質子化等作用；當ΔH<0、ΔS>0時，分子間作用力主要是靜電引力[22-23]。假設在測定溫度范圍內焓變變化不大，則計算公式為

(3)

ΔG=-RTlnK

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

式中K——在相應溫度下體系的結合常數(shù)

R——理想氣體常數(shù)[24]

ΔG——吉布斯自由能

通過計算得大豆蛋白與花青素相互作用的焓變ΔH、熵變ΔS和吉布斯自由能ΔG，如表3所示。

表3 不同溫度下SPI-AN結合的熱力學參數(shù)Tab.3 Thermodynamic parameters of SPI-AN binding at different temperatures

由表3可知，ΔG<0，說明花青素與大豆蛋白的結合可以自發(fā)進行。該反應的ΔH>0，表明花青素與大豆分離蛋白之間的相互作用為吸熱反應，升溫有利于反應的進行，這與表觀結合常數(shù)Ks隨著溫度的升高而逐漸升高相吻合。由體系的ΔH>0和ΔS>0可說明花青素與大豆分離蛋白之間的作用力主要是疏水作用力。

2.2 花青素對大豆分離蛋白構象的影響

2.2.1同步熒光光譜分析

同步熒光光譜法用于反映對應氨基酸附近環(huán)境的極性情況，廣泛應用于小分子和生物大分子相互作用的研究領域中。同步熒光光譜法是一種廣泛應用的通過測量發(fā)射波長偏移來研究氨基酸殘基微環(huán)境的方法，能夠反映花青素對大豆分離蛋白構象的影響。固定激發(fā)和發(fā)射單色器的波長差(Δλ)，以固定的Δλ得到同步熒光光譜，從而獲得關于生色團分子周圍環(huán)境的信息。當Δλ=15 nm時，只顯示酪氨酸殘基的特征熒光光譜；當Δλ=60 nm時，只顯示色氨酸殘基的特征熒光光譜，由此可判斷大豆分離蛋白中酪氨酸殘基和色氨酸殘基微環(huán)境的極性變化[25]。

由圖4可知，隨著花青素濃度的增加，大豆分離蛋白中酪氨酸殘基(Δλ=15 nm)和色氨酸殘基(Δλ=60 nm)的特征熒光吸收峰不斷猝滅，Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的最大發(fā)射峰均有紅移，表明加入花青素后，大豆分離蛋白中色氨酸和酪氨酸附近的微環(huán)境有所改變，極性增加。色氨酸最大發(fā)射峰紅移5 nm(從286 nm紅移至291 nm)(圖4b)，酪氨酸最大發(fā)射峰紅移2 nm(從293 nm紅移至295 nm(圖4a)，說明花青素與大豆分離蛋白作用的結合位點更接近于色氨酸殘基[26]。酪氨酸、色氨酸殘基所處微環(huán)境的改變可能部分歸因于蛋白質結構發(fā)生部分變化，因此花青素造成蛋白構象的變化。劉勤勤等[16]研究茶多酚與大豆蛋白的相互作用發(fā)現(xiàn)茶多酚的加入導致大豆蛋白結構發(fā)生變化，與本實驗研究結果一致。

圖4 SPI-AN復合體系的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of SPI-AN complex system

2.2.2紫外-可見吸收光譜分析

紫外-可見光譜廣泛應用于小分子與生物大分子作用的研究中。一般來說，峰的強度變化是兩者相互作用強弱的標志，而峰位的改變通常認為是由蛋白質大分子疏水氨基酸殘基微環(huán)境變化引起構象變化導致的。大多數(shù)蛋白質分子由于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)等氨基酸中芳香雜環(huán)對光的吸收，故在270 nm波長附近有一個吸收峰。蛋白質分子中芳香族氨基酸殘基所處微環(huán)境發(fā)生改變，會引起蛋白質吸收波長變化，因而可以利用蛋白質的紫外-可見吸收光譜初步探討蛋白質結構的變化[27-28]。

圖5顯示了不同濃度花青素對大豆分離蛋白紫外-可見吸收光譜的影響。從圖中可以看出，隨著花青素濃度增加，大豆分離蛋白的紫外-可見吸收光譜峰值依次升高，并且發(fā)生藍移，最大吸收峰波長由277 nm藍移至271 nm，說明花青素誘導大豆分離蛋白分子肽鏈伸展，使得深埋在大豆分離蛋白分子內部酪氨酸殘基和色氨酸殘基中的芳香雜環(huán)疏水基團裸露出來，造成了大豆分離蛋白構象發(fā)生改變，進而增強了吸光度。這種構象的改變更有利于大豆分離蛋白分子中色氨酸殘基和酪氨酸殘基中芳香雜環(huán)的π-π*躍遷。

圖5 不同濃度花青素對SPI溶液紫外-可見吸收光譜的影響Fig.5 Effect of AN concentration on UV-Vis absorption spectrum of SPI

2.2.3紅外光譜分析

圖6 SPI和SPI-AN的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.6 Fourier transform infrared spectroscopy of SPI and SPI-AN

2.2.4圓二色譜分析

圓二色譜是一種測量蛋白二級結構快速、準確且靈敏的技術，可以在水溶性蛋白溶液中直接測量計算出蛋白質各類型二級結構的相對含量[35]。通過CD 譜圖法可以定量測定加入花青素前后大豆分離蛋白質二級結構含量的變化，進一步驗證花青素與大豆分離蛋白的相互作用[36]。大豆蛋白質在加入花青素前后的CD 譜圖通過CDpro 軟件擬合出的二級結構含量如表4所示。

經(jīng)過不同濃度的花青素復合后，蛋白質中二級結構含量均發(fā)生了明顯的變化。如表4所示，所有樣品均表現(xiàn)出α-螺旋相對含量降低，β-折疊相對含量升高的現(xiàn)象，樣品中蛋白質二級結構以β-結構為主。與HE等[15]的研究一致，可能是花青素結合到大豆蛋白α-螺旋結構中的疏水性氨基酸區(qū)域，從而使蛋白質分子展開改變其空間構象。LIU等[37]研究乳鐵蛋白與綠原酸、沒食子酸相互作用，結果表明在乳鐵蛋白-綠原酸和乳鐵蛋白-沒食子酸復合物的二級結構中蛋白質的α螺旋結構相對含量均降低，β折疊相對含量均增加，與本文研究結果一致。

表4 圓二色譜測定加入花青素后復合物中SPI的二級結構相對含量Tab.4 Secondary structure relative content of SPI in AN complex estimated from circular dichroism spectra %

注：同一列數(shù)據(jù)后不同字母表示樣品間差異顯著(P<0.05)。

總體來說，圓二色譜結果證明了花青素與大豆蛋白的相互作用導致大豆蛋白二級結構的變化[38]，結果與紅外光譜一致。

3 結論

(1)花青素對大豆分離蛋白的熒光猝滅機制屬于靜態(tài)猝滅，大豆蛋白與花青素之間的作用力主要是疏水作用力，通過疏水相互作用大豆蛋白和花青素可以形成結合位點數(shù)接近于1的復合物。

(2)同步熒光光譜和紫外-可見光譜結果說明花青素的加入導致大豆蛋白中酪氨酸、色氨酸殘基所處微環(huán)境的改變，從而引起大豆蛋白結構發(fā)生部分變化，且花青素與大豆分離蛋白作用的結合位點更接近于色氨酸殘基。

(3)紅外光譜和圓二色譜結果說明花青素引起大豆蛋白二級結構發(fā)生改變，進一步說明大豆蛋白和花青素發(fā)生了相互作用。

(4)花青素和大豆蛋白間主要作用力是疏水相互作用，花青素的加入導致大豆蛋白中酪氨酸、色氨酸殘基所處微環(huán)境的改變，使大豆分離蛋白的分子構象發(fā)生改變，從而引起大豆蛋白二級結構發(fā)生變化。

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