金 科，朱劍梅，邱發(fā)麒

0 引言

乳腺癌是指起源于乳腺導(dǎo)管內(nèi)上皮或乳腺小葉的惡性腫瘤，是全球女性最常見的惡性腫瘤，在我國，其發(fā)生率在女性惡性腫瘤中居首位，其死亡率排在第6位[1-2]。國際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer，IARC)報(bào)道，2012年全球乳腺癌新發(fā)病例超過120萬，標(biāo)化發(fā)病率為37.68/100 000，標(biāo)化死亡率為13.51/100 000；我國每年新增約 21 萬乳腺癌患者，略高于發(fā)達(dá)國家(1%～2%)，而我國乳腺癌標(biāo)化發(fā)病率以及標(biāo)化死亡率約為16.36/100 000和4.51/100 000，為全球最低[3-5]。近年來，我國乳腺癌發(fā)病率逐年上升，上海、北京、天津及沿海地區(qū)為高發(fā)區(qū)，流行趨勢明顯改變?yōu)槌鞘懈哂谵r(nóng)村，沿海地區(qū)高于內(nèi)地。乳腺癌嚴(yán)重影響了患者的生活及生存質(zhì)量，因此，對乳腺癌發(fā)病機(jī)制及治療藥物的研究尤為重要[6]。磷酸肌醇3-激酶γ (Phosphatidylinositide 3-kinaseγ，PI3Kγ)是Ras基因調(diào)控的下游靶位點(diǎn)，其在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7]。有報(bào)道，Ras通過一系列級聯(lián)反應(yīng)，磷酸化PI3Kγ，后者可直接參與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移。作為一種高選擇性的PI3Kγ抑制劑，AS605240能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長，且其在細(xì)胞凋亡、慢性炎癥、血管生成過程中均發(fā)揮重要作用。5-氟尿嘧啶為常規(guī)的乳腺癌化療藥物[8-9]。Ki-67、cyc D1、β-catenin蛋白是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期、參與腫瘤增殖的重要細(xì)胞因子，而VEGF、p53蛋白與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。因此，本研究擬以PI3Kγ抑制劑AS605240與5-氟尿嘧啶聯(lián)合作用于小鼠乳腺癌細(xì)胞，分析細(xì)胞因子的改變，探討其對小鼠乳腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的影響，為乳腺癌的臨床治療提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源、儀器與試劑 小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫)、DnJ-4249 CO2培養(yǎng)箱(美國 REVCO公司)、DMEM 培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技中國有限公司)、胰酶(美國 Gibco公司)、四甲基偶氮唑藍(lán)(北京廣源恒信科技發(fā)展有限公司)、胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司)、Ki-67蛋白、cyc D1蛋白、β-catenin蛋白ELISA試劑盒(上海伯豪生物技術(shù)有限公司)，VEGF蛋白、p53蛋白、CD31蛋白ELISA試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)、DMI3000 B倒置顯微鏡(德國 LEICA公司)、MK3酶標(biāo)儀(美國 Thermo公司)、恒溫培養(yǎng)箱grp-9080(美國通用公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技中國有限公司)、超凈工作臺(上海恒躍醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)及其分組設(shè)計(jì) 小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1培養(yǎng)方法：將裝有小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1細(xì)胞株的凍存管從液氮中取出，37 ℃水浴箱迅速解凍，無菌吸管吸取菌液至5 mL EPP無菌管中，1 500 r/min離心5 min，上清液吸棄，加入pH值為7.2的含10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/mL、青霉素100 μg/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基，直至5 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，3 d換液，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)，用0.5%胰蛋白酶消化傳代。對照組：取10 mL小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1細(xì)胞液(細(xì)胞濃度為5×106/mL)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2、20% O2)；5-氟尿嘧啶組、PI3Kγ抑制劑組、聯(lián)合組的培養(yǎng)方法同對照組，其10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液分別含有10 μg/mL的5-氟尿嘧啶、10 μmol/mL的PI3Kγ抑制劑AS605240，以及10 μg/mL 5-氟尿嘧啶+10 μmol/mL PI3Kγ抑制劑AS605240。

1.3 小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1細(xì)胞活力的MTT法檢測 染毒結(jié)束后，每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 10 μL，37 ℃孵育4 h，每孔加入150 μL的OMSO，采用酶標(biāo)儀于490 nm處波長測定吸光度(A)值。

1.4 小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1細(xì)胞Ki-67、cycD1、β-catenin、VEGF、p53、CD31蛋白水平測定 染毒結(jié)束后，5 000 r/min 離心收集細(xì)胞，加入PBS制成細(xì)胞懸液后，酶聯(lián)免疫吸附法測定培養(yǎng)液中Ki-67、cyc D1、β-catenin、VEGF、p53、CD31蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 各組乳腺癌細(xì)胞存活情況比較 5-氟尿嘧啶組、PI3Kγ抑制劑組、聯(lián)合組的OD值、存活率(%)均低于對照組(t=11.86、9.40、10.23、9.98、12.56、13.33，P<0.05)；聯(lián)合組的OD值、存活率(%)低于5-氟尿嘧啶組、PI3Kγ抑制劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.44、10.37、14.12、12.09，P<0.05)；5-氟尿嘧啶組的OD值、存活率與PI3Kγ抑制劑組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.13、0.98，P>0.05)，見表1。

表1 各組乳腺癌細(xì)胞存活情況比較

2.2 各組乳腺癌細(xì)胞增殖情況比較 5-氟尿嘧啶組、PI3Kγ抑制劑組、聯(lián)合組的Ki-67、cyc D1、β-catenin蛋白水平均低于對照組(t=16.45、19.68、15.29、16.67、18.77、17.56、17.54、18.78、17.99，P<0.05)；聯(lián)合組Ki-67、cyc D1、β-catenin蛋白水平低于5-氟尿嘧啶組、PI3Kγ抑制劑組(t=18.45、17.88、19.36、16.90、18.06、17.08，P<0.05)；5-氟尿嘧啶組Ki-67、cyc D1、β-catenin與PI3Kγ抑制劑組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.13、2.65、0.65，P>0.05)，見表2。

2.3 各組乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況比較 5-氟尿嘧啶組、PI3Kγ抑制劑組、聯(lián)合組的VEGF蛋白水平低于對照組，p53蛋白水平高于對照組(t=17.67、19.65、18.26、19.28、19.24、16.90，P<0.05)；聯(lián)合組VEGF蛋白水平低于5-氟尿嘧啶組、PI3Kγ抑制劑組，p53蛋白水平高于5-氟尿嘧啶組、PI3Kγ抑制劑組(t=19.24、21.79、18.37、19.49，P<0.05)；5-氟尿嘧啶組VEGF、P53與PI3Kγ抑制劑組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.76、2.59，P>0.05)，見表3。

表2 各組乳腺癌細(xì)胞增殖情況比較(μmol/L)

表3 各組乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況比較(μmol/L)

3 討論

作為代表細(xì)胞增殖水平的細(xì)胞核的標(biāo)記物，位于10q25的Ki-67基因及其所編碼的蛋白被認(rèn)為與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)[11]。在細(xì)胞分裂中，Ki-67于G1后期出現(xiàn)，在S、G2期逐漸升高，并于M期達(dá)到頂峰值。Ki-67精確調(diào)控惡性腫瘤的增殖、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，是細(xì)胞增殖、完成細(xì)胞周期不可或缺的，也是檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)之一。

cyc D1是明確的原癌基因，也是細(xì)胞周期素蛋白家族的重要組成成員，其通過作用于G1期，促進(jìn)G1向S期正向轉(zhuǎn)換，并以細(xì)胞周期素核編碼區(qū)與CDK4/6結(jié)合，形成cyc D1-CDK4或cyc D1-CDK6復(fù)合物，此復(fù)合物是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖周期的關(guān)鍵蛋白[12]。國內(nèi)外研究表明，在腫瘤的增殖、發(fā)生過程中，cyc D1基因均高度異常表達(dá)，而對鱗癌和腺癌中cyc D1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，均有染色體重排、基因拷貝數(shù)增加及基因多態(tài)性的存在。

β-catenin是Wnt信號途徑的重要核心信號分子，在正常細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin水平很低，不足以激活信號通路中的相關(guān)細(xì)胞因子，當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)，細(xì)胞外的Wnt分子與癌前激活物結(jié)合，β-catenin在胞質(zhì)中積累和向核內(nèi)轉(zhuǎn)移成為經(jīng)典Wnt信號途徑激活的重要標(biāo)志，當(dāng)Wnt 通路被激活后，細(xì)胞隨即惡性增殖[13-14]。此外，PI3K通路中的3-磷酸肌醇激酶也可以磷酸化β-catenin，形成β-catenin/APC復(fù)合體，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展[15]。

本研究結(jié)果表明，PI3Kγ抑制劑、5-氟尿嘧啶能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與細(xì)胞周期的調(diào)控及Wnt-β-catenin信號通路的抑制有關(guān)。

VEGF是血管發(fā)生和祖內(nèi)皮細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，也是血管內(nèi)皮細(xì)胞作用唯一特異的有絲分裂原，促進(jìn)其增殖，抑制其凋亡[16-17]。在腫瘤的發(fā)展過程中，VEGF與酪氨酸受體相互作用，啟動信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致受體二聚化和自身磷酸化，激活大量下游蛋白，如3-磷酸肌醇激酶。大量研究表明，VEGF與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[18]。p53基因?yàn)槊鞔_的抑癌基因，p53可誘導(dǎo)細(xì)胞停滯于G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化與衰老，抑制腫瘤血管增生等，此外，p53與腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果表明，PI3Kγ抑制劑、5-氟尿嘧啶能明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與VEGF的抑制與p53的促進(jìn)表達(dá)有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，PI3Kγ抑制劑AS605240與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對小鼠乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制性更好。

綜上所述，PI3Kγ抑制劑AS605240與5-氟尿嘧啶聯(lián)合作用，能明顯抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與細(xì)胞周期、p53蛋白的調(diào)控以及Wnt-β-catenin信號通路、VEGF的抑制有關(guān)。

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