連紅梅，姜麗華

0 引言

卵巢癌的死亡率在婦科惡性腫瘤中居首位[1]。由于早期卵巢癌體征和癥狀不典型，而且缺乏有效的檢測手段，大多數(shù)患者發(fā)展到疾病晚期才能被診斷[2]。許多患者初次被診斷時就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移[3]。卵巢癌的治療通常包括手術(shù)治療和化療[4]，有時也會采取放射治療[5]。大部分的卵巢癌患者需要進行全面分期手術(shù)、腫瘤減滅術(shù)[6]，而術(shù)后需要補充化療的患者占比較大[7]，對于Ⅱ～Ⅳ期患者，如果殘留病灶可以切除，推薦行減瘤術(shù)。如果懷疑有無法切除的殘留病灶，可選擇直接化療6～8個療程，也可先行3個療程化療，再行全面分期手術(shù)，術(shù)后再化療[8]。隨著腫瘤治療的多樣化發(fā)展，免疫治療[9]、激素治療[10]等也越來越多地被應(yīng)用到卵巢癌的治療中，但是效果并不理想，并沒有使患者的生存率顯著提升[11]。

右美托咪定是高度選擇性的α2腎上腺素能激動劑，是一類抗焦慮、鎮(zhèn)靜、止痛類藥物[12]。與阿片類藥物和其他常用的鎮(zhèn)靜劑(如：丙泊酚、芬太尼和咪達唑侖)不同，右美托咪定能夠達到同樣的鎮(zhèn)靜效果而不引起呼吸抑制[13]。右美托咪定可以讓用藥者在鎮(zhèn)靜過程中有一定的自主呼吸，從而減少了呼吸抑制的風(fēng)險[14]。除了自身的鎮(zhèn)靜麻醉效果外，嗎啡[15]、丙泊酚[16]、咪達唑侖[17]、地西泮[18]、舒芬太尼[19]、曲馬多[20]等許多經(jīng)典的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物均具有一定的抗腫瘤作用，而右美托咪定卻鮮有研究。

本文通過卵巢癌SKOV3細胞研究右美托咪定對其細胞相關(guān)生物學(xué)行為的影響，探究右美托咪定在卵巢癌治療中的潛能，為卵巢癌的輔助治療，特別是在手術(shù)過程中和重癥監(jiān)護室中鎮(zhèn)靜麻醉藥物的選擇提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系和試劑 人卵巢癌細胞株SKOV3由上海細胞生物研究所提供。RPMI-1640培養(yǎng)液、10%新生小牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素、0.25%胰酶溶液購自Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。細胞在含有10% FBS、100 mg/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至80%左右時進行傳代和凍存，用于后續(xù)的實驗。細胞培養(yǎng)瓶和96孔板購自杭州四季慶生物工程材料有限公司。

1.2 藥物和試劑 右美托咪定購自南京萊富賽生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁研究所。Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購于上海美季生物技術(shù)有限公司。

1.3 細胞活性的測定 使用CCK-8試劑盒測定細胞的活性。將SKOV3卵巢癌細胞接種在96孔板中，每孔1×104個細胞和100 μL培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。更換新培養(yǎng)基。細胞分別以0、1、10、100 nmol/L濃度右美托咪定處理24 h。處理后，將96孔板中的培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基替換。加入20 μL的CCK-8溶液，并在37 ℃下孵育4 h。使用酶標(biāo)儀板在490 nm波長下測量不同組的OD值。

1.4 細胞凋亡實驗檢測SKOV3卵巢癌細胞的凋亡 流式細胞術(shù)FITC-Annexin V/PI雙染色是理想的定量測定細胞凋亡的方法。將SKOV3卵巢癌細胞以2×106的密度接種在6孔板中細胞/孔并生長24 h。用不同濃度(0、1、10、100 nmol/L)的右美托咪定處理24 h。加入100 μL細胞懸液5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，并將細胞在黑暗中孵育30 min。PI (5 μL，濃度為10 μg/mL)加入細胞，在黑暗中再次孵育10 min。通過流式細胞術(shù)評估細胞以識別細胞周期的變化。

1.5 劃痕愈合實驗 將SKOV3卵巢癌細胞(48 h)進行胰蛋白酶消化，并將適量細胞平鋪在6孔板上。細胞分別以0、1、10、100 nmol/L右美托咪定處理。使用200 μL無菌槍頭輕劃孔板，每個孔劃4～5次，盡量保證所劃線處于平行狀態(tài)，放置37 ℃恒溫細胞培育箱，48 h后，分別用適量PBS沖洗孔板，顯微鏡下觀察SKOV3卵巢癌細胞遷移的距離，然后對比各組之間的差異。

1.6 Transwell侵襲實驗 通過Transwell對SKOV3卵巢癌細胞侵襲能力測定。將SKOV3卵巢癌細胞在含有0.1%FBS的DMEM中培養(yǎng)。細胞分別以0、1、10、100 nmol/L右美托咪定處理。24 h后，在沒有FBS或HGF的DMEM中的2×105個饑餓過的細胞，用含有基質(zhì)膠的小室(直徑6.5 μm，孔徑8 μm，Corning，NY，USA)接種在上室中，將具有10%FBS的培養(yǎng)基置于下腔中。在37 ℃下孵育48 h后，小心去除上膜表面上的細胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結(jié)晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈后，于倒置顯微鏡下計數(shù)。獨立3次測定后取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對SKOV3細胞活性的影響 如圖1所示，在各個不同的處理時間組中，SKOV3細胞活性隨著右美托咪定濃度的上升而下降。在12 h處理組中，右美托咪定濃度達到100 nmol/L時，SKOV3細胞活性下降了9% (P<0.05)。在24 h和48 h處理組中，當(dāng)右美托咪定的濃度達到10 nmol/L，細胞活性分別下降了16%和20% (P<0.01)，當(dāng)濃度為100 nmol/L時，細胞活性下降了18%和22% (P<0.01)。結(jié)果表明，SKOV3卵巢癌細胞的生長增殖能被右美托咪定抑制，最低作用濃度是10 nmol/L，最短的作用時間是12 h。

2.2 右美托咪定誘導(dǎo)SKOV3卵巢癌細胞凋亡 應(yīng)用Annexin V-FITC和PI對細胞進行染色，再通過流式細胞學(xué)技術(shù)進行分析。如圖2所示，存活的細胞位于左下象限，而凋亡的細胞位于右下象限。隨著右美托咪定濃度的升高，凋亡細胞的百分比隨之上升。當(dāng)右美托咪定濃度達到10、100 nmol/L，凋亡率分別為8.21%、8.30%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明，右美托咪定能誘導(dǎo)SKOV3卵巢癌細胞凋亡。

圖1 不同濃度右美托咪定在不同作用時間下對SKOV3卵巢癌細胞活性的影響

2.3 劃痕愈合實驗檢測右美托咪定對SKOV3卵巢癌細胞遷移能力的影響 如圖3所示，與對照組相比，右美托咪定處理后SKOV3卵巢癌細胞的遷移能力明顯下降。此外，右美托咪定的濃度越高，遷移的速率越慢。當(dāng)用10、100 nmol/L濃度的右美托咪定處理時，SKOV3卵巢癌細胞的遷移率較對照組分別下降了12% (P<0.05)和25% (P<0.01)，表明右美托咪定能抑制SKOV3細胞遷移能力。

2.4 Transwell侵襲實驗檢測右美托咪定對SKOV3卵巢癌細胞侵襲能力的影響 如圖4所示，SKOV3卵巢癌細胞在經(jīng)過不同濃度的右美托咪定處理后，細胞的侵襲能力顯著下降，而且隨著濃度的上升，侵襲細胞的數(shù)量下降更為明顯。10、100 nmol/L右美托咪定處理時，SKOV3卵巢癌細胞的侵襲率較對照組分別下降了18%(P<0.05)和28%(P<0.01)，表明右美托咪定削弱SKOV3細胞侵襲能力。

圖2 流式細胞術(shù)檢測右美托咪定誘導(dǎo)SKOV3卵巢癌細胞凋亡

圖3 劃痕愈合實驗檢測右美托咪定對SKOV3卵巢癌細胞遷移能力的影響

圖4Transwell侵襲實驗檢測右美托咪定對SKOV3卵巢癌細胞侵襲能力的影響

3 討論

根據(jù)美國SEER的統(tǒng)計結(jié)果顯示，全球每年大約有22 240名女性被診斷為卵巢癌，其中有將近14 000名患者死于該病[21]。許多卵巢癌患者在初次診斷時就已經(jīng)處于中晚期，失去了直接手術(shù)的機會，從而開始接受以鉑類藥物為主的全程化療或新輔助化療[22]。在這些無法手術(shù)接受化療的患者中，大概有50%對一線化療藥物有效，中位生存時間為18個月[23]。而有20%～30%的患者在接受初次化療時就已經(jīng)出現(xiàn)了耐藥情況[24]。約25%的患者在初次化療后6個月病情復(fù)發(fā)，屬于鉑類耐藥[25]。

研究表明，以下藥物也具有一定的抗腫瘤效應(yīng)，如二甲雙胍[26-28]、阿司匹林[29]、米非司酮[30]等。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，地西泮能通過觸發(fā)G0/G1細胞周期停止，抑制人惡性膠質(zhì)瘤細胞GBM T98G的增生。Guo等[31]將丙泊酚作用于人食管癌(ESCC) EC-1細胞，發(fā)現(xiàn)丙泊酚是通過調(diào)節(jié)S100A4的表達來影響細胞的生物學(xué)行為。

右美托咪定已經(jīng)廣泛應(yīng)用于手術(shù)和重癥監(jiān)護室中[32]。Xia等[33]研究顯示，右美托咪定能通過激活α2腎上腺素受體/ERK信號通路來調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的生物學(xué)行為。結(jié)果表明，右美托咪定能促進乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖和遷移。Takefumi等[34]發(fā)現(xiàn)，用催眠劑量的右美托咪定處理小鼠，可使小鼠體內(nèi)抗原呈遞細胞產(chǎn)生的IL-12減少，降低抗腫瘤免疫力，導(dǎo)致Th2的轉(zhuǎn)變并削弱CTL的活性。而本研究結(jié)果顯示，右美托咪定在SKOV3卵巢癌細胞中起抑制作用。

本研究中，細胞增殖實驗結(jié)果顯示，右美托咪定能抑制SKOV3卵巢癌細胞的活性，且其對SKOV3卵巢癌細胞活性的抑制呈劑量依賴性和時間依賴性。右美托咪定100 nmol/L處理SKOV3卵巢癌細胞48 h后，細胞活性下降22%。細胞凋亡是一種使細胞發(fā)生程序性死亡的病理生理過程，目的是為了去除損壞的細胞[35]。實驗證實，卵巢癌SKOV3細胞的凋亡率隨著右美托咪定濃度的升高而升高。當(dāng)右美托咪定濃度達到10、100 nmol/L時，凋亡率分別為8.21%和8.30%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，右美托咪定能誘導(dǎo)SKOV3卵巢癌細胞凋亡。此外，右美托咪定能抑制SKOV3卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力。

但本實驗結(jié)果僅限于針對SKOV3卵巢癌細胞進行初步研究，未檢測其他卵巢癌細胞株的作用效果，并未對其機制進行深入研究，且缺乏體內(nèi)實驗證據(jù)支持。因此，右美托咪定對SKOV3卵巢癌細胞的作用機制及體內(nèi)和臨床試驗效果有待于進一步的研究。

綜上所述，右美托咪定能通過細胞凋亡抑制SKOV3卵巢癌細胞的活性，降低細胞的遷移和侵襲能力。右美托咪定在卵巢癌治療中可能具有一定的作用，可以作為手術(shù)和重癥監(jiān)護室鎮(zhèn)靜麻醉藥物的優(yōu)先選擇。

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