柳儼哲，邵麗娟，陳 況，王子政，王 瑨，樊克興，胡明根

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1肝膽外二科；2腫瘤內(nèi)科

胰腺癌是消化系統(tǒng)中最常見的實體腫瘤之一，其惡性程度高、預(yù)后差，整體5年存活率小于8%[1]。中國癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌在我國惡性腫瘤中發(fā)病率位居第9位，死亡率位居第6位[2]。早期區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期血行轉(zhuǎn)移與胰腺癌較差的預(yù)后相關(guān)[3]。手術(shù)根治性切除是目前對于胰腺癌最有效的治療手段，但由于其自身腫瘤生物學(xué)特性，發(fā)病早期缺乏易觀察的癥狀，大多數(shù)患者在確診時已屬于晚期而失去手術(shù)機(jī)會。因此，探索胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找預(yù)后相關(guān)的基因分子對于胰腺癌的整體治療效果具有重要的臨床意義。生長分化因子11(growth differentiation factor 11，GDF11)，也稱為骨形態(tài)發(fā)生蛋白11(bone morphogenetic protein 11，BMP11)，是轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β)和 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)亞家族中的一員[4]。最初研究發(fā)現(xiàn)GDF11可通過上游及下游組件調(diào)控多個發(fā)展過程影響肌肉生成，與肌肉生長抑制素(GDF8)共同調(diào)節(jié)肌肉生長[5-6]。近期的研究表明GDF11還具有抗衰老的功能，主要表現(xiàn)為逆轉(zhuǎn)心肌衰老[7]、改善大腦血供與認(rèn)知能力[8]、改善衰老骨骼肌功能[9]。BMP家族被認(rèn)為是一系列可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及分化的分子[10-12]，與食管癌[13]、前列腺癌[14]、乳腺癌[15]等惡性腫瘤的生物學(xué)行為相關(guān)，但GDF11在胰腺癌中的相關(guān)研究尚缺乏。因此，本研究通過檢測胰腺癌中GDF11的表達(dá)水平，并結(jié)合臨床資料分析GDF11與胰腺癌臨床病理的關(guān)系，探討其在預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后中的作用。

資料和方法

1 資料 收集解放軍總醫(yī)院肝膽外二科2016年12月- 2017年3月胰腺癌術(shù)后的28例患者及胰腺癌組織芯片(上海芯超生物科技有限公司)中63例患者的病例資料，包括年齡、性別、腫瘤分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤、T分期和N分期。資料中所有胰腺癌患者術(shù)前均未接受放化療。28例胰腺癌患者的癌組織和癌旁組織標(biāo)本(距胰腺癌病灶邊緣2 ～ 5 cm)在采集后均進(jìn)行新鮮冷凍組織的保存以及石蠟包埋組織的制作。其中新鮮組織立即置于液氮冷凍，并保存于-80℃冰箱中。組織芯片中的胰腺癌標(biāo)本均有配對的癌組織和癌旁組織。本實驗經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并得到每一位患者的知情同意。

2 總RNA提取和實時定量PCR檢測GDF11 采用Ultrapure RNAKit試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，按試劑盒說明書提取胰腺癌患者冷凍組織總RNA。提取后置于NanoDrop 1000 Spectrophotometer進(jìn)行RNA濃度的測定，A260/A280比值為 1.8 ～ 2.0。使用 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實時定量PCR按照Trans Start Top Green qPCR Super Mix試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明書在ABI7500實時定量PCR儀進(jìn)行實驗。GDF11引物序列為：上游5'-GATCTTGAGCAAA CTGCGGC-3'，下游5'-TGAAGTCGATGCTCTGCCA A-3'；內(nèi)參PPIA的引物序列為：上游5'-TCATCTG CACTGCCAAGACTG-3，下游5'-CATGCCTTCTTTC ACTTTGCC-3'。每個樣品均行3次重復(fù)，應(yīng)用2-△△Ct法進(jìn)行mRNA的相對定量。

3 免疫組化 將組織切片脫蠟后依次浸泡于二甲苯、梯度乙醇中進(jìn)行水化，隨后于高壓鍋內(nèi)的枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)中進(jìn)行抗原修復(fù)，再將切片放入3% H2O2靜置15 min滅活內(nèi)源性過氧化氫酶，滴加山羊血清封閉液室溫靜置30 min進(jìn)行封閉，滴加GDF11一抗(1∶500稀釋的兔抗人抗體，美國ABcam公司)4℃下過夜，再加入二抗(即用型兔鼠通用二抗，上?；蚩萍脊?常溫靜置30 min，滴加DAB顯色液后以蘇木素襯染，最后以梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片保存。在每一步操作后均以ddH2O和PBS洗凈殘液。GDF11免疫組化的染色結(jié)果由2名病理科醫(yī)師采用二級計分法進(jìn)行定量分析。細(xì)胞著色程度：0分，無著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，黃褐色。陽性細(xì)胞數(shù)量按照百分比計數(shù)(0 ～ 100%)。表達(dá)評分為細(xì)胞著色程度分與陽性細(xì)胞百分比的乘積(0 ～ 3分)，總分值大于1分定義為高表達(dá)。

4 研究指標(biāo) 1)檢測28對胰腺癌組織及配對癌旁組織中GDF11的mRNA水平；2)將91對(自取的28對與組織芯片的63對)胰腺癌及配對癌旁組織的蠟塊標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，以檢測GDF11蛋白的表達(dá)情況；3)分析GDF11的表達(dá)與91例胰腺癌患者臨床病理資料之間的關(guān)系。

5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以-x±s表示，采用配對t檢驗進(jìn)行組間比較；計數(shù)資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗進(jìn)行組間比較分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 GDF11在胰腺癌及配對癌旁組織中mRNA的表達(dá) 應(yīng)用實時定量PCR方法對28對胰腺癌組織及配對癌旁組織的mRNA進(jìn)行檢測。如圖1所示，癌旁組織GDF11 mRNA表達(dá)水平顯著性高于腫瘤組織(P=0.003)。

2 GDF11在胰腺癌及配對癌旁組織中蛋白的表達(dá)應(yīng)用免疫組化技術(shù)對91對胰腺癌組織及配對癌旁組織標(biāo)本的蛋白進(jìn)行檢測(圖2)。GDF11在癌中和癌旁中的高表達(dá)率分別為40.7%(37/91)和71.4%(65/91)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=17.486，P＜0.001)。見圖 3。

3 GDF11的蛋白表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系GDF11蛋白高表達(dá)的胰腺癌患者神經(jīng)浸潤較少(P=0.004)、T分期較低(P=0.003)、N分期較低(P=0.018)，性別(P=0.093)、年齡(P=0.648)、組織學(xué)分級(P=0.552)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與否(P=0.090)與GDF11的表達(dá)無關(guān)。見表1。

表1 GDF11的蛋白表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Tab. 1 Relationship between GDF11 expression and clinicopathologic parameters (n=91)

圖 1 GDF11在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(mRNA水平)Fig. 1 mRNA expressions of GDF11 in pancreatic cancer tissues and corresponding paracarcinoma tissues

圖 3 GDF11在胰腺癌及癌旁組織中的蛋白表達(dá)情況(n=91)Fig. 3 GDF11 protein expressions in pancreatic cancer tissues and paired paracarcinoma tissues (n=91)

討 論

胰腺癌是一種復(fù)雜的異源性疾病，其發(fā)病涉及多種基因的缺失、擴(kuò)增以及變異[16]。它的惡性程度極高，5年整體生存率僅為5%。胰腺癌的已知危險因素包括吸煙、2型糖尿病、肥胖、飲酒以及慢性胰腺炎等[3]。在疾病的早期階段，胰腺癌無明顯特異性癥狀，這使得早期診斷及治療十分困難。胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程涉及特定通路上一系列基因的改變，然而目前缺乏有效的預(yù)后相關(guān)分子[3]。

早期研究發(fā)現(xiàn)，GDF11參與調(diào)控哺乳動物神經(jīng)元的產(chǎn)生、腎結(jié)構(gòu)的形成、胰腺的發(fā)育等[17-19]。與TGF-β超家族的其他成員一樣，GDF11與膜表面的絲氨酸/蘇氨酸受體結(jié)合后，參與下游基因的表達(dá)調(diào)控[20]。近年來，GDF11因“抗衰老”功能得到了廣泛關(guān)注。2013年，Loffredo等[7]首先發(fā)現(xiàn)通過向高齡小鼠注射GDF11，衰老心肌出現(xiàn)了向年輕態(tài)的轉(zhuǎn)變。GDF11同樣被證實可以逆轉(zhuǎn)年老小鼠骨骼肌的衰老[9]。2014年，Katsimpardi等[8]發(fā)現(xiàn)GDF11還能有效地改善高齡小鼠的神經(jīng)認(rèn)知功能。然而目前關(guān)于GDF11與腫瘤關(guān)系的研究尚缺乏。

圖 2 GDF11在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(蛋白水平)A：GDF11高表達(dá)于胰腺癌組織； B：GDF11低表達(dá)于胰腺癌組織； C：GDF11高表達(dá)于胰腺癌旁組織； D：GDF11高表達(dá)于胰腺癌旁組織(放大)Fig. 2 Protein expressions of GDF11 in pancreatic cancer tissues and paracarcinoma tissues A: High expression of GDF11 in pancreatic cancer tissues; B: Low expression of GDF11 in pancreatic cancer tissues; C: High expression of GDF11 in pancreatic paracarcinoma tissues; D: High expression of GDF11 in pancreatic paracarcinoma tissues (magnif i cation)

TGF-β超家族在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有雙重作用。TGF-β通路可促進(jìn)晚期癌癥細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，而對于早期癌癥細(xì)胞以及正常細(xì)胞該通路起著腫瘤抑制作用[21-23]。在結(jié)直腸癌中，GDF11的表達(dá)水平上調(diào)，并且高表達(dá)的GDF11還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較差的預(yù)后相關(guān)[24]。也有研究報道GDF11在三陰性乳腺癌中起著腫瘤抑制作用[25]。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)可以激活GDF11的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。最近的研究證明，GDF11在肝癌中的mRNA和蛋白表達(dá)量是下調(diào)的，并且通過Smad2/3信號通路起到抑癌作用[27]。因此，GDF11作為TGF-β超家族中的一員也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

本研究從mRNA以及蛋白水平上檢測了胰腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織中GDF11的表達(dá)情況，結(jié)果表明GDF11在胰腺癌中的表達(dá)量是下調(diào)的，并且GDF11表達(dá)量越高，神經(jīng)浸潤的發(fā)生率(P=0.004)、T分期(P=0.003)和N分期(P=0.018)越低。盡管GDF11高表達(dá)組的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率低于GDF11低表達(dá)組，但此差異并不顯著，可能與樣本量較少、手術(shù)適應(yīng)證的選擇相關(guān)。在過去的研究中，Wang等[28]發(fā)現(xiàn)與GDF11同家族的BMP2可以抑制腎癌細(xì)胞的增殖作用并誘導(dǎo)骨質(zhì)骨形成。Bokobza等[29]發(fā)現(xiàn)GDF9因子通過使腫瘤細(xì)胞免受Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長增殖。GDF11在胰腺癌中表現(xiàn)腫瘤抑制作用，其有可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究是一個回顧性研究，病例數(shù)有限，因此需要更大數(shù)量的樣本量去驗證，以及進(jìn)一步的研究明確GDF11在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。

綜上所述，GDF11在胰腺癌中的表達(dá)是降低的，并且GDF11的高表達(dá)與胰腺癌患者較好的預(yù)后相關(guān)，其在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到抑癌基因的作用。因此GDF11可能成為胰腺癌的預(yù)后預(yù)測因子，關(guān)于GDF11在胰腺癌中的抑癌機(jī)制，我們將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探討。

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