楊 芳，吳澤幼，包 思，梁 敬

0 引言

排草香[Anisochiluscarnosus(L.f.) Benth. et Wall]為報(bào)春花科排草屬植物細(xì)梗香草(LysimachiacapillipesHemsl)的全草，為一年生草本植物，原產(chǎn)地印度，在我國多分布于廣西、廣東、湖南等地，具有祛風(fēng)、止咳、調(diào)經(jīng)的功效，主要用于胃潰瘍及皮膚類疾病的治療[1-2]。研究表明，排草香中主要藥理活性成分為黃酮類化合物，具有抑菌、抗炎、保肝、抗腫瘤等多種藥理作用[3]。近年來，針對其藥理活性成分的抗腫瘤作用研究雖然取得了一定的進(jìn)展，但針對其具體活性成分仍未得到明確闡述[4]。本研究通過測定排草香不同溶劑提取物對人胃癌細(xì)胞MGC-803的細(xì)胞毒性，并建立高效液相色譜(HPLC)法測定其中所含木犀草素的含量，以探討排草香的細(xì)胞毒性與木犀草素含量之間的關(guān)系，以期為排草香抗腫瘤活性的研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞MGC-803細(xì)胞，購于上?；鄯f生物科技有限公司。

1.1.2 藥物 排草香，批號：161201，由廣東致信藥業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室杜勤教授鑒定為報(bào)春花科排草屬植物細(xì)梗香草(LysimachiacapillipesHemsl)的全草；紫杉醇，國藥準(zhǔn)字：H20067344，規(guī)格：30 mg*1支/盒，購于江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司；木犀草素對照品，批號：111520-200201，規(guī)格：20 mg/支，純度≥95%，購于中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 試劑盒及試劑 DMEM培養(yǎng)液，購于美國Hyclone公司；胎牛血清，購于江蘇科特生物科技有限公司；胰蛋白酶，購自賽奧生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT),磺酰羅丹明B (Sulforhodamine B，SRB)，均購于美國Sigma公司；乙腈、甲醇：色譜級，購于德國默克；其他試劑均為分析級，購于廣東光華化學(xué)試劑廠。

1.1.4 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-M2OA二極管陣列檢測器，SIL-20A自動進(jìn)樣器，CTO-20A柱溫箱，LC-solution工作站；實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)，型號：MU4100P，上海淼康實(shí)業(yè)公司；HH-6A磁力攪拌水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士布琦。

1.2 樣品制備

1.2.1 水提物制備 取500 g干燥排草香全草，粉碎，以8倍量水室溫浸提2 d后過濾，再于濾渣中加10倍量水室溫浸提2 d，過濾，合并2次濾液，水浴濃縮至干，得排草香水提物(5.5%，W/W)。

1.2.2 醇提物制備 取500 g干燥排草香全草，粉碎，以8倍量95%乙醇索氏回流(85 ℃)提取2次，每次6 h，合并2次提取液，以70 ℃水浴減壓濃縮至干，得排草香醇提物(8.6%，W/W)。

1.2.3 乙醚提取物制備 取500 g干燥排草香全草，粉碎，以8倍量乙醚索氏回流(40 ℃)提取2次，每次6 h，合并2次提取液，以30 ℃水浴減壓濃縮至干，得排草香醚提物(10.2%，W/W)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 取出凍存于-80 ℃液氮罐中的細(xì)胞，快速置于37 ℃溫水中融化細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇；于MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入DMEM生長液(10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液。待細(xì)胞生長至鋪滿瓶底80%～90%的單層細(xì)胞時，棄去培養(yǎng)液，加入適量胰蛋白酶消化2～3 min后，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化，得單層細(xì)胞，取對數(shù)生長期生長良好的細(xì)胞，以PBS清洗2～3次，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的細(xì)胞以DMEM培養(yǎng)液稀釋后，使細(xì)胞密度在計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)為2×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)為單層細(xì)胞。每次傳代培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞均為處于對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活率 采用MTT法測定細(xì)胞毒性：以含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分別將各溶劑提取物稀釋為不同濃度(25、50、100、200 μg/mL)的樣品培養(yǎng)液。以樣品培養(yǎng)液替換長有單層細(xì)胞的96孔板中的培養(yǎng)液，每個濃度平行接種3孔，每孔100 μL，為樣品組。同時以不同濃度(6.25、12.5、25、50 μg/mL)的紫杉醇組為陽性對照組，設(shè)正常培養(yǎng)液組作為空白對照組(每孔加含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液100 μL)。將上述各組細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。再于每孔加入10 μL MTT溶液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，使完全溶解。采用酶標(biāo)儀于570 nm下測定隔空的吸光度值(OD570)，并按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=100-[(OD對照組) -(OD樣品組)/(OD對照組)]×100。

1.5 SRB法檢測細(xì)胞存活率 采用SRB比色法測定細(xì)胞毒性：將96孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液分別以不同濃度(25、50、100、200 μg/mL)的樣品培養(yǎng)液替換，為樣品組。同時以不同濃度(6.25、12.5、25、50 μg/mL)的紫杉醇組為陽性對照組，設(shè)正常培養(yǎng)液組作為空白對照組(每孔加含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液100 μL)。將上述各組細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10%三氯乙酸100 μL，并于4 ℃條件下反應(yīng)1 h，以蒸餾水洗滌3～5次并干燥。再于每孔分別加入0.05%的SRB冰乙酸溶液(1%，V/V)100 μL，置于室溫條件下染色處理30 min，再以1%冰乙酸溶液洗滌3～5次，甩干。每孔加入10 mmol/L的Tris-base (pH=10.5) 200 μL，置于震蕩器中振蕩處理10 min，使SRB完全溶解。采用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定隔空的吸光度值(OD570)，并按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=100-[(OD對照組)-(OD樣品組)/(OD對照組)]×100。

1.6 木犀草素含量測定

1.6.1 對照品溶液的配制 精密稱定木犀草素對照品20.17 mg于25 mL量瓶中，以色譜甲醇溶解定容至刻度，制成每1 mL中含0.77 mg的溶液，作為木犀草素對照品母液。

1.6.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取各溶劑提取物50 mg于5 mL量瓶中，以少量色譜甲醇超聲溶解并定容至刻度，混勻得10 mg/mL的供試品溶液。

1.6.3 色譜條件 色譜柱：YMC-Hydroshpere C18柱(250 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈-0.5%磷酸(40∶60)等度洗脫；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.6.4 線性關(guān)系考察 取木犀草素對照品母液分別配制成濃度為0.77、0.38、0.19、0.15、0.08、0.04、0.03 mg/mL的一系列對照品溶液，按上述色譜條件測定。以木犀草素濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.5 精密度考察 精密吸取木犀草素對照品母液連續(xù)進(jìn)樣6針，并計(jì)算RSD值。

1.6.6 重復(fù)性考察 取同一份樣品，平行稱取6份，按照“1.6.2”制備供試品溶液，以0.22 μm微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中，按照“1.6.3”色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算RSD值。

1.6.7 加樣回收率考察 分別取上述重復(fù)性已知含量樣品，以1∶1的比例添加木犀草素對照品，平行6份，分別計(jì)算回收率及RSD值。

1.6.8 穩(wěn)定性考察 分別將樣品置于常溫(25 ℃)條件下0、2、4、6、8、12 h，測定含量，并計(jì)算RSD值。

1.6.9 樣品測定 分別按照“1.6.2”制備供試品溶液，各平行3份，以0.22 μm微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中，按照“1.6.3”色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算平均百分含量。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測細(xì)胞存活率結(jié)果 排草香各提取物組及紫杉醇組均對MGC-803細(xì)胞顯示出一定的毒性，經(jīng)IC50對比各組細(xì)胞毒性：紫杉醇>醚提物>醇提物>水提物；醚提物及醇提物組的細(xì)胞毒性均顯著高于水提物組(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 MTT法檢測排草香提取物對MGC-803細(xì)胞的毒性結(jié)果

2.2 SRB法檢測細(xì)胞存活率結(jié)果 排草香各提取物組及紫杉醇組均對MGC-803細(xì)胞顯示出一定的毒性，經(jīng)IC50對比各組細(xì)胞毒性：紫杉醇>醚提物>醇提物>水提物；醚提物及醇提物組的細(xì)胞毒性均顯著高于水提物組(P<0.05)，與MTT法檢測結(jié)果一致，見表2、圖2。

表1 MTT法檢測各組對MGC-803細(xì)胞的毒性結(jié)果

圖2 SRB法檢測排草香提取物對MGC-803細(xì)胞的毒性結(jié)果

2.3 方法學(xué)考察測定 按“1.6.3”色譜條件測定，以木犀草素濃度(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=46 131 X+18.99 (r=0.999 9，n=7)，木犀草素的檢測濃度線性范圍為0.03～0.77 mg/mL。精密度試驗(yàn)RSD為0.17% (n=6)，儀器精密度良好，見圖3A。重復(fù)性試驗(yàn)RSD為0.32% (n=6)，目標(biāo)峰分離度較好，重復(fù)性良好，見圖3B。加樣回收試驗(yàn)平均回收率為101.13% (RSD=1.43%，n=6)。穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為0.16% (n=6)。上述結(jié)果表明，供試品制備及色譜條件穩(wěn)定可行，可供樣品含量測定。

2.4 樣品測定 以經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證的“1.6.3”色譜條件測定排草香各提取物中木犀草素的含量：醚提物>醇提物>水提物，見表3。

3 討論

排草香，又名排草、香排草、香草，商品名亦稱小葉靈香草，作為傳統(tǒng)中藥，其又具有多種藥理功效，如化痰止咳、祛風(fēng)除濕、補(bǔ)氣養(yǎng)血、緩急止痛等[5-6]。近年來，隨著對其所含化學(xué)成分及藥理藥效的深入研究表明，排草香具有較顯著的保護(hù)肝臟、抗菌、抗炎及抗腫瘤等藥理作用，其中最受研究者矚目的當(dāng)屬其抗腫瘤活性的研究，但具體抗腫瘤的活性成分目前尚不明確[7]。研究表明，排草香中所含的主要藥理活性成分為黃酮類化合物[6]，主要為黃酮醇及黃酮苷，包括山奈酚、槲皮素、香草苷1級及2級等，目前針對黃酮類化合物的抗腫瘤活性成分研究較為廣泛，張杜宇等[8]研究表明，總黃酮類化合物能顯著抑制人類乳腺癌細(xì)胞的增殖，提示其顯著的抗癌作用。孫錦秀等[9]研究表明，總黃酮具有誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用；Du等[10]研究表明，總黃酮能顯著抑制人結(jié)腸癌HT-29及SW-480細(xì)胞株的生長，均表明總黃酮具有顯著抗腫瘤活性。但針對排草香中總黃酮類抗腫瘤活性中的具體成分，目前尚不清楚。

圖3 木犀草素測定圖譜

研究表明，總黃酮中的木犀草素具有顯著的抗腫瘤活性，且其抗腫瘤作用具有多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)的特點(diǎn)[11-12]。Verschooten等[13]研究表明，木犀草素可以通過下調(diào)PLK1的表達(dá)，抑制增殖相關(guān)基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。Lee等[14]研究表明，木犀草素能通過參與誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞CH27的凋亡實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。胡春萍等[15]研究表明，木犀草素可通過誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549凋亡及阻滯G2周期實(shí)現(xiàn)抗腫瘤細(xì)胞活性。王洪燕等[16]研究表明，木犀草素與化療藥物聯(lián)合使用，能產(chǎn)生增敏效應(yīng)，提高腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，增強(qiáng)藥物抗腫瘤療效。Muthuraman等[17]采用EAC法測定細(xì)胞毒性表明，排草香醇提物具有顯著的細(xì)胞毒性。Kiruthiga等[18]研究表明，排草香醇提物能夠通過調(diào)控線粒體膜蛋白及增加活性氧誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549凋亡。本研究采用MTT法及SRB法測定排草香不同提取物組及紫杉醇組對人胃癌細(xì)胞MGC-803的細(xì)胞毒性，經(jīng)IC50對比，各組細(xì)胞毒性由高到低依次為：紫杉醇組>醚提物組>醇提物組>水提物組，且排草香醚提物及醇提物組的細(xì)胞毒性均顯著高于水提物組。兩種方法測定結(jié)果均與上述研究結(jié)果一致，提示排草香乙醇及乙醚提取物中含有某些具有抗腫瘤活性的成分。近年研究發(fā)現(xiàn)，排香草中皂苷成分同樣具有癌細(xì)胞抑制作用，LC-C單體成分對人體A-2780細(xì)胞具有顯著細(xì)胞毒作用，還可對人前列腺癌細(xì)胞PC3的生長進(jìn)行劑量和時間依賴性抑制，并具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[19]。

表2 SRB法檢測各組對MGC-803細(xì)胞的毒性結(jié)果

表3 排草香提取物中木犀草素含量測定

本文通過建立穩(wěn)定、準(zhǔn)確的HPLC法，進(jìn)行排草香水、乙醇及乙醚提取物中木犀草素含量的測定，結(jié)果表明，各提取物中木犀草素含量對比：乙醚提取物中含量最高，乙醇提取物次之，水提物中最低，與上述對人胃癌細(xì)胞MGC-803的細(xì)胞毒性作用具有較一致的趨勢，提示排草香的抗腫瘤活性可能與木犀草素含量有關(guān)，同時為抗癌藥物的研發(fā)提供一個新的方向。但本研究存在一定不足之處，即未對MGC-803的細(xì)胞毒性3種提取物中是否還含有黃酮類等其他活性成分，以及其對MGC-803細(xì)胞的毒性是否有共同作用進(jìn)行探討，今后還需擴(kuò)大黃酮類活性成分的監(jiān)測范圍，對是否含有其他活性成分等加以觀察和分析。

綜上所述，排草香乙醇提物及乙醚提取物均具有顯著的抗腫瘤活性，可能與其中木犀草素的含量有關(guān)，但具體的作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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