潘永剛，劉曉志，高 健，王志明

0 引言

在蛋白質(zhì)功能研究中，DNA敲除和mRNA敲低方法是必不可少的研究手段。蛋白質(zhì)抑制劑是蛋白質(zhì)翻譯后修飾、構(gòu)象和相互作用區(qū)域研究的有益補(bǔ)充[1]。蛋白質(zhì)抑制劑包括肽、變構(gòu)調(diào)節(jié)劑、短單鏈DNA或RNA寡核苷酸(Aptamers，Intramers)、中和抗體、胞內(nèi)抗體和非免疫球蛋白支架抗體(如：cysteine-Knot Proteins、Adnectins、Anticalins、Affibodies和DARPins等)。

細(xì)胞內(nèi)抗體，即靶向細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體分子，是重組的抗體片段，主要優(yōu)點(diǎn)是特異性高，靶向翻譯后修飾，相互作用區(qū)域，構(gòu)象異構(gòu)體，剪接變體和同種型，沒有脫靶效應(yīng)。不同于經(jīng)典的中和抗體，細(xì)胞內(nèi)抗體可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)功能的長效抑制，可以被特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特定區(qū)域，并與相應(yīng)的抗原結(jié)合[2]。

細(xì)胞內(nèi)抗體發(fā)展的問題：scFv和Fab型的細(xì)胞內(nèi)抗體不能在細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境內(nèi)形成二硫鍵，因此，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差。

酵母雙雜交系統(tǒng)中表達(dá)的功能性scFv型細(xì)胞內(nèi)抗體的研究策略，使一些功能性scFv型的胞內(nèi)抗體被發(fā)現(xiàn)[3]。在抗體工程研究中，研究者發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定型的sdAb(Single domain antibody)型細(xì)胞內(nèi)抗體，這些抗體來自駱駝或鯊魚，但是僅包含抗體的重鏈可變區(qū)。VHH是來自駱駝的重鏈抗體，識(shí)別新抗原受體(IgNAR，New antigen receptor)的抗體來自鯊魚的可變區(qū)，稱為vNAR。來自駱駝的VHH稱為納米抗體(Nanobodies)。

來自駱駝或鯊魚的單域抗體均具有完整的功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)，VHH單域抗體具有3個(gè)互補(bǔ)決定的CDR (Complementarity determining regions)區(qū)，vNAR單域抗體包括CDR1、CDR3、HV2和HV4。駱駝和鯊魚的單域抗體具有良好的溶解性、熱穩(wěn)定性和復(fù)性能力。此外，通過構(gòu)架區(qū)的突變和CDRs隨機(jī)改造，可以增加人源VH和VL單域抗體的穩(wěn)定性。即使沒有形成二硫鍵，駱駝源抗體也可以在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定表達(dá)。折疊后的納米抗體可以找到抗原，并和抗原穩(wěn)定結(jié)合[4]。

納米抗體被用于體內(nèi)分子運(yùn)輸過程、蛋白質(zhì)構(gòu)象檢測和翻譯后修飾的研究。此外，當(dāng)不穩(wěn)定蛋白質(zhì)對(duì)降解、展開或聚集敏感時(shí)，納米抗體也作為結(jié)晶分子伴侶使用。

抗體片段一般通過噬菌體或酵母進(jìn)行展示，然后通過篩選sdAbs抗體、單克隆化等步驟，最終得到細(xì)胞內(nèi)抗體。通用合成抗體庫進(jìn)行納米抗體的篩選不需要用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫，因此較為快捷。低親和力抗體可以通過CDR突變、熱點(diǎn)隨機(jī)化突變或容錯(cuò)PCR實(shí)現(xiàn)親和力成熟。目前，納米抗體數(shù)目不斷增長，其中大多數(shù)來源于駱駝，一些來源于人源VH和VL的結(jié)構(gòu)域。此類靶點(diǎn)包括：包括激酶的胞內(nèi)酶、致癌蛋白、毒素、神經(jīng)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)、病毒蛋白、植物和果蠅蛋白等[5]。

大多數(shù)sdAbs已經(jīng)在活細(xì)胞中進(jìn)行了評(píng)估，其中一部分進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在一些研究中，基因敲除對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是致命的，而使用表達(dá)細(xì)胞內(nèi)sdAb轉(zhuǎn)基因小鼠可以進(jìn)行替代。

ER (Endoplasmic reticulum，內(nèi)質(zhì)網(wǎng))胞內(nèi)抗體的功能敲除是通過胞內(nèi)抗體C末端與KDEL序列結(jié)合，滯留分泌途徑上相關(guān)分子來實(shí)現(xiàn)[6]。ER-胞內(nèi)抗體可以在ER環(huán)境中進(jìn)行正確折疊[7]，因而曾被認(rèn)為是最有希望的蛋白抑制劑。與ER-胞內(nèi)抗原結(jié)合相反，胞內(nèi)抗體必須通過與抗原結(jié)合并誘導(dǎo)構(gòu)象改變，或干擾靶蛋白與其特異性結(jié)合伴侶分子，而實(shí)現(xiàn)蛋白功能的抑制。靶向ER(ER-胞內(nèi)抗體)的內(nèi)抗體主要是scFv片段，胞質(zhì)/胞內(nèi)抗體是scFv片段更穩(wěn)定的單域抗體。由于sdAb在細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核中的高穩(wěn)定性，基于噬菌體和酵母篩選的高特異性，對(duì)胞質(zhì)/核蛋白功能抑制的sdAb具備良好的開發(fā)和研究前景。

1 細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核內(nèi)抗體

為了獲得穩(wěn)定正確折疊的scFv片段，必須使用酵母、大腸桿菌等系統(tǒng)進(jìn)行特異性抗體的篩選，其他可能的選擇包括，表達(dá)scFv-蛋白融合CDR，或?qū)⒑铣傻腃DR引入穩(wěn)定的抗體框架上[8]?；诮湍鸽p雜交系統(tǒng)的抗體捕獲技術(shù)(Antibody Capture Technology，IACT)是篩選功能性scFv的最常用的方法。

1.1 ScFv型抗體 IACT技術(shù)篩選得到了許多不同的scFv，如：針對(duì)Tau蛋白、淀粉樣蛋白-β肽、α-突觸核蛋白、proNGF、gephyrin、Syk、EGFR、BCR-ABL、半胱天冬酶3、聚集蛋白聚糖酶-2和輪狀病毒NSP5蛋白。

最近，研究者應(yīng)用IACT技術(shù)篩選到針對(duì)HPV病毒 E6癌蛋白的scFv片段，該片段到達(dá)細(xì)胞核并抑制HPV16E6(16E6)活性，誘導(dǎo)p53降解，引發(fā)HPV16陽性細(xì)胞凋亡。此外，在2項(xiàng)小鼠實(shí)驗(yàn)中，靶向細(xì)胞核的細(xì)胞內(nèi)抗體抑制了HPV16陽性腫瘤細(xì)胞的腫瘤活性。另外，構(gòu)建的2種雙特異性scFv片段，第1種同時(shí)具有靶向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)和恢復(fù)突變p53功能，第2種同時(shí)具有靶向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)合Mdm2，防止p53被Mdm2降解[9]。上述3種scFv片段均由相應(yīng)雜交瘤克隆獲得。

1.2 單域抗體 與繁瑣耗時(shí)的scFv′s篩選不同，單域抗體可通過免疫、天然、合成文庫、有噬菌體或酵母展示技術(shù)進(jìn)行快速抗體篩選。單域抗體僅由1個(gè)V區(qū)(重鏈或輕鏈可變區(qū))組成，其可以在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。

2 細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核單域胞內(nèi)抗體

從駱駝科重鏈IgG(VHHs)、軟骨魚IgNAR(VNA)或常規(guī)人IgG(VH和VL)可以獲得單域抗體。上述抗體可以由駱駝或鯊魚的免疫庫、天然庫或由具有穩(wěn)定支架的合成庫中篩選得到。然而，針對(duì)免疫駱駝的操作較免疫鯊魚方便。因此，鯊魚單域抗體的篩選大多選自合成庫。人源VH或VL單域抗體一般從VH和VL合成抗體庫中進(jìn)行篩選[10]。

2.1 駱駝VHH免疫文庫的構(gòu)建和篩選 研究者通過對(duì)駱駝進(jìn)行免疫，獲得駱駝VHHs的免疫文庫；采用結(jié)合IgG cDNA的N端和CH2區(qū)結(jié)合的引物，進(jìn)行VHH的PCR擴(kuò)增，再對(duì)VHH編碼區(qū)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物克隆到噬菌體載體中，建立噬菌體抗體庫[11]。

至今，大部分納米抗體和細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核納米抗體是從靶蛋白免疫美洲駝后獲得的免疫庫中篩選得到的。納米抗體抑制了HIV Rev，HIV Vpr，HIV-1 Nef，流感病毒核蛋白，乙肝核心抗原(Hepatitis B core antigen，HBcAg)，9種非結(jié)構(gòu)蛋白，4種豬藍(lán)耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基質(zhì)蛋白，鼠傷寒沙門氏菌SpvB毒素，肉毒梭菌神經(jīng)毒素蛋白酶，霉菌毒素15-乙酰喔科煙酰胺(15-Acetyldeoxynivalenol，15-AcDON)，蛋白激酶C，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白 CapG，L-肌動(dòng)蛋白，肌成束蛋白和cortactin，凝溶膠蛋白，β-鏈蛋白，2.5二羥基吡啶雙加氧酶(NicX)，β2-腎上腺素能受體，馬鈴薯Y病毒N1a蛋白酶和靶向GFP蛋白(消除真核生物GFP融合蛋白)等的蛋白質(zhì)功能和活性[12-15]。

天然文庫和合成抗體文庫的優(yōu)點(diǎn)是無需對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，缺點(diǎn)是篩選得到的抗體需要進(jìn)行親和力成熟。然而，如果這些文庫含有大量高度多樣性的克隆，且這些克隆針對(duì)所有可能的靶點(diǎn)和表位，會(huì)增加篩選難度。通過1個(gè)克隆步驟，就可以將選定的sdAb轉(zhuǎn)化為胞質(zhì)/核抗體片段[16]。

2.2 駱駝VHH天然文庫的構(gòu)建和篩選 天然美洲駝VHH文庫可以來源于1只動(dòng)物，為了增加文庫多樣性，也可以來源于多只動(dòng)物的血液樣本。已構(gòu)建的天然文庫克隆數(shù)目范圍為107～5×109個(gè)。最近納米抗體核糖體展示技術(shù)的發(fā)展，使得核糖體-VHH復(fù)合物可以在不同表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。

有學(xué)者應(yīng)用VHH文庫篩選得到了細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的sdAb，針對(duì)細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核內(nèi)的靶點(diǎn)蛋白包括：HCV的非結(jié)構(gòu)性膜蛋白NSB4，Bax，HCV的NS3解旋酶，RNA依賴性RNA聚合酶NS5B，核多聚(A)- 結(jié)合蛋白1(PABPN1)和Caspase-3[17]。

2.3 合成VHH文庫的構(gòu)建和篩選 研究者根據(jù)天然VHH框架構(gòu)建了駱駝VHH合成文庫。通過CDR的隨機(jī)化(主要是CDR3)引入了抗原結(jié)合的多樣性。研究者利用3只未免疫的美洲駝，通過對(duì)CDR和框架進(jìn)行易錯(cuò)PCR，再利用PCR將這些序列與通用框架重疊拼接在一起，通過上述操作，完成了半合成文庫的構(gòu)建。

有學(xué)者篩選得到了導(dǎo)致異源核內(nèi)核糖核蛋白K(Heterogenous nuclear ribonucleoprotein K，hnRPN-K)積累的納米抗體。此外，篩選得到了明顯抑制馬鈴薯淀粉分支酶的酶活性的納米抗體[18]。最近，將抗GFP VHH的CDRs與抗-β內(nèi)酰胺酶VHH的穩(wěn)定框架結(jié)合，構(gòu)建得到了一種非常穩(wěn)定的抗GFP納米抗體，后者是成形素的一個(gè)組分，用于果蠅(Decapentaplegic，Dpp)的翼展發(fā)育研究。

2.4 人源VH/VL合成文庫的構(gòu)建和篩選 人源VH/VL合成文庫是由穩(wěn)定的人VH/VL種系構(gòu)建或人單克隆抗體的VH/VL支架構(gòu)建的。CDR的隨機(jī)化技術(shù)，尤其是針對(duì)CDR3的隨機(jī)化，使得人源VH/VL合成文庫具有更高的多樣性。最近構(gòu)建的包含人神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1(Neural cell adhesion molecule 1，NCAM1)的Ig1結(jié)構(gòu)域的合成文庫，整合了來自鯊魚克隆的隨機(jī)化CDR1和CDR3[19]。利用合成文庫篩選得到了阻斷趨化因子受體CXCR4信號(hào)傳導(dǎo)活性的嵌合抗體[20]。

有學(xué)者根據(jù)1個(gè)人VH合成文庫(利用抗RAS的scFv的VH框架)，篩選得到了抗myc的人VH單域抗體；應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行CDR3、CDR2和CDR1的逐步隨機(jī)化，得到了抗myc的特異性抗體；同法篩選得到了抗RAS的人源VH和抗LIM結(jié)構(gòu)域2(LIM domain only 2，LMO2)的人源VH。在小鼠腫瘤模型中，抗RAS 的人源VH抑制RAS依賴性的腫瘤發(fā)生，抗LMO2的人源VH抑制裸鼠中的T細(xì)胞瘤的形成；根據(jù)1個(gè)具有隨機(jī)CDR3的人Κ結(jié)構(gòu)域框架的合成文庫，篩選得到了抗上皮激酶(Epithelial kinase，Etk)的VL。

此外，人源VH的駱駝源化，可以通過人源VH框架(主要是框架2)中引入點(diǎn)突變來實(shí)現(xiàn)，以使抗體結(jié)構(gòu)更具親水性。此類駱駝化人源VH框架，已經(jīng)用于產(chǎn)生CDR3隨機(jī)單結(jié)構(gòu)庫的噬菌體展示系統(tǒng)中，用于改善產(chǎn)物的溶解度和重折疊效率。將兔源抗HIV Vif的VH單域細(xì)胞內(nèi)抗體，與駱駝源的框架相結(jié)合，得到了一株有活性的抗體。

2.5 IgNAR可變區(qū)(vNAR)合成文庫的構(gòu)建和篩選 vNAR文庫的構(gòu)建，一般是將天然vNAR序列和隨機(jī)化CDR3環(huán)結(jié)合形成的半合成文庫中進(jìn)行篩選。使用鯊魚抗雞蛋白溶菌酶的IgNAR VH克隆作為框架，結(jié)合隨機(jī)化CDR3環(huán)形成半合成文庫。最近研究顯示，根據(jù)2型鉸口鯊魚的VNAR框架，結(jié)合多個(gè)框架突變和部分隨機(jī)化的CDR3的鯊魚抗體庫，可篩選出可以阻斷BAFF與其全部3種受體結(jié)合，抗BAFF的中和vNAR單域抗體。目前，未見有關(guān)鯊魚細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核sdAb篩選的相關(guān)報(bào)道。

為了篩選特異性sdAb，將sdAb展示在噬菌體或酵母細(xì)胞的細(xì)胞表面上。將重組噬菌體抗體庫與固定抗原(生物淘選)一起溫育，將篩選得到的特異性結(jié)合物克隆到細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的靶向載體中，得到的細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核胞內(nèi)抗體，將在靶細(xì)胞、異種移植腫瘤小鼠模型或轉(zhuǎn)基因sdAb小鼠中進(jìn)行評(píng)估。

最近，一種用于鑒定功能性sdAb的新的篩選方法正處于開發(fā)階段，該試驗(yàn)采用滅活A(yù)型流感病毒(Inactivated influenza A virus，IAV)和水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)免疫羊駝。隨后將VHH的 cDNA直接克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，以產(chǎn)生慢病毒顆粒。然后，用重組病毒感染A549細(xì)胞，48 h后，用IAV和VSV的致死劑量進(jìn)行處理。對(duì)存活菌落進(jìn)行鑒定，確定VHH序列。篩選得到19種可以特異性阻斷IAV或VSV細(xì)胞感染的VHH抗體[21]。這種篩選方法適用于鑒定病原體或生物學(xué)途徑的抑制劑。

大多數(shù)sdAb篩選是通過噬菌體展示系統(tǒng)，而不使用細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)。這種方法可靠，可用于篩選細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核scFv片段和sdAb，因?yàn)檫@種篩選可以得到正確折疊的scFv片段或sdAb，而不是高親和力的scFv片段或sdAb。然而，抗體親和力是否是細(xì)胞內(nèi)抗體有效的唯一先決條件尚不明確。細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)可以在不需要純化抗原的情況下，直接在細(xì)胞內(nèi)篩選功能性細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核抗體。另一種雙雜交檢測技術(shù)，允許直接研究活細(xì)胞中2種蛋白質(zhì)的相互作用。熒光標(biāo)記的獵物蛋白和熒光標(biāo)記lacI (lac操縱子抑制劑)融合的相應(yīng)誘餌蛋白，在包含染色體整合的lac操縱子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞一起表達(dá)。兩個(gè)分子的相互作用，導(dǎo)致兩個(gè)不同的熒光信號(hào)在lac操縱子上共定位，并可在細(xì)胞核內(nèi)觀察到。

3 細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核單域抗體的篩選

針對(duì)40多種細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核靶點(diǎn)和35種ER內(nèi)瞬時(shí)蛋白，研究者進(jìn)行了納米抗體的篩選。大多數(shù)sdAb靶點(diǎn)屬于病毒或致癌蛋白，其次是毒素和神經(jīng)系統(tǒng)蛋白。

細(xì)胞質(zhì)內(nèi)抗體也在植物和果蠅中得到成功表達(dá)。單域胞內(nèi)抗體部分保護(hù)了馬鈴薯植株免受馬鈴薯病毒Y的侵害。目前，研究者開發(fā)了一種監(jiān)測活細(xì)胞中蛋白質(zhì)敲除的通用方法。將抗GFP VHH與果蠅Slmb的F-box結(jié)構(gòu)域融合，通過泛素耗盡通路以降解和GFP融合靶點(diǎn)蛋白。該技術(shù)被用于降解轉(zhuǎn)錄因子和參與轉(zhuǎn)基因Drosophila monogaster果蠅形態(tài)發(fā)育的相關(guān)蛋白，轉(zhuǎn)基因果蠅表達(dá)GFP-靶點(diǎn)融合蛋白和抗GFP的VHH片段。此外，其開發(fā)了抗eGFP-CD8跨膜結(jié)構(gòu)域-細(xì)胞質(zhì)mCherry的融合蛋白(簡稱Morphotrap)，用于研究表達(dá)eGFP-Dpp (Decapentaplegic，形態(tài)生成蛋白)轉(zhuǎn)基因果蠅翼片的發(fā)育情況。Morphotrap將eGFP-Dpp固定在細(xì)胞表面，抑制了翼片圖案的形成。使用具有序列選擇性和核酸水解的納米抗體用于基因沉默[22]。

大多數(shù)sdAbs已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行了評(píng)估，并且少數(shù)已經(jīng)在小鼠模型中進(jìn)行了研究。在移植表達(dá)相應(yīng)胞內(nèi)抗體的腫瘤細(xì)胞的裸鼠或NOD-SCID小鼠中，針對(duì)LMO2、F-肌動(dòng)蛋白和RAS的sdAbs進(jìn)行了研究[23]。在CD4+/HIVNEF轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)中，抗HIV-1的Nef細(xì)胞內(nèi)抗體能夠拯救Nef介導(dǎo)的胸腺CD4+T細(xì)胞成熟缺陷和外周CD4+T細(xì)胞的激活。將SH3結(jié)構(gòu)域與篩選的納米抗體結(jié)合，可以增強(qiáng)針對(duì)HIV-1的Nef的抑制功能。此外，篩選無半胱氨酸的人源VL片段，較原始抗體具有更好的活性。將半胱氨酸殘基改變?yōu)槔i氨酸和丙氨酸，可以降低抗體的親和力；可以在易錯(cuò)PCR導(dǎo)致的隨機(jī)突變中，篩選無半胱氨酸的人源VL片段變體[24]。針對(duì)病毒蛋白、毒素、致癌蛋白和神經(jīng)系統(tǒng)蛋白的幾種納米抗體具有潛在的治療前景。

4 細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核sdAbs的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染

與病毒轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同，細(xì)胞內(nèi)抗體可以作為蛋白質(zhì)遞送到胞質(zhì)中。將scFv或納米抗體形式的胞內(nèi)抗體遞送到靶細(xì)胞胞質(zhì)中，可使遞送過程中細(xì)胞內(nèi)抗體保留二硫鍵，維持了正確的折疊結(jié)構(gòu)。此外，這種方法可能成為臨床應(yīng)用中病毒基因轉(zhuǎn)移的安全替代方案。

研究者使用不同保護(hù)性劑進(jìn)行抗體向細(xì)胞質(zhì)的遞送，并與電轉(zhuǎn)技術(shù)進(jìn)行了比較研究，電穿孔是目前比較有效的技術(shù)。

此外，通過使用穿透肽或靶向蛋白，與易位結(jié)構(gòu)域形成的融合蛋白，可以幫助配體或抗體通過細(xì)胞膜，也可以使用穿透肽與內(nèi)涵體逃逸結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白，來解決蛋白進(jìn)入細(xì)胞的問題。因?yàn)閮?nèi)涵體逃逸效率低，所以，肽和蛋白質(zhì)融合蛋白通過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)基本無效。但是，通過核苷補(bǔ)救途徑，細(xì)胞穿梭抗DNA抗體可以定位于細(xì)胞核，并與特異性靶向scFv結(jié)合[25]。

細(xì)胞穿透肽具有明顯優(yōu)勢，使用細(xì)胞穿透肽適配體系統(tǒng)可以構(gòu)建TAT-鈣調(diào)蛋白融合體，以及鈣調(diào)蛋白和貨物組成的融合體。TAT-鈣調(diào)蛋白和貨物之間是非共價(jià)結(jié)合，將貨物遞送、釋放到細(xì)胞質(zhì)中。另一種策略是使用細(xì)胞穿透肽和硫酸類肝素葡糖胺聚糖結(jié)合形成一個(gè)蛋白質(zhì)梭肽的結(jié)構(gòu)域。這些系統(tǒng)已經(jīng)在一些難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型中成功使用，如小鼠胚胎干細(xì)胞(Mouse embryonic stem cells，mESCs)、人類胚胎干細(xì)胞和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)等。此外，針對(duì)HCV蛋白的駱駝源納米抗體和細(xì)胞穿透肽融合，并成功應(yīng)用于HVC感染細(xì)胞中[26]。

有研究表明，成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2可以由肽牙本質(zhì)磷酸化蛋白介導(dǎo)，靶向到間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核，而繞過了溶酶體降解途徑。最近研發(fā)的一種血清穩(wěn)定和低毒性的分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由1個(gè)剛性平面核心和4個(gè)靈活臂組成，每個(gè)臂上有1個(gè)胍基團(tuán)，可以有效地將小貨物或大的活性蛋白質(zhì)輸送到細(xì)胞質(zhì)中。將靶向內(nèi)涵體逃逸區(qū)的TAT細(xì)胞穿透肽與GFPβ11肽結(jié)合，當(dāng)GFPβ11和非熒光GFPβ1-10結(jié)合時(shí)，可以激發(fā)化學(xué)形成的GFP熒光發(fā)光。這種方法可以用于篩選內(nèi)涵體逃逸區(qū)[27]。

高效循環(huán)細(xì)胞穿透肽可以從內(nèi)涵體中釋放，再循環(huán)利用。將納米抗體框架區(qū)的水溶性殘基突變?yōu)閹д姷木彼峄蛸嚢彼?，可以增加納米抗體的細(xì)胞穿透能力，將來這種抗體框架區(qū)可以作為通用支架用于抗體的細(xì)胞內(nèi)輸送。

另一種方法是使用致病菌Ⅵ型分泌途徑將sdAb轉(zhuǎn)運(yùn)到人類細(xì)胞中。這種sdAb的注射不需要細(xì)菌侵入或遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。

由納米抗體修飾的納米顆粒介導(dǎo)的特異性遞送藥物或毒素的方法，已經(jīng)在許多體外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，并且逐步開始進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。聚合物基體和聚復(fù)合物是較新的人造囊泡，更易于被聚合物結(jié)構(gòu)單元修飾。將sdAb或sdAb表達(dá)質(zhì)粒包裹在納米顆粒中，納米顆粒被抗受體納米抗體(如：抗EGFR的納米抗體)修飾，這種修飾后的藥物納米顆?？梢赃f送抗癌單域抗體到達(dá)腫瘤細(xì)胞。另外，利用轉(zhuǎn)鐵蛋白或Angiopep-2包被的納米顆粒/納米管，可以穿過血腦屏障，其中Angiopep-2是一種低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1(Low-density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP1)配體。這種遞送藥物可能被用于細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核單域胞內(nèi)抗體(如：識(shí)別hungtington蛋白或α-Synuclein的抗體)的腦內(nèi)遞送[28-30]。

5 結(jié)論

來自駱駝、鯊魚和人的單域抗體對(duì)于有效和特異性地敲除體內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白是非常有用的。特異性靶向相互作用區(qū)域包括：蛋白質(zhì)的構(gòu)象異構(gòu)體，剪接變體，亞型，翻譯后修飾位點(diǎn)(如：磷酸化位點(diǎn)等)，使得胞內(nèi)抗體具有獨(dú)特的使用價(jià)值。即使有報(bào)道，RNAi可以特異性抑制Hungtington蛋白等位基因及滅活p53致癌突變[31]，RNAi技術(shù)具有明顯的脫靶效應(yīng)。

在合成文庫，駱駝、鯊魚和人的單域抗體文庫中，通過噬菌體或酵母展示技術(shù)的篩選，理論上可以篩選出任何抗原和表位的大量的單域細(xì)胞內(nèi)抗體。通過 CDR突變引入，突變熱點(diǎn)隨機(jī)化或易錯(cuò)PCR構(gòu)建非親和力成熟文庫，在文庫中進(jìn)行高親和力抗體的篩選，進(jìn)而達(dá)到抗體的親和力成熟的目的。重組慢病毒篩選技術(shù)有望代替現(xiàn)有的噬菌體篩選技術(shù)，用于特異性抑制性dAbs的篩選。

將細(xì)胞穿透肽、優(yōu)化的內(nèi)涵體逃逸結(jié)構(gòu)域、sdAb表達(dá)質(zhì)?；蛑亟MsdAb嵌入到聚合物囊泡和多聚復(fù)合物囊泡的納米顆粒中，納米顆粒完成細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核單域胞內(nèi)抗體的藥物細(xì)胞內(nèi)遞送，單域胞內(nèi)抗體藥物才能被應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

參考文獻(xiàn)：

[1] Marschall AL,Dübel S,B?ldicke T.Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies[J].MAbs,2015,7(6):1010-1035.

[2] Lo AS,Zhu Q,Marasco WA.Intracellular antibodies (intrabodies) and their therapeutic potential[J].Handb Exp Pharmacol,2008,(181):343-373.

[3] Gao X,Hu X,Tong L,et al.Construction of a camelid VHH yeast two-hybrid library and the selection of VHH against haemagglutinin-neuraminidase protein of the Newcastle disease virus[J].BMC Vet Res,2016,12:39.

[4] Messer A,Joshi SN.Intrabodies as neuroprotective therapeutics[J].Neurotherapeutics,2013,10(3):447-458.

[5] Wilken L,McPherson A.Application of camelid heavy-chain variable domains (VHHs) in prevention and treatment of bacterial and viral infections[J].Int Rev Immunol,2018,37(1):69-76.

[6] B?ldicke T,Somplatzki S,Sergeev G,et al.Functional inhibition of transitory proteins by intrabody-mediated retention in the endoplasmatic reticulum[J].Methods,2012,56(3):338-350.

[7] Marschall AL,Dübel S,Büldicke T.Recent Advances with ER targeted intrabodies[J].Adv Exp Med Biol,2016,917:77-93.

[8] Martinelli C,Colombo E,Piccini D,et al.An intrabody specific for the nucleophosmin carboxy-terminal mutant and fused to a nuclear localization sequence binds its antigen but fails to relocate it in the nucleus[J].Biotechnol Rep (Amst),2014,3:27-33.

[9] Mazuc E,Guglielmi L,Bec N,et al.In-cell intrabody selection from a diverse human library identifies C12orf4 protein as a new player in rodent mast cell degranulation[J].PLoS One,2014,9(8):e104998.

[10]Mejías MP,Hiriart Y,Lauché C,et al.Development of camelid single chain antibodies against Shiga toxin type 2 (Stx2) with therapeutic potential against Hemolytic Uremic Syndrome (HUS)[J].Sci Rep,2016,6:24913.

[11]Huang NJ,Pishesha N,Mukherjee J,et al.Genetically engineered red cells expressing single domain camelid antibodies confer long-term protection against botulinum neurotoxin[J].Nat Commun,2017,8(1):423.

[12]Cardinale A,Filesi I,Singh PB,et al.Intrabody-mediated diverting of HP1β to the cytoplasm induces co-aggregation of H3-H4 histones and lamin-B receptor[J].Exp Cell Res,2015,338(1):70-81.

[13]Li T,Vandesquille M,Koukouli F,et al.Camelid single-domain antibodies:a versatile tool for in vivo imaging of extracellular and intracellular brain targets[J].J Control Release,2016,243:1-10.

[15]Suzuki R,Saito K,Matsuda M,et al.Single-domain intrabodies against hepatitis C virus core inhibit viral propagation and core-induced NFκB activation[J].J Gen Virol,2016,97(4):887-892.

[16]CFC F,SDS P,Luiz MB,et al.Camelid single-domain antibodies as an alternative to overcome challenges related to the prevention,detection,and control of neglected tropical diseases[J].Front Immunol,2017,8:653.

[18]Sakuma C,Sato M,Oshima T,et al.Anti-WASP intrabodies inhibit inflammatory responses induced by Toll-like receptors 3,7,and 9,in macrophages[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,458(1):28-33.

[19]Bhatt MA,Messer A,Kordower JH.Can intrabodies serve as neuroprotective therapies for Parkinson′s disease? Beginning thoughts[J].J Parkinsons Dis,2013,3(4):581-591.

[20]Sangboonruang S,Thammasit P,Intasai N,et al.EMMPRIN reduction via scFv-M6-1B9 intrabody affects α3β1-integrin and MCT1 functions and results in suppression of progressive phenotype in the colorectal cancer cell line Caco-2[J].Cancer Gene Ther,2014,21(6):246-255.

[21]Koo MY,Park J,Lim JM,et al.Selective inhibition of the function of tyrosine-phosphorylated STAT3 with a phosphorylation site-specific intrabody[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(17):6269-6274.

[22]Schmidt FI,Hanke L,Morin B,et al.Phenotypic lentivirus screens to identify functional single domain antibodies[J].Nat Microbiol,2016,1(8):16080.

[23]Lee S,Kaku Y,Inoue S,et al.Growth signalobody selects functional intrabodies in the mammalian cytoplasm[J].Biotechnol J,2016,11(4):565-573.

[24]Cardinale A,Merlo D,Giunchedi P,et al.Therapeutic application of intrabodies against age-related neurodegenerative disorders[J].Curr Pharm Des,2014,20(38):6028-6036.

[25]De Coninck B,Verheesen P,Vos CM,et al.Fungal glucosylceramide-specific camelid single domain antibodies are characterized by broad spectrum antifungal activity[J].Front Microbiol,2017,8:1059.

[26]Strauss M,Schotte L,Karunatilaka KS,et al.Cryo-electron microscopy structures of expanded poliovirus with VHHs sample the conformational repertoire of the expanded state[J].J Virol,2017,91(3).

[27]Staus DP,Wingler LM,Strachan RT,et al.Regulation of β2-adrenergic receptor function by conformationally selective single-domain intrabodies[J].Mol Pharmacol,2014,85(3):472-481.

[28]Butler DC,Snyder-Keller A,De Genst E,et al.Differential nuclear localization of complexes may underlie in vivo intrabody efficacy in Huntington′s disease[J].Protein Eng Des Sel,2014,27(10):359-363.

[29]Khoshnan A,Ou S,Ko J,et al.Antibodies and intrabodies against huntingtin:production and screening of monoclonals and single-chain recombinant forms[J].Methods Mol Biol,2013,1010:231-251.

[30]Vandesquille M,Li T,Po C,et al.Chemically-defined camelid antibody bioconjugate for the magnetic resonance imaging of Alzheimer's disease[J].MAbs,2017,9(6):1016-1027.

[31]Callejon MA,Reina-Tosina J,Naranjo-Hernandez D,et al.Measurement Issues in galvanic intrabody communication:influence of experimental setup[J].IEEE Trans Biomed Eng,2015,62(11):2724-2732.