吳燁婷,黃慧娜,施寶珠,劉 琪,侯盼盼,段旭昌

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊陵 712100)

自由基是生物體氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的對機體有害的一類化合物,具有強氧化性,可損害機體組織和細(xì)胞,促進(jìn)機體衰老,引起機體產(chǎn)生慢性疾病[1]。研究表明雞蛋中的蛋白多肽負(fù)離子能夠消減人體自由基,減緩人體衰老,增強人體免疫力[2]。

蛋清是一種天然蛋白,其功能被認(rèn)為與人血血漿蛋白相似,蛋清中的卵白蛋白[3]、溶菌酶[4]等具有天然抗氧化活性,蛋清經(jīng)酶水解可明顯提高蛋清的抗氧化活性,水解的多肽產(chǎn)物具有清除多種自由基能力,產(chǎn)生抗氧化性[5]、抑菌性[6-8]、抗腫瘤等多種活性功能[9-12]。

為了提高雞蛋附加值,開拓蛋品資源加工新途徑,雞蛋多肽的研究已成為蛋品加工的一大熱點。蛋清多采用酶解法來制備蛋清多肽,制備的蛋清多肽分子質(zhì)量小,益于消化吸收[13-14],并具有多種保健功能。酶解法較酸、堿水解法不僅水解效率高,而且條件溫和,可較好的保留蛋清的營養(yǎng)成分[15],且水解程度易于控制,能較好的得到人們所需的水解多肽。

但目前關(guān)于蛋白的人工控制定向水解以獲得人們所需的功能多肽的研究尚處于起步階段,有許多問題需要探索。本研究以全蛋清為試材,采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶,通過控制蛋白的水解條件從而控制蛋白水解程度,以DPPH自由基清除率為指標(biāo),建立蛋清蛋白水解程度與抗氧化之間的控制關(guān)系,研究了蛋清抗氧化肽的制備方法,以獲取最強和最大量的蛋清抗氧化肽的制備控制條件,并探討了所制備的蛋清抗氧化肽的體外清除自由基能力和抗氧化活性,以期為雞蛋功能性產(chǎn)品開發(fā)提供一定的技術(shù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮雞蛋 格潤牧業(yè)發(fā)展有限公司提供;堿性蛋白酶(酶活為170000 U/g)、胰蛋白酶(酶活為250000 U/g) 美國AMRESCO公司;中性蛋白酶(酶活為60000 U/g) 北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 東京化成工業(yè)株式會社;預(yù)染蛋白Marker#26617 上海新睿生物科技有限公司。

UV-2550型紫外可見分光光度計 日本島津公司;HH-4恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;HC-3018高速離心機 廣州越特科學(xué)儀器有限公司;DYCZ-24雙垂直電泳儀 北京六一生物科技有限公司;LGJ-100型冷凍干燥機 北京四環(huán)儀器公司;電子分析天平 上海天平儀器廠;SEM6360LV掃描電鏡 日本電子株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 鮮雞蛋→分離→蛋清→調(diào)整蛋清濃度→熱變性→調(diào)pH→加酶→恒溫酶解→滅酶→離心→酶解上清液→濃縮→冷凍干燥

1.2.2 操作要點 將蛋清液的蛋白濃度調(diào)整至所需濃度,經(jīng)85 ℃加熱10 min使蛋清蛋白變性,然后冷卻至所需溫度,用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液調(diào)整溶液pH至各蛋白酶的最適pH,加入一定量蛋白酶恒溫攪拌控制酶解,酶解完成后將酶解液95 ℃滅酶10 min,冷卻至室溫,于5000 r/min離心10 min,上清液即為蛋清蛋白酶水解多肽制備液,經(jīng)40 ℃真空濃縮,-80 ℃冷凍干燥24 h即得蛋清多肽制品。

1.2.3 酶的選擇方法 以3%(m/V)蛋白濃度的蛋清液為底物溶液,分別采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶,在酶用量均為12000 U/g蛋白條件下,分別在各酶最適工作條件下進(jìn)行酶解1、2、3、4、5、6、7 h,以各酶酶解上清液水解度和清除DPPH自由基能力為考察指標(biāo),以清除DPPH自由基能力最高者篩選蛋清多肽制備的最佳水解酶。各酶對蛋清的水解進(jìn)程和水解效果采用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行追蹤。其中堿性蛋白酶工作條件是pH9.0,溫度45 ℃;中性蛋白酶工作條件是pH7.0,溫度40 ℃;胰蛋白酶工作條件是pH7.8,溫度37 ℃。

1.2.4 蛋清多肽制備工藝優(yōu)化方法

1.2.4.1 單因素實驗 取一定體積的蛋白底物濃度為3 g/100 mL(m/V)的蛋清液,分別用12000、14000、16000、18000、20000 U/g蛋白的堿性蛋白酶,在pH9.0,45 ℃,水解7 h,考察酶用量對水解液清除DPPH自由基能力的影響,以清除能力最強者優(yōu)選酶用量;以酶用量為18000 U/g蛋白,在pH9.0、溫度45 ℃,分別以蛋清蛋白底物濃度為2、2.5、3、4、5 g/100 mL(m/V)進(jìn)行水解7 h,以考察蛋白底物濃度對水解液清除DPPH自由基能力的影響,以清除能力最強者優(yōu)選蛋清蛋白底物濃度;以酶用量為18000 U/g蛋白、蛋白底物濃度為3 g/100 mL,在45 ℃,分別在pH8、9、10、11、12條件下水解7 h,以考察水解pH對水解上清液清除DPPH自由基能力的影響,以清除能力最強者優(yōu)選水解pH;以酶用量為18000 U/g蛋白、底物濃度為3 g/100 mL,調(diào)pH9.0,分別在35、45、55、65、75 ℃水解7 h,以考察水解溫度對水解上清液清除DPPH自由基能力的影響,以清除能力最強者優(yōu)選水解溫度。

1.2.4.2 正交實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用L9(34)正交表進(jìn)行正交實驗,其因素水平如表1所示。以水解上清液對DPPH自由基清除率為衡量指標(biāo),以清除率最高者確定蛋清酶解多肽制備的工藝條件。

1.2.5 蛋清酶解多肽體外抗氧化實驗 以VC作為對照,以蛋清凍干粉、制備蛋清多肽粉為實驗材料,分別配制成2、4、6、8、10 mg/mL溶液,測定各溶液對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基的清除能力及Fe3+還原能力,分析蛋清多肽體外清除自由基的能力。

1.2.6 檢測方法

1.2.6.1 蛋白水解度測定方法 參照文獻(xiàn)[16]的茚三酮比色法。取0.5 mL水解蛋白液稀釋至50 mL,量取0.4 mL于試管中,同時加入1.6 mL蒸餾水和1 mL顯色劑,混勻后置于沸水浴中加熱15 min,顯色結(jié)束后冷水冷卻,再加入5 mL 40%乙醇溶液混勻后放置15 min,然后于570 nm處測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.03816x-0.01081，R2=0.998)計算出蛋白水解液中-NH2基的含量(mmol/L)。根據(jù)下式計算出水解度:

水解度(%)=[(水解后-NH2-水解前-NH2)/(6.25N×htot)]×100

式中:6.25 N為水解底物蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(g/L);htot為每克蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù),mmol/g,本研究中htot=9.1438。

1.2.6.2 電泳分析 參照曹健[17]的方法進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)蛋白加樣量3 μL,待測樣品加樣量20 μL。先在15 mA左右的電流下電泳,待樣品進(jìn)入分離膠后,再將電流調(diào)整至80 V左右,直至溴酚藍(lán)指示帶接近膠底1 cm時,停止電泳。小心將凝膠取下,置于染色容器中染色2 h,即可脫色,待條帶清晰后于凝膠成像系統(tǒng)上記錄實驗結(jié)果。

1.2.6.3 蛋清水解效果觀測方法 將蛋清凍干粉、蛋清多肽凍干粉及蛋清水解沉淀物凍干粉,用導(dǎo)電雙面膠固定在掃描電子顯微鏡載物臺上,用洗耳球吹去粘結(jié)不牢的粉末,在真空噴金機上噴金后,用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)并拍照,比較酶解前后蛋清蛋白結(jié)構(gòu)變化情況。

1.2.6.4 DPPH自由基清除能力測定方法 參照Shahidi F[18]的方法。取2 mL樣品溶液及2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液(現(xiàn)配)于試管中,混勻后室溫避光放置30 min,于517 nm波長下測定吸光值。以VC為對照,平行測定3次,清除率按下式計算:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A0為蒸餾水代替樣品的空白吸光值;A1為樣品的吸光值;A2為無水乙醇代替DPPH溶液的對照吸光值。

1.2.6.5 超氧陰離子清除能力測定方法 參照樸美子[19]的方法進(jìn)行。取4.5 mL pH8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中,25 ℃溫浴20 min,加入1 mL樣品溶液和0.5 mL 4.5 mmol/L鄰苯三酚溶液,混勻,25 ℃保溫6 min,加入兩滴8 mol/L HCl終止反應(yīng),于320 nm波長下測定吸光值。以VC為對照,平行測定3次,清除率按下式計算:

超氧陰離子清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A0為蒸餾水代替樣品溶液的空白吸光值;A1為樣品的吸光值;A2為含樣液不含鄰苯三酚的對照吸光值。

1.2.6.6 羥自由基清除能力測定方法 參照Tsai Shu-Yao[20]的方法。在試管中先后加入1 mL 6.0 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 6.0 mmol/L水楊酸溶液、1 mL樣品溶液,然后加入1 mL 6.0 mmol/L的H2O2溶液啟動反應(yīng),37 ℃水浴30 min后,于510 nm波長下測定吸光值。以VC為對照,平行測定3次。

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A0為蒸餾水代替樣品的空白組吸光值;A1為樣品的吸光值;A2為蒸餾水代替H2O2溶液的對照組吸光值。

1.2.6.7 還原能力測定方法 參照GowChin Yen[21]的方法進(jìn)行。在試管中加入1 mL樣品溶液和2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.6),再加入2.5 mL 10 mg/mL的鐵氰化鉀,混勻后在50 ℃保溫20 min,加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,3000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL H2O和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,混勻后于700 nm波長下測定吸光值。以VC為對照,平行測定3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋清多肽水解酶選擇實驗

2.1.1 不同酶對蛋清水解產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響 由圖1可知,在相同蛋白底物濃度和水解時間情況下,不同蛋白酶在各自最適工作條件下,水解的蛋清多肽液對DPPH自由基清除率高低依次為堿性蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶;堿性蛋白酶水解液的DPPH自由基清除率隨水解時間延長明顯增加,在水解7 h達(dá)到最大值;而胰蛋白酶水解液的DPPH自由基清除率隨水解時間延長雖也有所增加,但增加速度遠(yuǎn)低于堿性蛋白酶;中性蛋白酶水解液的DPPH自由基清除率隨水解時間延長先增大后減小,在水解4 h時達(dá)到最大值,其最大值與堿性蛋白酶水解4 h的清除率相當(dāng),但卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于堿性蛋白酶水解7 h的清除率;三種蛋白酶比較,堿性蛋白酶水解液的DPPH自由基清除率最高,其次是中性蛋白酶,胰蛋白酶最差。因此堿性蛋白酶是獲得清除自由基最好的蛋清多肽水解酶,其7 h的蛋清水解液的DPPH自由基清除率最高達(dá)52.17%。

圖1 三種蛋白酶水解蛋清蛋白液的 DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging activity of three different protease hydrolysates of the EWP

2.1.2 不同酶對蛋清蛋白水解度的影響 由圖2可知,在相同蛋白底物濃度和酶用量情況下,蛋白的水解度均隨水解時間的延長而增加,但三種蛋白酶的水解度增加趨勢不同,堿性蛋白酶水解蛋清蛋白的水解度隨水解時間的延長增加最快,其次是中性蛋白酶,胰蛋白酶增加最慢,說明三種蛋白酶水解蛋清蛋白能力為堿性蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶,這也說明堿性蛋白酶水解蛋清蛋白最快,最徹底。

圖2 三種蛋白酶水解蛋清蛋白的水解度Fig.2 The degree of hydrolysis(DH)of the EWP hydrolyzed by three different protease

2.1.3 電泳結(jié)果分析 蛋清蛋白是由卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白,卵類粘蛋白、溶菌酶、卵球蛋白,卵巨球蛋白,卵糖蛋白、卵抑制劑、抗生物素蛋白、胱抑素等多種蛋白質(zhì)所組成,其中前5種蛋白占蛋清蛋白組成的87%[22]。由圖3可知,蛋清中的5種蛋白條帶分離很明顯。據(jù)文獻(xiàn)[22-23]可知這五種蛋白質(zhì)從分子量大小依次排序是:卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(12%,MW 76 kDa),卵粘蛋白(3.5%,MW 55-83 kDa)、卵白蛋白(54%,MW 45 kDa)、卵類粘蛋白(11%,MW 28 kDa)、溶菌酶(3.4%,MW 14.3 kDa)。從水解的電泳圖分析可知,分子量大的蛋白質(zhì)很快就被酶解,蛋白條帶明顯變淺,分子量小的蛋白質(zhì)酶解較慢,蛋白條帶隨水解時間的延長慢慢變淺,隨著水解時間的延長,低于15 kDa以下部分逐步出現(xiàn)黑色條帶,并且不斷加深,說明蛋清中的蛋白經(jīng)酶解后分子量低于15 kDa,形成了多肽物質(zhì)。

由圖3A可看出,隨水解時間延長,經(jīng)堿性蛋白酶水解蛋清的各蛋白條帶明顯變淺,而且在水解7 h蛋清中的各蛋白條帶幾乎完全消失,說明此時蛋清中原有蛋白質(zhì)被完全降解,可見堿性蛋白酶對蛋清蛋白的水解效果較好,而且水解后在低于15 kDa處出現(xiàn)了非常深的蛋白質(zhì)條帶,說明蛋清蛋白被堿性蛋白酶水解后的蛋白質(zhì)分子量均低于15 kDa,屬于多肽分子水平。

由圖3B可知,隨水解時間的延長,胰蛋白酶水解蛋清液的蛋白質(zhì)條帶顏色也逐漸變淺,但變淺的程度明顯不如堿性蛋白酶水解液變淺的程度,而且分子量25～40 kDa的蛋白條帶變淺程度不明顯,說明胰蛋白酶對蛋清中分子量在25～40 kDa的蛋白質(zhì)水解效果不佳。而且水解后蛋白的分子量均在15 kDa左右,范圍變化不大。胰蛋白酶對蛋清蛋白的水解效果較差,可能是因為蛋清蛋白中含有胰蛋白酶抑制劑卵類粘蛋白等所致[24]。

由圖3C可知,隨水解時間的延長,中性蛋白酶水解蛋清液的各蛋白條帶顏色也不同程度的逐步變淺,但變淺的程度遠(yuǎn)不如堿性蛋白酶水解液變淺的程度,而且中性蛋白酶水解到7 h,蛋清中的各蛋白條帶還顯示明顯,說明中性蛋白酶對蛋清各蛋白的水解速度和水解程度各不相同,水解7 h后,蛋清中各蛋白質(zhì)還水解不完全。

圖3 三種蛋白酶水解蛋清蛋白液的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 Electrophoregram of three different protease hydrolysates of the EWP注:M為Marker,0,1,2,3,4,5,6,7分別為 蛋清蛋白在0,1,2,3,4,5,6,7 h的水解液。

三種酶解電泳圖的綜合比較分析可知,堿性蛋白酶對蛋清中蛋白質(zhì)水解最徹底,因為堿性蛋白酶在水解7 h的水解液中已檢測不到蛋清中原有的蛋白質(zhì),而胰蛋白酶和中性蛋白酶的7 h水解液中還明顯存在蛋清中原有蛋白條帶。電泳結(jié)果與水解度實驗結(jié)果相一致,說明堿性蛋白酶是蛋清的最適水解酶。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白及大分量的蛋白質(zhì)的氨基酸組成中疏水性氨基酸較多,而堿性蛋白酶和中性蛋白酶[25]水解蛋白時主要作用的是疏水性氨基酸的肽鍵,所以大分量的蛋白質(zhì)很快首先被水解,水解后這些蛋白的電泳條帶迅速變淺。黃群等人[26]采用堿性蛋白酶對卵白蛋白進(jìn)行改性處理發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶能迅速降解卵白蛋白,有效改善卵白蛋白的起泡性,這也證明堿性蛋白酶能較好地水解蛋清蛋白。從以上分析,堿性蛋白酶是制備蛋清多肽的最適水解酶。

2.2 水解工藝條件優(yōu)化實驗結(jié)果分析

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 酶用量對蛋清水解物清除DPPH自由基的影響 由圖4可知,隨著酶用量的增大,蛋清水解物對DPPH自由基清除率逐漸增大,酶用量在12000～18000 U/g之間的水解液DPPH自由基清除率增加較快,超過18000 U/g時,蛋清水解液的DPPH自由基清除率幾乎不再變化,因此選擇酶用量為18000 U/g作為優(yōu)化酶解條件的酶用量中心實驗點為宜。

圖4 酶用量對蛋清水解物DPPH自由基清除率的影響Fig.4 The effect of enzyme dosage on the DPPH radical scavenging activity of the EWP antioxidant peptides

2.2.1.2 蛋白底物濃度對蛋清水解物清除DPPH自由基的影響 由圖5可知,隨著底物濃度的增大,蛋清水解物對DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先增大后減小又逐漸趨于平穩(wěn)的趨勢,說明在實驗范圍內(nèi),較低蛋白底物濃度水解液清除DPPH自由基能力較強。在蛋白底物濃度為3 g/100 mL時,蛋清水解物對DPPH自由基清除率達(dá)到最大。因此選擇3 g/100 mL為優(yōu)化酶解條件的蛋白底物濃度中心實驗點為宜。

圖5 蛋白底物濃度對蛋清水解物 DPPH自由基清除率的影響Fig.5 The effect of substrate concentration on the DPPH radical scavenging activity of the EWP antioxidant peptides

2.2.1.3 pH對蛋清水解物清除DPPH自由基的影響 由圖6可知,隨著水解pH的不斷增大,當(dāng)水解pH>9時,蛋清水解物對DPPH自由基清除率極速降低,在pH為9時,蛋清水解物對DPPH自由基清除率最高,因此在優(yōu)化酶解條件時pH選擇為9.0固定值。

圖6 pH對蛋清水解物DPPH自由基清除能力的影響Fig.6 The effect of pH on the DPPH radical scavenging activity of the EWP antioxidant peptides

2.2.1.4 水解溫度對蛋清水解物清除DPPH自由基的影響 由圖7可知,隨著水解溫度的升高,蛋清水解物對DPPH自由基清除率先增加后降低,在65 ℃時,蛋清水解物對DPPH自由基清除率達(dá)到最大。而當(dāng)酶解溫度大于65 ℃之后,堿性蛋白酶變性失活,蛋清水解物對DPPH自由基清除率反而下降。故確定65 ℃為優(yōu)化酶解條件的溫度中心實驗點。

圖7 水解溫度對蛋清水解物DPPH自由基清除能力的影響Fig.7 The effect of temperature on the DPPH radical scavenging activity of the EWP antioxidant peptides

2.2.2 正交實驗 堿性蛋白酶水解物的制備工藝條件優(yōu)化實驗結(jié)果見表2和表3。由表2可知,影響蛋清水解物對DPPH自由基清除率的因素依次為蛋白底物濃度>酶用量>水解溫度,由表3方差分析結(jié)果可知,底物濃度、酶用量對水解物的DPPH自由基清除率影響顯著(p<0.05),水解溫度對水解物的DPPH自由基清除率影響不顯著(p>0.05)。經(jīng)極差分析得出獲得最大DPPH自由基清除率水解物的水解組合條件為A3B2C3(M#)。為驗證優(yōu)選實驗結(jié)果的可靠性,將M#與正交實驗表中的最大值8號實驗進(jìn)行了重復(fù)對比實驗,發(fā)現(xiàn)M#的DPPH自由基清除率為68.72%,與8號實驗結(jié)果差異不大。為節(jié)省能量消耗,最終選擇最優(yōu)水解條件為蛋白底物濃度4 g/100 mL,調(diào)整蛋清液pH9.0,添加18000 U/g蛋白的堿性蛋白酶,在60 ℃水解7 h,此時制備的蛋清蛋白酶水解物的DPPH自由基清除率最高,達(dá)到68.37%,高于王君虹等[27]在水解溫度48.5 ℃,木瓜蛋白酶酶用量2.85%,酶解時間4.33 h的條件下制得的鴨蛋清肽的DPPH自由基清除率的17.49%。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

2.2.3 微觀結(jié)構(gòu)分析 圖8是蛋清凍干粉、蛋清堿性蛋白酶水解物凍干粉、蛋清堿性蛋白酶水解沉淀物凍干粉分別在500,2500,5000倍下的微結(jié)構(gòu)電鏡觀測結(jié)果。由圖8可知,蛋清凍干粉呈不規(guī)則的片狀或者塊狀晶體結(jié)構(gòu),晶體表面光滑。而蛋清的堿性蛋白酶水解物的凍干粉顆粒表面呈現(xiàn)不規(guī)則蜂窩形多孔結(jié)構(gòu),多孔中鑲嵌著不規(guī)則的細(xì)小晶體顆粒,顯示出更大的表面積。而蛋清的堿性蛋白酶水解沉淀物的凍干顆粒呈不規(guī)則的松散棉絮狀,這可能是蛋清蛋白被堿性蛋白酶水解后釋放了部分氨基酸或空間結(jié)構(gòu),一部分小分子溶于水,而一部分大分子失去親水結(jié)構(gòu)后產(chǎn)生沉淀,說明蛋清蛋白被堿性蛋白酶水解后分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化。

2.3 體外清除自由基實驗結(jié)果分析

2.3.1 超氧陰離子清除率實驗結(jié)果 由圖9可知,蛋清水解物對超氧陰離子的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而增大,且在2～6 mg/mL范圍內(nèi)基本呈線性關(guān)系,超過6 mg/mL后,超氧陰離子的清除率隨濃度的增加趨于穩(wěn)定;而蛋清有較弱的超氧陰離子清除能力,且隨著蛋清質(zhì)量濃度的增大清除率反而降低。與VC相比,蛋清水解物的超氧陰離子清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VC,但卻明顯高于蛋清,說明蛋清經(jīng)堿性蛋白酶水解后清除超氧陰離子的能力明顯增強。

圖9 蛋清蛋白酶水解物清除超氧陰離子實驗結(jié)果Fig.9 The scavenging of the EWP antioxidant peptides on superoxide anion radical

2.3.2 羥自由基清除率實驗結(jié)果 由圖10可知,蛋清本身就有一定的羥自由基清除能力,但隨質(zhì)量濃度的增加先是保持不變,然后呈非線性增強。而蛋清水解物隨濃度的增加呈線性增強。在較低濃度時,蛋清清除羥自由基能力優(yōu)于蛋清水解物,但當(dāng)濃度增大時,相同質(zhì)量濃度的蛋清水解物清除羥自由基能力明顯大于蛋清。通過擬合得到蛋清水解物濃度、VC濃度與羥基自由基清除率之間的關(guān)系方程分別為y=239.41x+0.792(R2=0.9899)和y=7.91587x-7.90394(R2=0.99085)。通過計算可知VC對羥自由基的半抑制濃度為0.2055 mg/mL,蛋清水解物的半抑制濃度為5.104 mg/mL,蛋清的半抑制濃度范圍為8～10 mg/mL,說明蛋清水解物清除羥自由基的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于VC,但卻明顯大于蛋清。說明蛋清經(jīng)堿性蛋白酶水解后清除羥自由基的能力明顯增強。

圖10 蛋清蛋白酶水解物清除羥自由基實驗結(jié)果Fig.10 The scavenging of the EWP antioxidant peptides on hydroxyl radical

2.3.3 DPPH自由基清除率實驗結(jié)果 由圖11可知,蛋清水解物和VC清除DPPH自由基的能力均隨著質(zhì)量濃度的增大而增大,且呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,而蛋清的清除DPPH自由基能力較弱,且隨質(zhì)量濃度增加而減小。通過擬合得到蛋清水解物和VC質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率的關(guān)系方程分別為y=6.34659x-8.68419(R2=0.98387)和y=79.05048x+46.46714(R2=0.99766)。通過計算,蛋清水解物對DPPH自由基的半抑制濃度為9.41 mg/mL,VC的半抑制濃度為0.045 mg/mL,蛋清水解物的半抑制濃度遠(yuǎn)大于VC,說明蛋清水解物清除DPPH自由基的能力遠(yuǎn)不如VC,但卻明顯的強于蛋清。說明蛋清經(jīng)堿性蛋白酶水解后清除DPPH自由基能力得到明顯提高。

圖11 蛋清蛋白酶水解物清除DPPH自由基實驗結(jié)果Fig.11 The scavenging of the EWP antioxidant peptides on DPPH radical

2.3.4 Fe3+還原能力實驗結(jié)果 Fe3+還原能力能證明物質(zhì)的抗氧化性,間接證明其清除自由基能力。由圖12可知,蛋清水解物和VC對Fe3+還原能力均隨著質(zhì)量濃度的增大而增大,且呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,而蛋清對Fe3+還原能力較弱,且隨質(zhì)量濃度的增大幾乎保持不變。通過擬合得到蛋清水解物和VC質(zhì)量濃度與Fe3+還原能力的關(guān)系方程式分別為y=0.03734x-0.0224(R2=0.97816)和y=4.10727x+0.03311(R2=0.99501)。通過方程計算,蛋清水解物的Fe3+還原能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VC。但在相同質(zhì)量濃度時,蛋清水解物的Fe3+還原能力明顯優(yōu)于蛋清,所以說明堿性蛋白酶水解蛋清可以提高蛋清的Fe3+還原能力,提高血紅素的載氧量。

圖12 蛋清蛋白酶水解物對Fe3+還原能力實驗結(jié)果Fig.12 Reducing capacity of the EWP antioxidant peptides

通過以上分析,可知蛋清經(jīng)堿性蛋白酶水解后其清除各種自由基的能力都得到了明顯提高,說明蛋清經(jīng)堿性蛋白酶水解可大大提高其保健性能。

3 結(jié)論

采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶,通過對比實驗、電泳實驗發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶是制備蛋清抗氧化肽最佳水解酶。酶用量和蛋白底物濃度對蛋清水解物的DPPH自由基清除率有顯著影響(p<0.05)。堿性蛋白酶制備蛋清水解物的酶解條件優(yōu)化正交實驗結(jié)果表明制備蛋清抗氧化肽的最佳工藝條件是蛋清蛋白濃度在4 g/100 mL下用18000 U/g蛋白的堿性蛋白酶在pH9.0于60 ℃水解7 h,制備的蛋清多肽對DPPH自由基清除率最高,達(dá)到68.37%。

蛋清堿性蛋白酶水解多肽超微結(jié)構(gòu)的電鏡掃描圖顯示其具有明顯的蜂窩狀結(jié)構(gòu),且內(nèi)部嵌有細(xì)小顆粒,具有較大表面積,這種特殊結(jié)構(gòu)展示了其與蛋清蛋白超微結(jié)構(gòu)的明顯不同,使蛋清堿性蛋白酶水解多肽表現(xiàn)出與蛋清不同的物理化學(xué)特性。

通過體外抗氧化實驗表明蛋清蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解所得的多肽體外清除DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基及對Fe3+還原能力明顯高于蛋清蛋白,說明蛋清蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解能明顯增強其清除自由基能力,有效提高其保健性能。

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