，， ， ，，， (.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 四川 成都 60500；.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，四川 成都 60500)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)病率位居我國惡性腫瘤前列，而肝炎-肝硬化-肝癌這一序貫步驟的發(fā)生使得肝癌的發(fā)病基礎(chǔ)極其廣泛。由于肝癌在發(fā)病初期臨床癥狀不明顯，易被忽視，就診時多已到晚期，已發(fā)生癌旁和遠(yuǎn)處器官的侵襲轉(zhuǎn)移。晚期肝癌的治療和預(yù)后很差，且肝癌術(shù)后極易發(fā)生轉(zhuǎn)移和再復(fù)發(fā)[1]。因此，肝癌遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制研究一直是肝癌領(lǐng)域研究熱點。惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展依賴于其特定的微環(huán)境，而腫瘤局部的缺血缺氧是構(gòu)成微環(huán)境的一部分[2]。缺氧微環(huán)境在多種惡性腫瘤的遠(yuǎn)處侵襲和遷移中扮演重要角色，但是其如何發(fā)揮作用目前鮮有報道。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)指惡性腫瘤上皮細(xì)胞在體內(nèi)外多種刺激因素的長期作用下，通過啟動特定程序來使上皮表型細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞的復(fù)雜過程[3-4]。EMT程序的異常激活與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)。研究表明，EMT過程受多個轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中Twist作為EMT 啟動的關(guān)鍵調(diào)控因子，也參與了多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[5-6]。本研究旨在體外模擬缺氧條件下Twist基因的表達(dá)變化及其對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞EMT過程的調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株購自深圳賽恩斯細(xì)胞科技有限公司；TRIzol RNA 提取試劑購自日本寶生物；本研究所用PCR引物的設(shè)計與合成均委托天津拜恩斯瑞生物科技公司完成；多克隆兔抗人HIF-1α、E-cadherin、Vimentin、Twist1和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠或抗兔IgG購自上海瑞伊和源生物科技公司；中分子量Protein marker 購自Thermo Fisher公司；ECL超敏型化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海百谷歌生物科技公司；胎牛血清購自GIBCO 公司；DMEM-H培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司； 0.45 mm PVDF膜購自美國Millipore公司；6孔板、25 cm2塑料培養(yǎng)瓶以及24孔Transwell小室(孔徑8 μm)均購自海貍生物科技有限公司；Transwell小室侵襲實驗所用細(xì)胞級基質(zhì)膠(Matrigel)購自湖南佳浩能生物科技公司；Co170R-230-0200三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱(用于模擬缺氧細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境)購自德國Eppendorf公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞使用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM-H培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于5%CO2濃度37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)48 h之后，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，隨后取狀態(tài)較好且處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。細(xì)胞分別在常氧和低氧條件下培養(yǎng)24 h，隨后進(jìn)行相關(guān)實驗檢測。為了研究Twist基因的作用，我們進(jìn)一步分為低氧組、低氧下轉(zhuǎn)染si NC組以及低氧下轉(zhuǎn)染Twist組。

1.3 siRNA的設(shè)計、合成和目的基因的轉(zhuǎn)染

Twist siRNA干擾片段由廣州銳博生物有限公司設(shè)計合成，設(shè)計3條針對Twist基因的特異siRNA，其序列如下：siRNA1靶序列：5’-CCTCTGCATTCTGATAGAA-3’，siRNA2靶序列：5’-AAGAGGTGGATATGTCTGG-3’，siRNA3靶序列：5’-GCTGAAACATGCAGTTGTA-3’；及1條無義干擾序列siN05815122147-1-5作為陰性對照組。轉(zhuǎn)染siRNA實驗分為空白對照組(細(xì)胞中除培養(yǎng)液外不加任何試劑)、陰性對照組(細(xì)胞中加入細(xì)胞培養(yǎng)液、NC-siRNA、轉(zhuǎn)染試劑)和干擾組(細(xì)胞中加入細(xì)胞培養(yǎng)液、siRNA Twist轉(zhuǎn)染試劑)。轉(zhuǎn)染前1 d，將對數(shù)生長期的細(xì)胞按2×105個/孔的細(xì)胞密度接種6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)40%～50%時，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實驗。37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h 或48 h 后于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。細(xì)胞轉(zhuǎn)染率(%)=轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)

β-actin引物序列:上游5’-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3’,下游5’-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3’；HIF-1α引物序列:上游5’-AGCTTCCAGACACGCTATCAT-3’,下游5’-CGGTACAACGAGCTGTTTCTAC-3’E-cadherin 引物序列:上游5’-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT-3’,下游5’-TCCCAGGCGTAGACCAAGA-3’；Vimentin引物序列:上游5’-AGTCCACTGAGTACCGGAGAC-3’,下游5’-CATTTCACGCATCTGGCGTTC-3’。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性20 s,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s。

1.5 Western blot檢測

將已處理好的SMMC-7721細(xì)胞系用PBS洗滌3次，隨后加入RIPA裂解液并用細(xì)胞刮刀刮下放入1.5 mL EP管中冰上裂解30 min。隨后于12 000 r/min離心10 min并將蛋白上清液凍存于-20 ℃。使用5x蛋白上樣緩沖液混勻蛋白上清后于95 ℃中加熱10 min，待其充分變性。上機(jī)跑電泳，隨后轉(zhuǎn)膜并置于5%脫脂牛奶中封閉1 h。封閉結(jié)束后使用TBST洗膜3次，每次5 min，隨后將膜置于多克隆兔抗人的β-catenin(濃度1∶1 000)和多克隆兔抗人β-actin(濃度1∶3 000)中4 ℃孵育過夜。次日，洗膜3次，每次5 min，置于辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG中室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，每次5 min，采用ECL化學(xué)發(fā)光法金鼎顯影。應(yīng)用Quantity One軟件分析條帶灰度值并作統(tǒng)計分析。

1.6 腫瘤細(xì)胞侵襲實驗

將Matrigel膠 (Matrigel原液與無血清培養(yǎng)基之比為1∶3鋪在小室上面，置于37 ℃培養(yǎng)箱中待用。將SMMC-7721細(xì)胞系在無血清DMEM培養(yǎng)基中饑餓處理4 h后，將其消化、重懸。上室加入無血清細(xì)胞懸液200 μL(細(xì)胞量4×105/mL)，下室加入含20%FBS的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔600 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。處理完成后取出小室，用PBS洗滌3次，并用濕棉簽輕柔擦除上室面的細(xì)胞，隨后置于4%多聚甲醛中固定20 min。取出室溫下風(fēng)干3～5 min，隨后置于結(jié)晶紫染料中染色15 min。最后用PBS洗滌3次，并置于倒置顯微鏡下觀察穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 低氧條件下肝癌SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

在常氧環(huán)境下，肝癌SMMC-7721細(xì)胞呈典型上皮細(xì)胞樣形態(tài)，各個細(xì)胞之間排列緊密，相互連接。在低氧環(huán)境下刺激24 h之后，低氧組中細(xì)胞極性消失，由連接緊密的扁平狀上皮形態(tài)逐漸變成連接松散的長梭形狹長形態(tài)細(xì)胞，細(xì)胞排列分散，呈現(xiàn)游走狀態(tài)(圖1)。

2.2 低氧微環(huán)境誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞EMT發(fā)生

肝癌SMMC-7721細(xì)胞在常氧條件和低氧條件下培養(yǎng)24 h之后，RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，與常氧培養(yǎng)組相比，低氧處理組中SMMC-7721細(xì)胞的上皮表型蛋白E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，而間質(zhì)表型蛋白Vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，同時伴有低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的顯著上調(diào)(圖2、3)。

a:常氧環(huán)境下SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)；b：低氧環(huán)境下SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)

圖1低氧微環(huán)境誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞EMT(×400)

2.3 低氧微環(huán)境增強(qiáng)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的體外侵襲能力

經(jīng)過常氧和低氧環(huán)境下分別處理24 h后，與常氧組相比，低氧處理組SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)(圖4)。

2.4 沉默Twist1表達(dá)抑制低氧誘導(dǎo)的EMT

通過使用Twist1靶向沉默siRNA來抑制其表達(dá)，進(jìn)一步檢測Twist1在低氧誘導(dǎo)的EMT中的作用。RT-PCR和Western blot結(jié)果表明，靶向沉默Twist后，低氧微環(huán)境誘導(dǎo)的EMT過程被顯著逆轉(zhuǎn)，伴隨著E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平的表達(dá)增高和Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)水平表達(dá)下降(圖5、6)。

2.5 沉默Twist1表達(dá)減弱低氧誘導(dǎo)的體外侵襲能力

在Transwell小室侵襲實驗中，發(fā)現(xiàn)在使用Twist1靶向沉默siRNA阻斷其表達(dá)后，低氧培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力被顯著削弱(圖7)。

a：HIF-1α mRNA表達(dá)；b：E-cadherin mRNA表達(dá)；c：Vimentin mRNA表達(dá) #：P<0.01圖2 RT-PCR結(jié)果定量分析

a：Western blot檢測HIF-1α、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)；b、c、d：Western blot結(jié)果定量分析 #：P<0.01圖3 Western blot檢測HIF-1α、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

a：常氧組；b:低氧組；c：侵襲能力統(tǒng)計分析柱狀圖 #：P<0.01圖4 低氧微環(huán)境增強(qiáng)肝癌SMMC-7221細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色 ×200)

a：Twist mRNA相對表達(dá)水平；b:E-cadherin mRNA相對表達(dá)水平；c:Vimentin mRNA相對表達(dá)水平 *:P<0.05; #:P<0.01圖5 RT-PCR定量分析Twist、E-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)

a:Western blot檢測Twist、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)；b、c、d:Western blot結(jié)果定量分析 *:P<0.05; #:P<0.01圖6 Western blot檢測Twist、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

a：低氧組；b：低氧+si NC組;c：低氧+si Twist組；d:Transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲能力定量分析 #:P<0.01圖7 Transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色 ×200)

3 討論

惡性腫瘤最主要的特征是浸潤和遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移,既往研究表明約90%的癌癥患者死于惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。肝細(xì)胞癌作為一種快速生長的惡性腫瘤，血供極其豐富，早期便有高度的血管侵犯和轉(zhuǎn)移能力,導(dǎo)致60%～80%的患者診斷時即為肝癌晚期，且根治性切除機(jī)會極少，從而喪失了治療機(jī)會[7]。實體瘤在生長過程中由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖，而局部新生血管形成相對滯后，使得局部腫瘤組織的血液供應(yīng)不足，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞處于缺血缺氧微環(huán)境[8-9]。低氧作為腫瘤微環(huán)境的基本特征，同時也參與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、增殖、凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)控[10-12]。作為最常見的實體瘤，原發(fā)性肝癌的生長異常迅速，使得局部腫瘤細(xì)胞處于缺氧微環(huán)境中，尤以巨塊型肝癌最常見。既往研究表明，原發(fā)性肝癌組織中低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)表達(dá)水平顯著升高，并與臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[13-14]。此外，原發(fā)性肝癌組織中處于慢性缺氧環(huán)境下的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而EMT過程的啟動可能在其中起著關(guān)鍵作用[15-16]。

EMT是一個高度保守的過程，其通過特定程序使具有黏附形態(tài)的上皮細(xì)胞極性消失、失去細(xì)胞間緊密連接，并突破基底膜成為侵襲能力更強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞。EMT過程不僅參與胚胎形態(tài)的形成、多種組織器官的發(fā)育以及慢性退行性纖維化變，而且在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中也扮演重要角色[17]。EMT的發(fā)生常伴隨著上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物E-cadherin的下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物Vimentin的上調(diào)[18]。研究證實，多種因素能夠誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，而低氧微環(huán)境是重要的EMT誘導(dǎo)因素之一[19]。局部缺血缺氧微環(huán)境能引起卵巢癌[20]、前列腺癌[21]等多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT特征的轉(zhuǎn)變，提高其侵襲轉(zhuǎn)移能力。

Twist是一類新發(fā)現(xiàn)的癌基因，主要參與細(xì)胞分化和胚胎的發(fā)育過程，也是EMT 過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[22-23]。研究證實，Twist與臨床上多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密聯(lián)系，包括乳腺癌[24]、前列腺癌[25]、胃癌[26]以及肝癌[27]等，這些研究均顯示Twist在這些腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。另有研究表明，在腫瘤缺氧條件下存在Twist基因的異常激活，其通過調(diào)控下游靶基因?qū)σ幌盗兄T如細(xì)胞凋亡、增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)事件進(jìn)行干預(yù)，最終影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[28-29]。但是在低氧微環(huán)境下Twist基因在肝細(xì)胞癌EMT中的中的作用及其調(diào)控機(jī)制目前鮮有報道。

本實驗中，我們首先將SMMC-7721細(xì)胞分別在常氧和低氧環(huán)境下培養(yǎng)，并采用RT-PCR和Western blot技術(shù)驗證了體外低氧微環(huán)境是否能夠誘導(dǎo)SMMC-7721 細(xì)胞EMT的發(fā)生。結(jié)果表明，與常氧對照組相比，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后的，SMMC-7721 細(xì)胞的形態(tài)由最初的多邊形向成纖維樣細(xì)胞形態(tài)改變，呈長梭形、紡錘狀。同時并伴隨著上皮表型蛋白E-cadherin表達(dá)的下降和間質(zhì)表型蛋白Vimentin表達(dá)的升高。Transwell結(jié)果也證實低氧刺激后發(fā)生EMT的SMMC-7721 細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲潛能。接下來我們進(jìn)一步對EMT的關(guān)鍵調(diào)控基因Twist進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后SMMC-7721 細(xì)胞中Twist基因顯著激活，提示其可能參與低氧環(huán)境下SMMC-7721 細(xì)胞EMT過程。為了明確Twist基因在其中的作用機(jī)制，我們通過特異性Twist si-RNA來靶向沉默阻斷其表達(dá)，并進(jìn)一步檢測其對細(xì)胞EMT啟動和侵襲能力影響。研究發(fā)現(xiàn)，在靶向沉默Twist基因之后，低氧介導(dǎo)的SMMC-7721 細(xì)胞EMT過程和侵襲現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)，表明Twist基因在這一過程中起著關(guān)鍵作用。基于以上研究，我們推測低氧微環(huán)境通過激活Twist基因來調(diào)控SMMC-7721 細(xì)胞EMT過程和體外侵襲轉(zhuǎn)移，最終促進(jìn)肝癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。

綜上所述，本研究初步證實在肝癌SMMC-7721 細(xì)胞中低氧微環(huán)境能夠通過激活Twist基因來誘導(dǎo)EMT的發(fā)生和腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，深入研究Twist基因在肝癌EMT過程中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，通過靶向阻斷Twist基因，從而逆轉(zhuǎn)EMT過程并抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，這將為肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)防和特異性治療提供新的思路和理論依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Schlachterman A,Craft WWJr.,Hilgenfeldt E,et al.Current and future treatments for hepatocellular carcinoma[J].World J gastroenterolo,2015,21(28):8478-8491.doi:10.3748/wjg.v21.i28.8478.

[2] Manoochehri Khoshinani H,Afshar S,Najafi R.Hypoxia:A double-edged sword in cancer therapy[J].Cancer Invest,2016,34(10):536-545.doi:10.1080/07357907.2016.1245317.

[3] Chen T,You Y,Jiang H,et al.Epithelial-mesenchymal transition(EMT):a biological process in the development,stem cell differentiation and tumorigenesis[J].J cell physiol,2017,12(13):341-322.doi:10.1002/jcp.25797.

[4] Smith BN,Bhowmick NA.Role of EMT in metastasis and therapy resistance[J].J Clin Med,2016,5(2):12-17.doi:10.3390/jcm5020017.

[5] Yang J,Hou Y,Zhou M,et al.Twist induces epithelial-mesenchymal transition and cell motility in breast cancer via ITGB1-FAK/ILK signaling axis and its associated downstream network[J].Int J Biochem Cell Biol,2016,71:62-71.doi:10.1016/j.biocel.2015.12.004.

[6] Yao C,Li P,Song H,et al.CXCL12/CXCR4 axis upregulates twist to induce EMT in human glioblastoma[J].Mol Neurobiol,2016,53(6):3948-3953.doi:10.1007/s12035-015-9340-x.

[7] Hu B,An HM,Wang SS,et al.Preventive and therapeutic effects of chinese herbal compounds against hepatocellular carcinoma[J].Molecules,2016,21(2):142.doi:10.3390/molecules21020142.

[8] Chiche J,Ricci JE,Pouyssegur J.Tumor hypoxia and metabolism-towards novel anticancer approaches[J].Ann Endocrinol,2013,74(2):111-114.doi 10.1016/j.ando.2013.02.004.

[9] Voss M J,Niggemann B,Zanker K S,et al.Tumour reactions to hypoxia[J].Curr Mol Med,2010,10(4):381-386.doi:10.2174/156652410791317020.

[10] Zhang Y,Liu Q,Wang F,et al.Melatonin antagonizes hypoxia-mediated glioblastoma cell migration and invasion via inhibition of HIF-1alpha[J].J Pineal Res,2013,55(2):121-130.doi:10.1111/jpi.12052.

[11] Wang L,Wu B,Zhang Y,et al.Hypoxia promotes the proliferation of MC3T3-E1 cells via the hypoxia-inducible factor-1alpha signaling pathway[J].Mol Med Rep,2015,12(4):5267-5273.doi:10.3892/mmr.2015.4034.

[12] Wang X,Li J,Wu D,et al.Hypoxia promotes apoptosis of neuronal cells through hypoxia-inducible factor-1alpha-microRNA-204-B-cell lymphoma-2 pathway[J].Exp l Biol Med,2016,241(2):177-183.doi:10.1177/1535370215600548.

[13] Luo D,Wang Z,Wu J,et al.The role of hypoxia inducible factor-1 in hepatocellular carcinoma[J].Bio Med Res Int,2014,4(1):427-431.doi:10.1155/2014/409272.

[14] Yao DF,Jiang H,Yao M,et al.Quantitative analysis of hepatic hypoxia-inducible factor-1alpha and its abnormal gene expression during the formation of hepatocellular carcinoma[J].HBPD Int,2009,8(4):407-413.

[15] Meng FD,Wei JC,Qu K,et al.FoxM1 overexpression promotes epithelial-mesenchymal transition and metastasis of hepatocellular carcinoma[J].World J gastroenterol,2015,21(1):196-213.doi:10.3748/wjg.v21.i1.196.

[16] Mima K,Hayashi H,Imai K,et al.High CD44s expression is associated with the EMT expression profile and intrahepatic dissemination of hepatocellular carcinoma after local ablation therapy[J].J Hepato Bil Pan Sci,2013,20(4):429-434.doi:10.1007/s00534-012-0580-0.

[17] Yoshida GJ.Emerging role of epithelial-mesenchymal transition in hepatic cancer[J].J Exp Clin Cancers Res,2016,35(1):141.doi:10.1186/s13046-016-0419-7.

[18] Davis FM,Stewart TA,Thompson EW,et al.Targeting EMT in cancer:opportunities for pharmacological intervention[J].Trends Pharmacol Sci,2014,35(9):479-488.doi:10.1016/j.tips.2014.06.006.

[19] Jiang J,Tang YL,Liang XH.EMT:a new vision of hypoxia promoting cancer progression[J].Cancer Biol Ther,2011,11(8):714-723.doi:10.4161/cbt.11.8.15274.

[20] Du J,Sun B,Zhao X,et al.Hypoxia promotes vasculogenic mimicry formation by inducing epithelial-mesenchymal transition in ovarian carcinoma[J].Gynecol Oncol,2014,133(3):575-583.doi:10.1016/j.ygyno.2014.02.034.

[21] Li W,Dong Y,Zhang B,et al.PEBP4 silencing inhibits hypoxia-induced epithelial-to-mesenchymal transition in prostate cancer cells[J].Biomed pharmacother,2016,81:1-6.doi:10.1016/j.biopha.2016.03.030.

[22] Khan MA,Chen HC,Zhang D,et al.Twist:a molecular target in cancer therapeutics[J].Tumor Biol,2013,34(5):2497-2506.doi:10.1007/s13277-013-1002-x.

[23] Wushou A,Hou J,Zhao YJ,et al.Twist-1 up-regulation in carcinoma correlates to poor survival[J].Int J mol Sci,2014,15(12):21621-21630.doi:10.3390/ijms151221621.

[24] Grzegrzolka J,Biala M,Wojtyra P,et al.Expression of EMT markers SLUG and TWIST in breast cancer[J].Anticancer Res,2015,35(7):3961-3968.

[25] Gajula RP,Chettiar ST,Williams RD,et al.The twist box domain is required for Twist1-induced prostate cancer metastasis [J].Mol Cancer Res,2013,11(11):1387-1400.doi:10.1158/1541-7786.MCR-13-0218-T

[26] Liu AN,Zhu ZH,Chang SJ,et al.Twist expression associated with the epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer [J].Mol Cell Biochem,2012,367(1-2):195-203.doi:10.1007/s11010-012-1333-8

[27] Matsuo N,Shiraha H,Fujikawa T,et al.Twist expression promotes migration and invasion in hepatocellular carcinoma [J].Mol Cell Biochem,2009,18,9:240.doi:10.1186/1471-2407-9-240

[28] Glackin CA.Targeting the Twist and Wnt signaling pathways in metastatic breast cancer [J].Maturitas,2014,79(1):48-51.doi:10.1016/j.maturitas.2014.06.015.

[29] Tseng JC,Chen HF,Wu KJ.A twist tale of cancer metastasis and tumor angiogenesis [J].Histol histopathol,2015,30(11):1283-1294.doi:10.14670/HH-11-638.