馬艷君，阿比克哈莫，湯 承，岳 華

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

支原體(Mycoplasma)通常寄生于動物的呼吸道、眼結(jié)膜等黏膜表面，當(dāng)動物被其他病原感染、運(yùn)輸應(yīng)激以及其他因素刺激導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降時(shí)，引起感染發(fā)病，以呼吸道疾病最為常見[1-3].已證明牛支原體(Mycoplasma bovis)、牛眼支原體(Mycoplasma bovoculi)、殊異支原體(Mycoplasma dispar)和牛鼻支原體(Mycoplasma bovirhinis)等幾種支原體對牛有致病性[4-6].2008年我國首次從患有呼吸道疾病的犢牛肺臟中分離得到牛支原體[7]，此后，廣西、寧夏回族自治區(qū)、重慶等多個(gè)地區(qū)都有牛支原體感染引起呼吸道疾病的報(bào)道[8-10]，目前，除西藏自治區(qū)和海南省外，其余省市均有牛支原體感染的報(bào)道[11].國內(nèi)關(guān)于牛支原體的研究已經(jīng)有很多報(bào)道，但關(guān)于其他種類支原體感染牛的情況知之甚少.

分離鑒定是支原體的經(jīng)典檢測方法，但支原體分離培養(yǎng)困難，難以作為常規(guī)檢測方法普及推廣[12].隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的普及，PCR已成為包括支原體在內(nèi)的多種病原檢測的主流手段[13].由于支原體屬16S rRNA基因兼有保守性和變異性于一體的特點(diǎn)，可作為支原體鑒定和分類的靶標(biāo)基因[14].尹秋生等人用靶向支原體屬16S rRNA基因設(shè)計(jì)的通用引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可同時(shí)鑒定出人型支原體、肺支原體等12種支原體[15].Rawdi等人用類似的方法鑒定出了咽支原體、上頜支原體等5種支原體[16].本研究采用支原體屬的16S rRNA通用引物對四川部分地區(qū)肉牛場呼吸道病病例進(jìn)行檢測，并采用4種支原體特異性引物進(jìn)行PCR檢測.旨在了解支原體的感染情況，為肉牛呼吸道病的防控提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 臨床樣本和參考菌株

2016年10月至2017年4月，在四川南充市、閬中市和儀隴縣等地的6個(gè)肉牛場共采集54份患呼吸道疾病的病牛深部鼻腔棉拭子(B1～B54)，所有病例均為從外省調(diào)運(yùn)購回的3～4月齡西門塔爾?；蛭麟s牛，均在運(yùn)回后7～10天內(nèi)發(fā)病，主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退，鼻鏡干燥，流出黃白色膿性鼻液，呼吸困難，體溫升高，部分病牛結(jié)膜發(fā)炎，流淚等.

牛支原體參考菌株由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存.

1.2 主要試劑

rTaqDNA聚合酶、PMD19-T克隆載體購自TAKARA 公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Miniprep Kit購自 Omega公司；DL2000 DNA Maker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程(大連)股份有限公司.

1.3 肉牛鼻腔棉拭子樣本PCR檢測

將肉牛鼻腔棉拭子樣本置1mL PBS中充分涮洗，涮洗液12 000 rpm 4℃離心30 min去上清，常規(guī)酚-氯仿法提取沉淀中的DNA作為模板，參照文獻(xiàn)[16]報(bào)道的支原體屬特異性PCR檢測方法進(jìn)行支原體檢測，引物為靶向支原體屬16S rRNA的通用引物，擴(kuò)增片段大小為1021bp.同時(shí)以牛支原體作為陽性對照，以無模板對照作為陰性對照，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用Gel Extraction Kit對目的片段進(jìn)行回收純化后克隆至pMD19-T，將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆用 Plasmid Miniprep Kit提取的重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司測序.

1.4 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

DNAman同源性比對分析測序結(jié)果.選取Gen-Bank中13條分別來自中國、美國、瑞典、埃及德國等具有代表性的牛支原體16S rRNA以及GenBank中收錄的牛眼支原體、殊異支原體和牛鼻支原體這三種支原體的全部16S rRNA序列，運(yùn)用Mega5.0軟件構(gòu)建靶標(biāo)基因與以上GenBank中的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析進(jìn)化關(guān)系.

1.5 四種支原體的特異PCR檢測

1.5.1 特異性檢測引物

本試驗(yàn)中用于檢測牛支原體的PCR方法是參照文獻(xiàn)[17]報(bào)道的進(jìn)行；牛眼支原體采用的是Schnee等人報(bào)道的PCR方法進(jìn)行檢測[18]；殊異支原體檢測方法按照文獻(xiàn)[19]報(bào)道的進(jìn)行；檢測牛鼻支原體的方法參照文獻(xiàn)[20]報(bào)道的PCR方法進(jìn)行.上述4對特異性檢測引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體引物信息見表1.

表1 引物信息Table 1 Primers for detection of bacterial pathogens

1.5.2 特異性PCR檢測

利用1.3中提取的肉牛鼻腔棉拭子的DNA作為模板，分別用牛支原體、牛眼支原體、殊異支原體以及牛鼻支原體特異性引物進(jìn)行PCR檢測.用1.5%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物電泳進(jìn)行鑒定，在檢測出的陽性樣本中，每種支原體隨機(jī)選取5個(gè)樣本(檢測少于5個(gè)陽性的支原體，全部克隆轉(zhuǎn)化)用Gel Extraction Kit對目的片段進(jìn)行純化回收并將其克隆至pMD19-T，將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆用Plasmid Miniprep Kit提取重組質(zhì)粒，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序.

2 結(jié)果

2.1 肉牛鼻腔棉拭子樣本PCR檢測及測序結(jié)果

從54份肉牛鼻腔棉拭子樣本中檢出23份陽性樣本，部分樣本的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約1000 bp處出現(xiàn)明亮的條帶，與預(yù)期大小相符(圖1)，測序結(jié)果顯示23個(gè)片段均為1021 bp，為支原體16S rRNA序列.54份樣本支原體個(gè)體陽性率為42.6%(23/54)，6個(gè)場中5個(gè)為陽性場(5/6)，可見支原體在被檢肉牛場呼吸道病牛中普遍存在.

圖1 部分樣本PCR產(chǎn)物的電泳圖Fig.1 PCR amplification results of partial samples

2.2 支原體種類的鑒定和序列分析

對PCR產(chǎn)物克隆測序結(jié)果同源性比對分析共鑒定出4種支原體(表2)，分別是牛支原體(12/54)、牛眼支原體(6/54)、殊異支原體(3/54)和牛鼻支原體(2/54).12條牛支原體16S rRNA序列之間的同源性為99.9% ～100.0%，與GenBank中牛支原體參考序列之間的同源性為99.5% ～99.9%；6條牛眼支原體16S rRNA序列之間的同源性為99.0% ～100.0%，與GenBank中牛眼支原體參考序列之間的同源性為99.0% ～100.0%；3條殊異支原體16S rRNA序列之間的同源性為99.8% ～100.0%，與GenBank中的殊異支原體參考序列之間同源性為99.8% ～100.0%；2條牛鼻支原體16S rRNA序列之間的同源性為99.7% ～100.0%，與GenBank中的牛鼻支原體參考序列之間的同源性為99.5%～99.7%.

表2 54份臨床樣本中4種支原體的檢出情況Table 2 Four kinds of Mycoplasmas in 54 clinical samples

2.3 基于支原體16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 12條牛支原體的系統(tǒng)發(fā)育分析

12條牛支原體的進(jìn)化樹見圖2.由圖可見，其中9條與國內(nèi)重慶株(CP005933.1)、廣東株(KM576849.1)以及埃及株(JX993354.1)、瑞典株(AF332756.1)、美國株(GU99386.1)聚為1小支；其余3株各自聚為獨(dú)立的一小支.

圖2 牛支原體的進(jìn)化樹(鄰近法)Fig.2 Consensus tree of Mycoplasma bovis(Neighbor-joining method)

2.3.2 6條牛眼支原體的系統(tǒng)發(fā)育分析

6條牛眼支原體的進(jìn)化樹見圖3.由圖可見，有2條和GenBank中唯一登錄1條牛眼支原體美國株(NR＿121731.1)16S rRNA序列聚為一支，其余4株獨(dú)立聚為一支.

圖3 牛眼支原體的進(jìn)化樹(鄰近法)Fig.3 Consensus tree of Mycoplasma bovoculi(Neighbor-joining method)

2.3.3 3條殊異支原體的系統(tǒng)發(fā)育分析

3條殊異支原體的進(jìn)化樹見圖4.由圖可見，其中2條與國內(nèi)甘肅株(CP024161.1)聚為一支，另外1株單獨(dú)聚為一支.

圖4 殊異支原體的進(jìn)化樹(鄰近法)Fig.4 Consensus tree of Mycoplasma dispar(Neighbor-joining method)

2.3.4 2條牛鼻支原體的系統(tǒng)發(fā)育分析

2條牛鼻支原體的進(jìn)化樹見圖5.由圖可見，2株聚為一小支，與甘肅株(CP024049.1)最近，而與國外毒株的遺傳距離較遠(yuǎn).

圖5 牛鼻支原體進(jìn)化樹(鄰近法)Fig.5 Consensus tree of Mycoplasma bovirhinis(Neighbor-joining method)

2.4 4種支原體特異性PCR檢測結(jié)果

采用特異性PCR方法，分別對54份臨床樣本中的牛支原體、牛眼支原體、殊異支原體和牛鼻支原體進(jìn)行檢測，經(jīng)過凝膠電泳對檢測結(jié)果進(jìn)行鑒定，片段大小與預(yù)期相符；隨機(jī)挑選樣本進(jìn)行膠回收，克隆轉(zhuǎn)化測序結(jié)果和檢測結(jié)果符合.4種支原體部分樣本的PCR檢測結(jié)果如圖6～圖9.

圖6 牛支原體部分樣本PCR檢測結(jié)果Fig.6 PCR amplification results of partial samples for Mycoplasma bovis

圖7 牛眼支原體部分樣本PCR檢測結(jié)果Fig.7 PCR amplification results of partial samples for Mycoplasma bovoculi

圖8 殊異支原體部分樣本PCR檢測結(jié)果Fig.8 PCR amplification results of partial samples for Mycoplasma dispar

圖9 牛鼻支原體部分樣本PCR檢測結(jié)果Fig.9 PCR amplification results of partial samples for Mycoplasma bovirhinis

4種支原體感染調(diào)查結(jié)果顯示，肉牛的支原體感染較為普遍，也出現(xiàn)有幾種支原體混合感染情況.

在肉牛的臨床樣本中，牛支原體的檢出率為57.3%(29/54)，是檢出率最高的支原體，殊異支原體檢出率為29.63%(16/54)，牛鼻支原體的檢出率為16.67%(9/54)，以上這三種支原體是在患有呼吸道疾病的樣本中經(jīng)常檢出的，本實(shí)驗(yàn)中牛眼支原體的檢出率為20.37%(11/54)，這可能是因?yàn)榕R床病例中有部分病牛出現(xiàn)了結(jié)膜炎等癥狀；在兩種支原體混合感染中，檢出率相對較高的是牛支原體＋殊異支原體模式的混合感染，檢出率為16.67%，與感染呼吸道病的支原體比較符合；三種支原體混合感染牛支原體＋牛眼支原體＋殊異支原體的檢出率為5.56%，牛鼻原體＋牛眼支原體＋殊異支原體的檢出率為0，而四種支原體的混合感染的檢出率在肉牛樣本中為0，這與支原體各自的自身特征及和宿主的相互作用以及環(huán)境因素都有很大關(guān)系.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用支原體屬特異性PCR檢測方法，對采集自四川6個(gè)肉牛場的54頭患呼吸道病的肉牛鼻腔拭子樣本54份進(jìn)行支原體的檢測，共檢測出23份支原體陽性樣本，表明該6個(gè)肉牛場呼吸道病牛中支原體感染較為普遍.牛的支原體健康帶菌情況非常普遍，常常在運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激情況下由于機(jī)體的免疫力降低而引起原發(fā)或繼發(fā)感染甚至死亡[21-23].該6個(gè)肉牛場均在牛運(yùn)回后7～10天內(nèi)發(fā)病，因此，長途運(yùn)輸時(shí)抗應(yīng)激處理是減少支原等病因?qū)е录膊“l(fā)生的重要手段[24-25].

3.1 牛支原體是肉牛支原體感染的優(yōu)勢種

在引起牛呼吸道病的支原體中，牛支原體的感染很廣泛，能引起多種疾病，其中牛肺炎、乳腺炎等最為常見[26].牛支原體病呈世界性分布，在法國，近30%的牛場有牛支原體的檢出，在北美洲的肉牛場，由牛支原體引起的呼吸道疾病呈現(xiàn)出增加的趨勢[27].隨著世界各地貿(mào)易往來頻繁，牛支原體病的感染就更加普遍[28].國內(nèi)自2008年證實(shí)牛支原體與牛呼吸道疾病緊密相關(guān)以來[7]，關(guān)于該菌的研究已經(jīng)有很多報(bào)道，是國內(nèi)肉牛呼吸道疾病的一個(gè)重要病原[29].本研究中牛支原體檢出率最高，檢出率為57.3%(29/54)，與國內(nèi)外的研究結(jié)果相似.

3.2 首次在國內(nèi)證實(shí)牛眼支原體的存在

牛眼支原體可引起傳染性牛角膜結(jié)膜炎(Infectious bovine keratoconjunctivitis，IBK)，導(dǎo)致病牛流淚、角膜混濁等[30].1968年，在加拿大，Langford E V等人首次從患有IBK的牛的結(jié)膜拭子中分離出了牛眼支原體[31].在德國，Schnee C等人[32]從患有IBK的384頭牛的結(jié)膜拭子中檢出177頭的結(jié)膜拭子中有牛眼支原體.Levisohn等人從患有呼吸道病并伴有流淚癥狀的牛眼分泌物中分離出了牛眼支原體和牛支原體[33]，并認(rèn)為該病原可能與呼吸道疾病有關(guān).本研究首次從我國患呼吸道病并伴有結(jié)膜炎的病牛鼻腔樣本中檢出了牛眼支原體，檢出率為20.37%(11/54)，其在牛呼吸道病和結(jié)膜炎中的作用值得進(jìn)一步關(guān)注.

3.3 牛鼻支原體和殊異支原體感染值得進(jìn)一步關(guān)注

牛鼻支原體和殊異支原體也常在呼吸道病例中檢出[34-35].在歐洲和北美，引起牛呼吸道疾病的支原體中，牛支原體和殊異支原體最常見[36].Thomas等人對比利時(shí)1997～2000年的300多份樣本的檢測結(jié)果顯示，牛支原體和殊異支原體檢測到最多，其次就是牛鼻支原體[37].2017年10月GenBank中登陸了來自我國甘肅的殊異支原體和牛鼻支原體的全基因序列，但未見這兩種支原體的病原流行病學(xué)資料.本研究從患呼吸道疾病的病牛中檢出殊異支原體和牛鼻支原體，檢出率分別為29.63%(16/54)和16.67%(9/54).因此，進(jìn)一步研究這兩種支原體在國內(nèi)牛呼吸道疾病中的作用，對牛呼吸道疾病的診斷和防控有積極的意義.

綜上可見，支原體在四川呼吸道病肉中較為普遍，其中牛支原體帶菌率最高；而牛眼支原體、殊異支原體和牛鼻支原體也有一定的檢出率，這四種支原體在牛呼吸道疾病中的作用值得進(jìn)一步研究.

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