王喜波 徐曄曄 于 潔 王 健 王小丹 江連洲

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白(SPI)由于其高度的營養(yǎng)和功能特性而被廣泛應(yīng)用于許多基于蛋白質(zhì)的食品配方中[1]。其中SPI柔性指的是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處周圍環(huán)境變化時，其結(jié)構(gòu)能夠發(fā)生改變的能力[2]，通過蛋白酶消化檢測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)柔性可能是控制乳化特性的重要結(jié)構(gòu)因素[3]。TANG等[4]通過S-S裂解研究了牛血清白蛋白的構(gòu)象柔性和乳化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)(在溶液中)的構(gòu)象柔性在其乳化特性的不同方面起著至關(guān)重要的作用。高壓均質(zhì)是在制藥、食品和化妝品領(lǐng)域研究中被廣泛應(yīng)用的一種非熱技術(shù)，需要高能量輸入來制備液滴尺寸在亞微米范圍內(nèi)的乳液，一般通過高剪切攪拌、高壓均質(zhì)機(jī)或超聲波引發(fā)器獲得[5]。在均質(zhì)化過程中，流體受到空穴爆炸力、湍流、剪切、摩擦、熱、壓縮、加速、快速壓降和碰撞等各種力的同時作用而形成一種精細(xì)的、均勻的乳液[6]。近年來對于高壓均質(zhì)對蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)之間構(gòu)效關(guān)系的研究已經(jīng)獲得了廣泛的關(guān)注，然而，關(guān)于高壓均質(zhì)對SPI柔性的影響及柔性與乳化特性相關(guān)性關(guān)系分析還鮮有報道。

本文將柔性的概念引入高壓均質(zhì)改性中，研究均質(zhì)壓力對SPI柔性、乳化特性以及其他結(jié)構(gòu)特性的影響，并分析SPI柔性與乳化特性之間的關(guān)系，以期為實際生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供；大豆油，九三集團(tuán)哈爾濱惠康食品有限公司；三氯乙酸，永華精細(xì)化學(xué)品有限公司；SDS(十二烷基硫酸鈉)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、胰蛋白酶、ANS熒光探針，Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T18 Basic型高速分散機(jī)/勻漿機(jī)，德國IKA公司；LD4-2A型低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；實驗型高壓均質(zhì)機(jī)，英國Stansted Fluid Power公司；TU-1800型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；ALC-310.3型分析天平，德國艾科勒ACCULAB公司；紫外分光光度計，美國布魯克海文儀器公司。

1.3 方法

1.3.1SPI制備

根據(jù)SORGENTINI等[7]的方法略作修改，大豆經(jīng)粉碎機(jī)粉碎并過60目篩，再經(jīng)索氏提取器用乙醚提取后獲得脫脂豆粕。將脫脂豆粕與蒸餾水以料液比10 mg/L的比例混合。用2 mol/L NaOH調(diào)體系pH值為8.5，室溫(20℃)低速攪拌2 h。離心(4 000g)20 min，取上清液，用2 mol/L HCl調(diào)pH值至4.5，4℃靜置12 h，取沉淀進(jìn)行離心(4 000g，5 min)，沉淀水洗兩次，復(fù)溶后調(diào)pH值至7.0，預(yù)凍后進(jìn)行冷凍干燥。

1.3.2SPI成分測定

蛋白含量測定采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2010)；含水率測定采用直接干燥法(GB 5009.3—2010)；灰分含量測定參照GB 5009.4—2010；粗脂肪測定參照GB/T 14772—2008。

1.3.3樣品制備

將SPI溶于緩沖液(0.2 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖液)，質(zhì)量濃度為5 mg/mL，室溫攪拌2 h，再使用T18 Basic型高速分散機(jī)處理1 min，轉(zhuǎn)速為10 800 r/min，然后在4℃靜置水化12 h。

1.3.4高壓均質(zhì)處理

將制備好的樣品取出攪拌均勻至室溫，用高壓均質(zhì)機(jī)處理，設(shè)定均勻壓力分別為0、40、60、80、100、120、140、160、180、200 MPa。

1.3.5柔性測定

參照KATO等[8]的方法略作修改。利用SPI對胰蛋白酶的敏感性來表征柔性。取250 μL 1 mg/mL酶液(0.05 mol/L、pH值8.0 Tris-HCl緩沖液)加入到4 mL 1 mg/mL處理后SPI蛋白溶液中(蛋白與酶質(zhì)量比為16∶1)，38℃保溫酶解5 min，酶解反應(yīng)結(jié)束后，加4 mL 5% TCA(三氯乙酸)終止反應(yīng)，離心后取上清液測定其在280 nm吸光度，用吸光度A表征量化柔性。

1.3.6表面疏水性測定

參照SCHMAL等[9]方法并略作改動。用濃度0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值 7.0)將SPI樣品溶液稀釋到2 mg/mL，再稀釋為樣品質(zhì)量濃度分別為0.1、0.05、0.002 5、0.001 25 mg/mL，加入20 μL的ANS(8 mmol/L ANS，溶于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH值7.0)熒光探針，混勻后在室溫下避光15 min后測定SPI樣品的熒光強(qiáng)度，同時設(shè)定激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，狹縫寬度5 nm，測得的熒光強(qiáng)度對蛋白溶液質(zhì)量濃度作圖，選擇線性關(guān)系良好的回歸線斜率作為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)。

1.3.7濁度測定

參照KURGANOV[10]的方法并略作改動。將處理后的SPI樣品溶液稀釋至3 mg/mL，混合均勻后在波長400 nm測定其吸光度，用所得光密度(OD值)表示濁度，所有測定結(jié)果重復(fù)3次。

1.3.8粒徑測定

將處理過的SPI樣品用去離子水稀釋到1 mg/mL，在粒度測定儀上進(jìn)行粒度的測定，每個蛋白樣品檢測3次。

1.3.9內(nèi)源性色氨酸熒光光譜測定

參照LIU等[11]的方法并略作改動。處理后的SPI樣品稀釋到0.2 mg/mL進(jìn)行測定，同時設(shè)定激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長范圍為300～460 nm，狹縫寬度均為2.5 nm，電壓為700 mV進(jìn)行熒光光譜掃描，所有測定結(jié)果重復(fù)3次。

1.3.10紫外掃描

參照LIANG等[12]的方法并略作改動。處理后的SPI樣品稀釋至0.2 mg/mL后進(jìn)行紫外掃描，掃描波長范圍150～500 nm，掃描速率100 nm/min，分辨率為0.2 nm，所有測定結(jié)果重復(fù)3次。

針對實例2，教師提出問題：將幼小植株在適宜條件下橫放，一段時間以后，莖彎曲向上生長，根彎曲向下生長（圖5）。一般認(rèn)為，這是因為重力作用使得生長素分布不均勻，而且與根、莖對生長素的敏感程度不同有關(guān)，你能對這種現(xiàn)象作出合理解釋嗎？

1.3.11乳化性測定

參照TANG等[13]的方法。將處理后的SPI蛋白樣品稀釋到2 mg/mL，處理后蛋白樣品與大豆油以體積比3∶1混合，分散機(jī)10 000 r/min處理1 min，迅速吸取底部乳液50 μL加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，在漩渦混合器上混合均勻。分別測定0 min和10 min時吸光度，乳化活性用吸光度A表示，乳化穩(wěn)定性的計算公式為

式中E——乳化穩(wěn)定性，min

A0——0 min時測得的吸光度

A10——10 min時測得的吸光度

1.3.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每次試驗做3次平行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)間差異顯著性采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)用Origin 9.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆分離蛋白的組成

試驗制得的SPI蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、含水率、灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(90.22±0.44)%、(3.24±0.67)%、(3.39±0.53)%和(0.47±0.56)%，符合試驗要求[14]。

2.2 均質(zhì)壓力對SPI柔性的影響

在不同均質(zhì)壓力處理條件下，SPI柔性隨著均質(zhì)壓力的增大而呈現(xiàn)增大的趨勢，在均質(zhì)壓力范圍為0～160 MPa時，SPI柔性隨著均質(zhì)壓力的增大而增大，180 MPa時，柔性變化趨勢不明顯，這是因為高壓均質(zhì)產(chǎn)生了強(qiáng)大剪切力、撞擊力及空穴爆炸力，均質(zhì)壓力處理對SPI的三級和四級結(jié)構(gòu)有顯著的影響，并通過非共價鍵的切割破壞了SPI蛋白內(nèi)部的剛性結(jié)構(gòu)[15-16]，導(dǎo)致柔性的上升，且隨著均質(zhì)壓力的上升，破壞強(qiáng)度增大。當(dāng)均質(zhì)壓力為200 MPa時，SPI柔性表現(xiàn)出下降的趨勢，這可能是由于通過SH/S-S交換連接形成分子間二硫鍵，壓力過大而引起了蛋白亞基的聚集[17-18]。

2.3 均質(zhì)壓力對SPI表面疏水性指數(shù)的影響

TEDFORD等[15]指出均質(zhì)壓力使弱氫鍵和分子間作用力之間裂解從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化。SPI表面疏水性指數(shù)隨著均質(zhì)壓力的增加而上升，表明高壓均質(zhì)的作用會使SPI蛋白質(zhì)分子進(jìn)一步伸展，原來隱藏在SPI內(nèi)部的疏水基團(tuán)隨著均質(zhì)壓力的增加而逐漸暴露于外部，使得SPI結(jié)構(gòu)變得更加伸展。當(dāng)均質(zhì)壓力為200 MPa時，SPI表面疏水性指數(shù)大幅增加，這可能是因為高壓處理SPI時強(qiáng)剪切力對SPI內(nèi)部隱藏的疏水性基團(tuán)進(jìn)行切割，更多的疏水性基團(tuán)暴露，SPI表面疏水性指數(shù)大幅增加，柔性隨均質(zhì)壓力變化趨勢與表面疏水性指數(shù)隨均質(zhì)壓力變化的趨勢相近。SPI表面疏水性指數(shù)的增加可以增強(qiáng)SPI的乳化活性，這是因為高壓均質(zhì)處理改善了大豆蛋白質(zhì)，特別是β-伴大豆球蛋白的β-亞基和大豆球蛋白的酸性亞基吸附在油-水乳液的油/水界面處的能力[19]，因此，SPI表面疏水性指數(shù)的增加意味著乳化活性也隨之增強(qiáng)。

2.4 均質(zhì)壓力對SPI濁度的影響

隨著均質(zhì)壓力的增加，SPI濁度逐漸降低，這是因為未高壓均質(zhì)處理的蛋白質(zhì)在底部沉積有大量高分子聚合物，蛋白質(zhì)溶液不均勻，故SPI濁度較大。CROMWELL等[20]認(rèn)為濁度與溶液中聚集體大小和數(shù)量有關(guān)，當(dāng)較大的SPI顆粒在高壓均質(zhì)條件下處理后可以加工成穩(wěn)定的乳液或懸浮液細(xì)顆粒，導(dǎo)致溶液濁度的降低，并且均質(zhì)壓力越大，濁度越低，這可能是由于高壓均質(zhì)處理產(chǎn)生了更加靈活和低分子量的聚集體，這些聚集體迅速移動到氣-液界面并展開，導(dǎo)致表面張力的有效降低[21]。IBANOLU等[22]在乳清蛋白分離物中也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果，推測蛋白質(zhì)分子變得更小，更易于在高壓下以更快的速度在界面吸附，形成均勻穩(wěn)定的乳液，即濁度降低。

2.5 均質(zhì)壓力對SPI粒徑的影響

圖1 均質(zhì)壓力對SPI粒徑的影響Fig.1 Effect of homogeneous pressure treatment on particle size of SPI

2.6 SPI內(nèi)源性色氨酸熒光光譜分析

熒光光譜法是一種非常成熟的技術(shù)，用于觀察蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，以及研究蛋白質(zhì)基質(zhì)在加工或儲存過程中的變化，在蛋白質(zhì)中，主要的熒光基團(tuán)是色氨酸的吲哚基團(tuán)，其發(fā)射對溶劑極性非常敏感[26-28]。因此，蛋白質(zhì)的熒光光譜由熒光氨基酸的化學(xué)環(huán)境決定，色氨酸(Trp)光譜的變化可以用于鑒定蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[29]。如圖2所示，內(nèi)源性熒光強(qiáng)度隨著均質(zhì)壓力的增加而增加，這與濁度變化趨勢一致，表明隨著柔性的增加，SPI空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，色氨酸殘基暴露于蛋白質(zhì)分子表面，蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域局部改變，發(fā)色基團(tuán)如色氨酸殘基所處環(huán)境由非極性向極性轉(zhuǎn)化，這可能是由高壓均質(zhì)處理導(dǎo)致SPI蛋白分子部分解折疊造成的，即隨著柔性的增加，SPI三級結(jié)構(gòu)變得更加舒展。

圖2 SPI內(nèi)源性色氨酸熒光光譜分析Fig.2 Analysis of endogenous tryptophan fluorescence of SPI

2.7 SPI紫外掃描光譜分析

蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收主要是由于蛋白中的發(fā)色基團(tuán)對紫外光的吸收作用，發(fā)色基團(tuán)包括色氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)，根據(jù)對紫外光譜吸收的不同，可以推斷蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化[30]，如圖3所示，隨著均質(zhì)壓力的增加，紫外吸收下降，說明SPI分子中具有紫外吸收的氨基酸殘基(如酪氨酸殘基等)因均質(zhì)處理而暴露在蛋白分子的表面，發(fā)色基團(tuán)所處的環(huán)境由非極性向極性變化，均質(zhì)處理促使蛋白多肽鏈局部展開，蛋白分子柔性增大。這與濁度變化趨勢一致。這更加印證了內(nèi)源性色氨酸熒光光譜的結(jié)果，隨著蛋白柔性的增加，SPI結(jié)構(gòu)變得更加的舒展。

圖3 SPI紫外圖譜分析Fig.3 Analysis of SPI by ultraviolet scanning spectrometry

2.8 均質(zhì)壓力對SPI乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

如圖4所示，當(dāng)均質(zhì)壓力不大于160 MPa時，乳化活性隨著均質(zhì)壓力的增加而增加，這與楊盛楠等[31]的結(jié)果一致，即在一定均質(zhì)壓力范圍內(nèi)，隨著均質(zhì)壓力的增大，SPI乳化活性增加，當(dāng)壓力為160 MPa時乳化活性最大，隨后乳化活性又呈現(xiàn)下降的趨勢，而乳化穩(wěn)定性隨著均質(zhì)壓力的變化趨勢與乳化活性隨均質(zhì)壓力的變化趨勢相似，當(dāng)壓力為180 MPa時乳化穩(wěn)定性最大，這與柔性變化趨勢較相近。SPI柔性增強(qiáng)，原先包含在分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來，增強(qiáng)了蛋白的親油性，宏觀表現(xiàn)為蛋白乳化能力的提高。

圖4 均質(zhì)壓力對SPI乳化特性的影響Fig.4 Effect of homogeneous pressure treatment on emulsification properties of SPI注：不同大寫字母表示乳化穩(wěn)定性差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示乳化活性差異顯著(P<0.05)。

2.9 SPI柔性與乳化性的關(guān)系

由圖5、6可知，在各高壓均質(zhì)壓力條件下，隨著柔性的增加，乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)遞增趨勢，具有良好的線性相關(guān)關(guān)系，其中，SPI柔性與乳化活性、乳化穩(wěn)定性的線性擬合模型函數(shù)分別y=1.485 8x+0.016 9、y=34.062x+3.520 6，相關(guān)系數(shù)分別為0.893、0.938，當(dāng)均質(zhì)壓力為180 MPa時，SPI柔性與乳化穩(wěn)定性可以達(dá)到最大，且高壓均質(zhì)處理對乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響略大于柔性。

圖5 柔性與乳化活性的關(guān)系Fig.5 Relationship between flexibility and emulsifying activity of SPI

圖6 柔性與乳化穩(wěn)定性的關(guān)系Fig.6 Relationship between flexibility and emulsification stability of SPI

中性大豆蛋白經(jīng)過高壓均質(zhì)處理可以提高這些蛋白的乳化活性[32]，形成具有抗絮凝現(xiàn)象和高界面蛋白濃度的油滴乳液[15]，YU等[33]發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)處理可以改善貽貝分離蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。關(guān)于柔性和乳化性的關(guān)系研究，其中KITTIPHATTANABAWON等[34]認(rèn)為，蛋白質(zhì)的乳化性與分子的柔性有關(guān)，柔性的增加可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分子向界面移動，并有助于蛋白分子在界面上發(fā)生重排，王喜波等[35]的研究結(jié)果表明，超高壓(100～450 MPa)均質(zhì)處理條件下，SPI柔性與乳化活性、乳化穩(wěn)定性呈正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

(1)當(dāng)均質(zhì)壓力為0～160 MPa時，SPI柔性隨著均質(zhì)壓力的增加而增加，160～180 MPa時柔性變化不明顯，當(dāng)均質(zhì)壓力為180～200 MPa時，SPI柔性又呈現(xiàn)下降的趨勢。

(2)表面疏水性隨著均質(zhì)壓力的增大而增大，而濁度則隨之減小。乳化特性隨均質(zhì)壓力的變化趨勢與柔性隨均質(zhì)壓力的變化趨勢相似，紫外掃描、內(nèi)源性色氨酸熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)，隨著SPI柔性的增加，其結(jié)構(gòu)變得更加舒展。

(3)在不同均質(zhì)壓力處理條件下，SPI柔性與乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈顯著性正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.893和0.938。

1 KINSELLA J E. Functional properties of soy proteins[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 1979, 56(3):242-258.

2 TANG C H. Emulsifying properties of soy proteins: a critical review with emphasis on the role of conformational flexibility[J]. Critical Review in Food Science and Nutrition, 2017, 57(12):2636-2679.

3 KATO A, KOMATSU K, FUJIMOTO K, et al. Relationship between surface functional properties and flexibility of proteins detected by the protease susceptibility[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1985, 33(33):931-934.

4 TANG C H, SHEN L. Role of conformational flexibility in the emulsifying properties of bovine serum albumin[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2013, 61(12):3097-3110.

5 WEISS J, TAKHISTOV P, MCCLEMENTS J. Functional materials in food nanotechnology[J]. Journal of Food Science, 2006, 71(9):R107-R116.

6 FLOURY J, DESRUMAUX A, LARDIRES J. Effect of high-pressure homogenization on droplet size distributions and rheological properties of model oil-in-water emulsions[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2000, 1(2):127-134.

7 SORGENTINI D A, WAGNER J R. Comparative study of structural characteristics and thermal behavior of whey and isolate soybean proteins[J]. Journal of Food Biochemistry, 2010, 23(5): 489-507.

8 KATO A, IBRAHIM H R, WATANABE H, et al. Structural and gelling properties of dry-heated egg white proteins[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2002, 38(1): 32-37.

9 SCHMAL H, NIEMEYER P, ZWINGMANN J, et al. Relationships of hydrophobicity and net charge to the solubility of milk and soy proteins[J]. Journal of Food Science, 1985, 50(2): 486-491.

10 KURGANOV B I. Kinetics of protein aggregation. Quantitative estimation of the chaperone-like activity in test-systems based on suppression of protein aggregation[J]. Biochemistry, 2002, 67(4): 409-422.

11 LIU Y, ZHAO G, ZHAO M, et al. Improvement of functional properties of peanut protein isolate by conjugation with dextran through Maillard reaction[J]. Food Chemistry, 2012, 131(3): 901-906.

12 LIANG H N, TANG C H. Emulsifying and interfacial properties of vicilins: role of conformational flexibility at quaternary and/or tertiary levels[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2013, 61(46): 11140-11150.

13 TANG S, HETTIARACHCHY N S, HORAX R, et al. Physicochemical properties and functionality of rice bran protein hydrolyzate prepared from heat-stabilized defatted rice bran with the aid of enzymes[J]. Journal of Food Science, 2006, 68(1): 152-157.

15 TEDFORD L A, SMITH D, SCHASCHKE C J. High-pressure processing effects on the molecular structure of ovalbumin, lysozyme, and beta-lactoglobulin[J]. Food Research International, 1999, 32, 101-106.

16 HAYAKAWA I, LINKO Y-Y, LINKO P. Mechanism of highpressure denaturation of proteins[J]. LWT—Food Science and Technology, 1996, 29(8): 756-762.

17 GALAZKA V B, DICKINSON E, LEDWARD D A. Emulsifying behavior of 11S globulinViciafabain mixtures with sulphated polysaccharides: comparison of thermal and high-pressure treatments[J]. Food Hydrocolloids, 1999, 13(5): 425-435.

18 GALAZKA V B, SMITH D, LEDWARD D A, et al. Interactions of ovalbumin with sulphated polysaccharides: effects of pH, ionic strength, heat and high-pressure treatment[J]. Food Hydrocolloids, 1999, 13(2): 81-88.

19 PUPPO M C, SPERONI F, CHAPLEAU N, et al. Effect of high-pressure treatment on emulsifying properties of soybean proteins[J]. Food Hydrocolloids, 2005, 19(2):289-296.

20 CROMWELL M E M, HILARIO E, JACOBSON F. Protein aggregation and bioprocessing[J]. The Journal of American Association of Pharmaceutical Scientists, 2006, 8(3):E572-E579.

21 YUAN B, REN J Y, ZHAO M M, et al. Effects of limited enzymatic hydrolysis with pepsin and high-pressure homogenization on the functional properties of soybean protein isolate[J]. LWT—Food Science and Technology, 2012, 46(2):453-459.

24 HEBISHY E, BUFFA M, JUAN B, et al. Ultra high-pressure homogenized emulsions stabilized by sodium caseinate: effects of protein concentration and pressure on emulsions structure and stability[J]. LWT—Food Science and Technology, 2017, 76:57-66.

25 WANG W, ZHU Y, CHEN T, et al. Kinetic and thermodynamic analysis of ultra-high pressure and heat-induced denaturation of bovine serum albumin by surface plasmon resonance[J]. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2017, 16(8):1965.

26 CASTELAIN C, GENOT C. Conformational changes of bovine serum albumin upon its adsorption in dodecane-in-water emulsions as revealed by front-face steady-state fluorescence[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1994, 1199(1):59-64.

27 GRANGER C, COSTA J P D, TOUTAIN J, et al. Mapping of ice cream formulation using front-face fluorescence spectroscopy[J]. International Dairy Journal, 2006, 16(5):489-496.

28 TAY S L, KASAPIS S, PERERA C O, et al. Functional and structural properties of 2S soy protein in relation to other molecular protein fractions.[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(16):6046.

29 LAKOWICZ J R. Principles of fluorescence spectroscopy[J]. Naturwissenschaften, 1991, 78(10):456-457.

30 RUSO J M, GONZLEZ-PéREZ A, PRIETO G, et al. Study of the interactions between lysozyme and a fully-fluorinated surfactant in aqueous solution at different surfactant-protein ratios[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2003, 33(1):67-73.

31 楊盛楠, 翟愛華. 高壓均質(zhì)對大豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響[J]. 中國釀造, 2014, 33(12):89-93.

YANG Shengnan, ZHAI Aihua. Effect of high pressure homogenization on the functional properties of soy protein isolate [J]. Chinese Brewing, 2014,33(12):89-93. (in Chinese)

32 MOLINA E, PAPADOPOULOU A, LEDWARD D A. Emulsifying properties of high pressure treated soy protein isolate and 7S and 11S globulins [J]. Food Hydrocolloids, 2001, 15(3):263-269.

33 YU C, CHA Y, WU F, et al. Effects of high-pressure homogenisation on structural and functional properties of mussel (Mytilusedulis) protein isolate[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2018,53(5):1157-1165.

34 KITTIPHATTANABAWON P, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. Characterisation of acid-soluble collagen from skin and bone of bigeye snapper (Priacanthustayenus)[J]. Food Chemistry, 2005, 89(3):363-372.

35 王喜波, 王健, 張澤宇,等. 物理改性對大豆蛋白柔性與乳化性的影響及其相關(guān)性分析[J/OL]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報, 2017,48(7):339-344.http:∥www.j-csam.org/jcsam/ch/reader/view_abstract.aspx?flag=1&file_no=20170743&journal_id=jcsam. DOI: 10.6041/j.issn.1000-1298.2017.07.043.

WANG Xibo, WANG Jian, ZHANG Zeyu, et al. Effect of physical modification on the flexibility and emulsification of soybean protein and its correlation analysis[J/OL]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2017, 48(7):339-344. (in Chinese)