孫宇蛟，陳 欣，李 悅，徐慧瑩，董 源，王 左，康雨琦

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

甜葉菊是一種含糖量很高的作物，葉片中的甜菊醇糖苷（steviol glycosides，SGs）是一種天然的甜味劑，其甜度是蔗糖的300倍左右，但熱量只有蔗糖的1/3 000[1]，因此，甜葉菊深受糖尿病、肥胖癥等相關(guān)疾病患者的關(guān)注。近些年來(lái)，甜葉菊被大規(guī)模運(yùn)用到食品、醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域。它作為一種新型的食材和藥材，在國(guó)內(nèi)外均廣受關(guān)注。有研究表明，作為甜菊醇糖苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，尿嘧啶二磷酸-糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）通常以甜菊醇為前體，合成不同的甜菊醇糖苷，對(duì)甜葉菊甜度和品質(zhì)的提高有關(guān)鍵作用。

UGT基因種類(lèi)多樣，在許多經(jīng)濟(jì)和模式作物中均有研究。Brazier等人通過(guò)T-DNA插入手段，獲得了擬南芥T3代UGT72B1基因敲除株，發(fā)現(xiàn)ugt72b1植株（At4g01070）對(duì)3，4-二氯苯胺（3，4-dichloroaniline，DCA）和2，4，5-三氯苯酚（2，4，5-trichlorophenol，TCP）的結(jié)合能力顯著下降，證明了UGT基因在植物體內(nèi)的脫毒作用[2]；Jackon等人通過(guò)對(duì)擬南芥UGT84B1基因過(guò)表達(dá)植株的研究，發(fā)現(xiàn)其具生長(zhǎng)激素缺陷的現(xiàn)象，推測(cè)該基因可能參與植物激素平衡[3]；Chong等人通過(guò)抑制糖基轉(zhuǎn)移酶TOGT基因在煙草中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在其植株中出現(xiàn)組織壞死、抗性降低等表型。推測(cè)該基因可能與植物防御相關(guān)[4]。

在世界范圍內(nèi)，多數(shù)學(xué)者對(duì)甜葉菊糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、合成及其功能進(jìn)行了研究，但在基因及蛋白質(zhì)層面對(duì)甜葉菊尿嘧啶二磷酸-糖基轉(zhuǎn)移酶的研究卻不多。本研究依托于生物信息學(xué)分析，以甜葉菊3個(gè)UGT基因?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行了理化性質(zhì)分析、初級(jí)及高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)、多序列比對(duì)分析，并與康乃馨、陸地棉等其他物種的UGT基因一同構(gòu)建了分子進(jìn)化樹(shù)，以期為甜葉菊作物UGT蛋白質(zhì)研究及分子輔助育種提供參考及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

甜葉菊3個(gè)尿嘧啶二磷酸-糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT76G1（AY345974）、UGT85C2（AY345978）、UGT91D1（AY345980）及其他物種UDT基因均來(lái)源于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 UGT基因各級(jí)結(jié)構(gòu)的分析

采用在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)UGT蛋白序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)，通過(guò)ProtScale在線工具（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)的親疏水性，利用SOPMA在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預(yù)測(cè)UGT蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，采用SWISS-MODEL軟件（http://www.swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 多序列比對(duì)及分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

通過(guò)Clustal X2和DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)分析，采用MEGA 7.0軟件對(duì)所有蛋白質(zhì)編碼序列進(jìn)行分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，采用鄰接法（Neighbor-jioning，NJ）建樹(shù)，其中，校正值（bootstrap）設(shè)置為1 000，其他均為默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 UGT基因一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

UGT76G1、UGT85C2、UGT91D1對(duì)應(yīng)蛋白序列通過(guò)https://web.expasy.org/protparam/進(jìn)行分子量、等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)量、帶正負(fù)點(diǎn)的殘基總數(shù)、分子式、不穩(wěn)定指數(shù)和脂肪酸指數(shù)預(yù)測(cè)，相關(guān)結(jié)果如表1所示。經(jīng)分析，從表1中可以看出，等電點(diǎn)集中于6左右，氨基酸數(shù)量為520～550個(gè)不等，不穩(wěn)定指數(shù)集中于45左右，脂肪族指數(shù)為100左右。

表1 UGT基因一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.2 UGT蛋白質(zhì)的親疏水性預(yù)測(cè)

通過(guò)https://web.expasy.org/protparam/預(yù)測(cè)所有蛋白質(zhì)親疏水性（GRAVY）。UGT76G1、UGT85C2、UGT91D1對(duì)應(yīng)的GRAVY值分別為－0.089，－0.077，－0.104，這初步說(shuō)明3個(gè)蛋白質(zhì)呈一定的親水性；通過(guò)http://web.expasy.org/protscale/網(wǎng)站，采用 Hphob./Kyte&Doolittle算法進(jìn)一步進(jìn)行親疏水性預(yù)測(cè)，圖1進(jìn)一步認(rèn)證了其均為親水性蛋白質(zhì)。

圖1 UGT蛋白質(zhì)親疏水性預(yù)測(cè)

2.3 UGT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預(yù)測(cè)UGT蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)分析，從表2和圖2中可以看出，各UGT蛋白含有35%～45%左右的α-螺旋及無(wú)規(guī)卷曲，含有15%左右的鏈延伸結(jié)構(gòu)，較少的β-轉(zhuǎn)角。其中，UCT85C2、UCT76G1這2個(gè)蛋白除了含有較相近的β-轉(zhuǎn)角外，其余相似度高。

表2 UGT蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖2 UGT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 UGT蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)SWISS-MODEL預(yù)測(cè)所得序列蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，3條序列均通過(guò)同源建模獲得結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。從圖3中可以看出，3個(gè)UGT蛋白結(jié)構(gòu)均有所差異，推測(cè)可能是基因在進(jìn)化過(guò)程中內(nèi)含子插入或丟失造成的。

2.5 多序列比對(duì)分析

將甜葉菊中3個(gè)UDT基因序列通過(guò)Clustal X2及DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)分析，序列的總體相似度為42.60%.從圖4中可以看出，完全一致的序列占較小部分，序列間總體相似度不高，由此推測(cè)其在進(jìn)化過(guò)程中存在一定的差異。

2.6 分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將甜葉菊（Stevia rebaudian）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、康乃馨（Dianthus caryophyllus）、棉豆（Phaseolus lunatus）和煙草（Nicotiana tabacum L.）中已報(bào)道的UGT基因通過(guò)MEGA 7.0軟件進(jìn)行分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。從圖5中可以看出，各分支自展值均大于80，說(shuō)明建樹(shù)信息可靠。除此之外，對(duì)于同一物種，甜葉菊中的3個(gè)UGT基因進(jìn)化關(guān)系比較遠(yuǎn)；對(duì)于不同物種來(lái)說(shuō)，甜葉菊AY345974基因與康乃馨BAD52007基因具有一定的親緣關(guān)系。總體可以看出，不同物種與同一物種間UGT基因均存在一定的進(jìn)化關(guān)系。

圖3 UGT蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖4 甜葉菊3個(gè)UGT基因序列比對(duì)

圖5 分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

3 討論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)甜葉菊3個(gè)UGT蛋白質(zhì)進(jìn)行了一級(jí)結(jié)構(gòu)親疏水性分析，二級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。在親疏水性方面，甜葉菊中UGT蛋白質(zhì)均為可溶蛋白質(zhì)，呈較強(qiáng)的親水性。

向麗等人用5’-RACE和 RT-PCR方法克隆了1條三七UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因，該基因編碼495個(gè)氨基酸，蛋白分子量為55 kD，屬于不穩(wěn)定蛋白。其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占36.16%，β-轉(zhuǎn)角占11.31%，無(wú)規(guī)卷曲占52.53%，這與本研究中甜葉菊3個(gè)UGT基因二級(jí)的預(yù)測(cè)較為相符[5]。除此之外，郭書(shū)巧等人在甜葉菊中分離出與本研究同源性很高的UGT76G2基因，研究發(fā)現(xiàn)其與玉米、康乃馨、水稻等5種均存在一定的進(jìn)化關(guān)系，但進(jìn)化地位相差較遠(yuǎn)，與本研究的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果較為相符[6]。

UGT基因?yàn)槎嗫截悺⒍嗉易寤?，家族中基因?shù)目比較多，功能不盡相同。近年來(lái)，多種UGT基因被漸漸發(fā)掘，例如李微微等人在甜葉懸鉤子中克隆了18條UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因，在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)，并對(duì)克隆的基因進(jìn)行了初步的序列分析，為進(jìn)一步挖掘和驗(yàn)證甜葉懸鉤子中UGT基因功能奠定了基礎(chǔ)[7]。隨著生命科學(xué)和微機(jī)科學(xué)的迅速發(fā)展，生物信息學(xué)作為一門(mén)獨(dú)立學(xué)科，在發(fā)掘新基因、研究生物大分子功能方面發(fā)揮著重要作用[8]。本研究依托生物信息學(xué)手段，在甜葉菊作物中鑒定3個(gè)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因，并對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)功能的初步研究，為甜葉菊UGT基因的發(fā)掘、提高作物經(jīng)濟(jì)效益方面的研究提供了新的思路。

［1］Brandle，J.E.，P.G.Telmer.Steviol glycoside biosynthesis［J］.Phytochemistry，2007，38（42）：1855.

［2］Brazier-Hicks，M.，R.Edwards.Functional importance of the family 1 glucosyltransferase UGT72B1 in the metabolism of xenobiotics in Arabidopsis thaliana［J］.Plant Journal，2005，42（4）：556-566.

［3］RG Jackson，M Kowalczyk，Y Li，et al.Over-expression of an Arabidopsis gene encoding a glucosyltransferase of indole-3-acetic acid: phenotypic characterisation of transgenic lines［J］.Plant Journal，2002，32（4）：573-583.

［4］J Chong，R Baltz，C Schmitt，et al.Downregulation of a pathogen-responsive tobacco UDP-Glc：phenylpropanoid glucosyltransferase reduces scopoletin glucoside accumulation，enhances oxidative stress，and weakens virus resistance［J］.Plant Cell，2002，14（5）：1093-1107.

［5］向麗，郭溆，牛云云，等.三七PnUGT1基因的全長(zhǎng)cDNA克隆和生物信息學(xué)分析［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47（08）：1085-1091.

［6］郭書(shū)巧，楊郁文，倪萬(wàn)潮.甜葉菊葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT76G2的克隆及生物信息學(xué)分析［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（03）：422-428.

［7］李微微，孫雨偉，楊靖亞，等.甜葉懸鉤子（Rubus suavissimus S.Lee）中UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、表達(dá)及序列分析［J］.工業(yè)微生物，2017，47（04）：1-10.

［8］齊安智.計(jì)算機(jī)算法在生物信息學(xué)中的應(yīng)用研究［J］.中國(guó)新通信，2018，20（02）：171.