黃貝，李龍寶，吳信潔，何周，陳子怡，姚芳，楊華,*，宛曉春*

（1安徽農(nóng)業(yè)大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽合肥 230036；2 安徽農(nóng)業(yè)大學理學院應用化學系，安徽合肥 230036）

油茶（Camellia oleiferaAbel.）和茶樹（Camellia sinensisL.）同屬于山茶科山茶屬。油茶是我國特有的木本油料物種[1]，其而其油脂代謝相關(guān)的[2-3]研究較多。茶樹作為加工各類茶飲的重要經(jīng)濟林物種，其葉片富含兒茶素類（黃烷-3醇類）次生代謝物[4]，并對茶葉品質(zhì)的形成具重要影響。最近，Tai和Jiang通過比較研究發(fā)現(xiàn)茶樹和油茶中兒茶素類成分的積累和分布差異較大[5-6]。兒茶素類物質(zhì)的生物合成來自于植物類黃酮合成途徑[6]，Tai通過對兩個物種比較轉(zhuǎn)錄組學的研究，鑒定了該途徑相關(guān)的一些差異表達基因，包括花青素還原酶基因（ANR）?；ㄇ嗨剡€原酶具有催化花青素類還原形成兒茶素的作用[7]，茶樹ANR基因（CsANR）已經(jīng)被克隆，且功能已獲得驗證[8]，而油茶ANR基因（CoANR）尚未被克隆，其相關(guān)的功能也尚不明確。因而，本文對油茶ANR基因進行克隆，并對其原核表達的重組蛋白進行體外酶促反應活性的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

1.1.1 實驗材料

以成年油茶樹（長林四號）為實驗材料（安徽六安，德昌苗木公司），選取長勢良好一致油茶植株，采集芽、一葉、莖和根樣品，每個樣品三個生物學重復，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?.1.2 實驗試劑

兒茶素標品（C、EC、GC、EGC、ECG和EGCG，上海源葉標品公司），色譜級甲酸（阿拉丁公司，中國），色譜級甲醇（TEDIA，美國），色譜級乙酸等。KOD-Fx-plus高保真酶（TOYOBO公司，日本），rTaq酶（TaKaRa公司，大連），RNA提取試劑盒，膠回收試劑盒等。

1.2 油茶花青素還原酶基因的克隆

1.2.1 RNA的提取

預先準備 65℃水浴鍋和 RNase滅活的研缽。取保存在-80℃的樣品，在液氮中迅速研磨至粉末，采用TIANGEN試劑盒，按照廠家說明書提取總RNA。

1.3 油茶ANR全長基因的克隆

1.3.1 油茶ANR全長基因的克隆

基于已發(fā)表的茶樹花青素還原酶基因（CsANR1和CsANR2，GenBank登錄號為ADZ58166和ADZ58168）[8]和本實驗室前期獲得的油茶轉(zhuǎn)錄組序列[7]的比對分析，鑒定了兩條同源的油茶花青素還原酶基因（CoANR1和CoANR2）的轉(zhuǎn)錄本?；谶@兩條轉(zhuǎn)錄本，進一步采用RACE結(jié)合嵌套PCR方法獲得CoANR1和CoANR2的5’-UTR和3’-UTR序列，測序驗證后的片段通過 MegAlign軟件比對，再用EditSeq軟件拼接獲得全長序列。以ORF系列引物（CoANR1-ORF-F，CoANR1-ORF-R 和CoANR2-ORF-F，CoANR2-ORF-R）擴增CoANR1和CoANR2完整的ORF框。相關(guān)引物見表1。

表1 克隆油茶花青素還原酶基因的相關(guān)引物

1.3.2 ANR基因的進化樹分析

將CoANR1和CoANR2ORF框翻譯成氨基酸序列，用 MegAlign和 MEGA6.0軟件將CoANR1和CoANR2的氨基酸序列與植物ANR基因的氨基酸序列進行比對，并采用鄰接法構(gòu)建進化樹。采用的植物ANR蛋白包括進化樹上縮寫的基因物種及登錄號為：CsANR1 （茶樹，ADZ58166）， CsANR2 （茶樹，ADZ58166），AtANR（擬南芥, AT1G61720），PtANR （楊樹，XP_002317270），TcANR （可可，ADD51353），VvANR （葡萄，CAD91911）MtANR （苜蓿， AAN77735）， DkANR （柿樹，BAF56654），F(xiàn)aANR1 （草莓，ABG76843），F(xiàn)aANR2 （草莓，ABD95362），LcANR （百脈根，ABC71337）， MdANR （蘋果，AEL79860），TrANR （白三葉，ADD09575），MsANR （紫花苜蓿， ADK95116）。

1.4 CoANR1和CoANR2基因的原核表達

1.4.1 CoANR1和CoANR2原核表達載體的構(gòu)建

設計特異性重組引物設計CoANR1-pMAL-SalI-F，CoANR1-pMAL-SalI-R 和CoANR2-pMAL-SalI-F，CoANR2-pMALSalI-R（見表1）。選用pMAL-c5X表達載體，先用內(nèi)切酶SalI切開，再采用一步克隆法試劑盒（One Step Clone Kit）將測序驗證的CoANR1和CoANR2基因和載體進行連接，完成原核表達載體的構(gòu)建。

1.4.2 CoANR1和CoANR2重組蛋白的純化

將構(gòu)建的表達載體導入大腸桿菌表達菌株BL21（DE3）中進行重組蛋白表達，挑選測序正確的單克隆菌株，加入4mL的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)14h，擴大成600mL培養(yǎng)體系，培養(yǎng)至OD值0.6左右，加1mM IPTG，25℃誘導6h，收集菌體，超聲破碎，離心獲取上清蛋白，用親和樹脂柱純化獲得CoANR1，CoANR2純化蛋白，用 BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。采用 SDS-PAGE電泳檢測表達和純化的蛋白。

1.4.3 CoANR1和CoANR2重組蛋白的體外酶活檢測

基于 Xie[7]和 Qian[9]的方法對花青素還原酶體外酶活反應體系進行優(yōu)化，該反應體系總體積100μL，包括30μg純化重組蛋白，100 μM氯化矢車菊色素（或者氯化飛燕草色素），500mM NADPH，以及pH6.5的20mM磷酸緩沖液。37℃反應30min后用等體積甲醇終止反應，12000rpm冷凍離心，棄下層沉淀，得到的上清經(jīng) 0.22μm有機膜過濾后獲得反應產(chǎn)物的溶液。反應產(chǎn)物采用UPLC-MS/MS檢測，A流動相為0.4%乙酸，B流動相為甲醇，洗脫條件：0～5 分鐘， 5%～20%B，5～18 分鐘，20%～25%B，18～25分鐘，從25%～5%B。流速為0.2mL·min?1，檢測波長278nm紫外光，進樣量 2μL，反相柱 Kinetex1.7u XB-C18 100A column (Phenomenex 30 mm×2.1 mm)。質(zhì)譜儀檢測采用 MRM 模式（m/z 100～800），鞘氣溫度325℃，流速6L·min?1，干燥氣流溫度325℃，毛細管電壓45psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶ANR全長基因的克隆

2.1.1 油茶不同器官總 RNA的提取和質(zhì)量檢測提取的油茶不同器官總RNA經(jīng)檢測濃度較高，其A260/A280和A260/A230值表明RNA質(zhì)量較好，沒有污染（表2）。經(jīng)凝膠電泳膠檢測RNA條帶完整，沒有出現(xiàn)彌散。因此，提取的RNA質(zhì)量較好，能滿足后續(xù)實驗的要求。

表2 油茶不同器官RNA濃度和質(zhì)量檢測結(jié)果

圖1 不同器官RNA凝膠電泳圖

2.1.2 油茶ANR全長基因的克隆

通過 RACE和RT-PCR結(jié)合的方法，獲得油茶CoANR1和CoANR2基因的全長序列，菌落PCR的結(jié)果見圖2。將陽性菌落測序，獲得 COANR1（登錄號：MG925480）全長 1441bp，包括ORF框1047bp，5’UTR區(qū)188bp，3’UTR區(qū) 206bp。ORF框編碼 348個氨基酸殘基，肽鏈分子量大小 37.4KDa，等電點 PI 為5.52；獲得COANR2（登錄號：MG925481）全長1413bp，包括ORF框1014bp，5’UTR區(qū)155bp，3’UTR區(qū)244bp。ORF框編碼337個氨基酸殘基，肽鏈分子量大小36.2KDa，等電點 PI 為 6.5。

圖2 CoANR1和CoANR2 菌落PCR檢測結(jié)果

2.1.3 ANR基因的進化樹分析

將CoANR1和CoANR2基因與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄一些植物ANR基因的氨基酸序列進行Blast比對并構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹（圖3）。CoANR1和茶樹同源性為97%，和柿樹，葡萄，紫花苜蓿比對的同源性分別為97%，78%，79%，73%；CoANR2和茶樹同源性為99%，和百脈根，柿樹和蘋果的同源性分別為 99%，77%，86%，82%。進化樹分析表明，CoANR1和CoANR2分別與茶樹CsANR1和CsANR2親緣性最高，并與柿樹、葡萄、可可和楊樹ANR在同一進化樹分支上。

圖3 油茶與其他物種花青素還原酶基因的系統(tǒng)進化樹

2.2 CoANR1和CoANR2重組蛋白的制備和體外酶活檢測

2.2.1 CoANR1和CoANR2重組蛋白的制備

含有CoANR1和CoANR2完整ORF序列的質(zhì)粒經(jīng)測序驗證后，采用pMAL-c5X載體，基于Vazyme公司的一步克隆法構(gòu)建原核表達載體，再將表達載體導入表達菌株（BL21），誘導表達后在大腸桿菌破碎上清中獲得重組的目的粗蛋白（見圖4泳道2和4），經(jīng)SDSPAGE檢測表明目的蛋白與預測表達蛋白的分子量大小一致。重組粗蛋白進一步經(jīng)過親和樹脂純化后獲得相應的純化重組蛋白（見圖4泳道3和5），經(jīng)SDS-PAGE檢測純化蛋白雜帶較少，目的蛋白顯著富集（圖4）。

2.2.2 CoANR1和CoANR2重組蛋白體外酶活檢測

將純化后的CoANR1和CoANR2重組蛋白用于體外酶促反應，并用LC-MS檢測反應產(chǎn)物。結(jié)果表明，CoANR1和CoANR2重組蛋白都可以催化花青素還原反應產(chǎn)生兒茶素，當?shù)孜餅槭杠嚲丈貢r，CoANR1和CoANR2都能將其催化成C和EC；當?shù)孜餅轱w燕草色素時，CoANR1和CoANR2都能其催化成GC和EGC（圖5）。

圖4 CoANR1和CoANR2重組蛋白的SDS-PAGE檢測圖

圖5 CoANR1和CoANR2重組蛋白體外酶促反應產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測（a）底物為矢車菊色素的催化產(chǎn)物 ； (b)底物為飛燕草色素的催化產(chǎn)物

3 討論

本研究克隆了兩條油茶花青素還原酶的全長基因，并對油茶重組CoANR1和CoANR2蛋白進行體外酶活檢測。結(jié)果表明兩者均具有催化花青素轉(zhuǎn)化為兒茶素的功能。這一結(jié)果與茶樹重組 CsANR1和 CsANR2蛋白體外酶促反應催化矢車菊色素和飛燕草色素的產(chǎn)物相同[8]。然而在Tai和Jiang[5-6]的研究中發(fā)現(xiàn)，茶樹中（尤其在幼嫩葉部）積累的總兒茶素含量顯著高于油茶[5-6]。本研究盡管發(fā)現(xiàn)茶樹和油茶ANR重組蛋白體外催化功能相似，但是茶樹和油茶ANR蛋白的體內(nèi)催化功能尚不明確，有待將來進一步研究和比較。此外，Tai通過茶和油茶葉部的比較轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)兩個物種兒茶素合成途經(jīng)關(guān)鍵酶相關(guān)基因表達存在顯著差異，其中茶樹ANR基因表達顯著高于油茶ANR基因，基因轉(zhuǎn)錄水平的差異可能導致最終代謝產(chǎn)物積累的差異，但是相關(guān)的基因調(diào)控的分子機制還有待將來進一步的深入研究。

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