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        漢中天麻多糖抗菌活性研究

        2018-06-29 05:07:08李鑫鑫付昀東鄭紅星吳三橋李曉東
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年11期
        關(guān)鍵詞:革蘭氏天麻多糖

        陳 琛, 李鑫鑫, 付昀東, 劉 祥, 鄭紅星, 吳三橋, 李曉東

        (1.陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所/陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心/陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西漢中 723000; 2.陜西省略陽縣中藥材技術(shù)推廣服務(wù)中心,陜西略陽 724300)

        天麻(GastrodiaelataBl.)別稱赤箭、定風(fēng)草、水洋芋等,為蘭科天麻屬與密環(huán)菌特殊共生的多年生草本植物,屬國家三級保護物種,是一種名貴的中藥材,藥用部位為其塊莖[1],其味甘、性平,具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功能,用于治療頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇、抽搐、破傷風(fēng)等病癥[2],同時具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、增強免疫等作用[3-9]。天麻中主要含有天麻素、天麻苷元、天麻多糖等多種成分[10-11],其中天麻多糖含量高達25%[12]。

        多糖是由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的一種天然大分子化合物,其種類繁多,廣泛存在于動物、植物、微生物中,目前對植物多糖和微生物多糖的研究較多。大量研究表明,多糖具有多種藥理活性,如增強機體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗輻射和抗衰老等作用[13-14]。通過中國知網(wǎng)(China National Knowledge Infrastructure,簡稱CNKI)和美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,簡稱NCBI)檢索發(fā)現(xiàn),目前關(guān)于天麻多糖的研究主要集中在天麻多糖的提取工藝優(yōu)化、天麻多糖的分離純化、分子組成分析及結(jié)構(gòu)表征、天麻多糖的增強免疫作用、改善睡眠等方面,未見有關(guān)天麻多糖的抗菌活性的研究報道。因此,本試驗以漢中天麻為研究對象,從天麻塊莖中提取多糖并研究抗菌活性,為其進一步開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 供試藥材

        鮮天麻,2016年11月采集于陜西省漢中市略陽縣。

        1.2 供試菌株

        選取的40株菌株中革蘭氏陰性菌(G-)20株、革蘭氏陽性菌(G+)12株、真菌8株。40株菌株中標準菌株庫菌株2株,臨床分離致病菌38株。菌株由大連理工大學(xué)生命科學(xué)院于海寧教授、蘇州大學(xué)藥學(xué)院王義鵬副教授提供,具體見表1。

        表1 試驗所用菌株

        注:肺克桿菌即肺炎克雷伯桿菌。下同。

        1.3 主要試劑

        酵母浸粉購自英國OXOID公司;葡萄糖標準品來自中國食品藥品檢定研究院;蛋白胨購自索萊寶科技有限公司;雙氧水、95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、硫酸均為國產(chǎn)分析純。

        1.4 儀器與設(shè)備

        臺式離心機Rotina 420R購自德國Hettich公司;酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司;紫外分光光度計4802S購自尤尼柯上海儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RV10購自德國IKA公司;722G可見分光光度計購自上海儀電分析儀器有限公司;真空恒溫干燥箱購自上海實驗儀器廠有限公司;冷凍干燥機LGJ-10D購自北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

        1.5 新鮮材料預(yù)處理

        鮮天麻采收后當天洗凈泥沙,常壓蒸煮30 min,冷卻,切片,105 ℃烘干,粉碎,過40目篩得到天麻粉末[15]。

        1.6 天麻多糖提取

        精確稱取干天麻40 g,以水作為提取液,按照液料比 45 mL ∶1 g,在66 ℃下超聲提取34 min,在4 500 r/min下離心 20 min,減壓濃縮至1/5,收集上清液用雙氧水進行脫色[16],以濃氨水(或氫氧化鈉溶液)調(diào)節(jié)pH值至8.0左右,50 ℃以下滴加雙氧水至淺黃色,低溫放置2 h。然后緩慢加入5倍量的95%乙醇,邊加邊攪拌后置于4 ℃冰箱沉淀 24 h,離心過濾后取出沉淀物,并分別用乙醚、石油醚、無水乙醇于 4 500 r/min 離心6 min進行洗滌,轉(zhuǎn)入真空干燥箱,在 45 ℃、0.08 kPa 下干燥[17-18]。

        1.7 多糖含量測定

        以葡萄糖為對照物,用苯酚-硫酸法[19]測定多糖含量,以葡萄糖濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標,得線性回歸方程y=0.062 6x+0.114 6,r2=0.999 1。

        1.8 薄層瓊脂糖孔穴擴散法

        采用薄層瓊脂糖孔穴擴散法[20]定性測定天麻多糖抗菌活性。將稀釋后含2×105CFU/mL的菌液均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基表面,將經(jīng)過滅菌的直徑為6 mm的濾紙片置于培養(yǎng)基表面,滴加6 μL待測樣品溶液,于37 ℃培養(yǎng)18~20 h,觀察抑菌圈形成與否,有抑菌圈形成的表明有抑菌活性,抑菌圈的大小可以衡量抑菌活性的強弱。各設(shè)3個重復(fù),用十字交叉法測量抑菌圈直徑,取平均值。有抑菌圈的進一步采用常量肉湯稀釋法定量測定最小抑菌濃度。

        抑菌效果判斷標準:以抑菌圈直徑>20 mm為極敏(++++),抑菌圈直徑在15~20 mm之間為高敏(+++),抑菌圈直徑在10~14 mm之間為中敏(++),抑菌圈直徑<10 mm 為低敏(+),8 mm即無抑菌圈(-)[21]。

        1.9 微量肉湯稀釋法

        采用微量肉湯稀釋法定量測定天麻多糖對各種菌株的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,簡稱MIC)。MIC測定采用Wiegand等建立的方法[22-24]并加以改進。將細菌接種于LB固體培養(yǎng)基上,于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待菌落長出后,用接種環(huán)挑取單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期,調(diào)整菌液濃度為2×105CFU/mL。在無菌環(huán)境下操作,在無菌96孔板上第1孔中加90 μL MH液體培養(yǎng)基,第2~11孔中加入50 μL MH液體培養(yǎng)基。第1孔中再加入待測樣品10 μL,充分混勻后取 50 μL 加入第2孔,依次倍比稀釋,從第10孔吸出50 μL棄去,在第11孔加50 μL菌液(不加樣品)作為對照,在第12孔加50 μL MH肉湯。混勻后放置于37 ℃ 、150 r/min培養(yǎng)6~8 h,于600 nm波長處測定吸光度。MIC為能阻止50%以上細菌生長的最小抑菌濃度。用酶標儀在600 nm下對平板進行掃描,提取物MIC按照比對照孔(第11孔)的渾濁程度低50%以上的最小質(zhì)量濃度計算。

        1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        2 結(jié)果與分析

        2.1 提取及檢測

        濕天麻經(jīng)過蒸煮、切片、干燥、粉碎、過40目篩得到天麻飲片。取40 g天麻飲片制成干粉,經(jīng)過超聲輔助水提醇沉得到13.5 g天麻粗多糖,提取率為33.75%,天麻多糖含量測定結(jié)果為16.4%。

        2.2 薄層平板瓊脂糖孔穴擴散法定性測定

        定性測定菌株共選取10株,包括G-、G+、真菌,既有標準菌株庫菌株,也有臨床致病菌。濃度120 mg/mL的天麻提取物對10株菌株的抑菌圈結(jié)果見圖1、表2。

        由表2可知,薄層平板瓊脂糖孔穴擴散法測定結(jié)果顯示,天麻多糖對10株菌均有抑制作用,其中對銅綠假單胞菌ATCC 27853抑菌活性最好,抑菌圈直徑達到了36 mm,對銅綠假單胞菌08031014的抑菌圈直徑為22 mm,對以上2株菌判定為極敏感;金黃色葡萄球菌08032706、白色念珠菌08022710、大腸桿菌ATCC25922、肺克桿菌08031012、痢疾桿菌表現(xiàn)為高敏;類腸球菌、白色念珠菌08030401表現(xiàn)為中敏。

        表2 天麻多糖對各種菌株的抑菌圈直徑

        注:“++++”表示極敏;“+++”表示高敏;“++”表示中敏;“+”表示低敏。

        2.3 MIC測定

        利用二倍稀釋法在96孔板上將天麻多糖稀釋10個濃度梯度,10個濃度梯度分別為120、60、30、15、7.5、3.75、1.875、0.937 5、0.468 75、0.234 375 mg/mL。對20株G-菌、12株G+菌、8株真菌共40株菌株的MIC進行了測定,結(jié)果見表3。

        由表3可知,天麻多糖對20株G-菌的MIC范圍為 0.468 75~15 mg/mL,對12株G+菌的MIC范圍為 0.937 5~ 120 mg/mL,對8株真菌的MIC測定范圍為0.937 5~ 30 mg/mL。從結(jié)果看天麻多糖對G-菌的抑菌活性最好,其次為真菌,對革蘭氏陽性菌的抑菌活性相對較弱。其中天麻多糖對嗜麥芽假單胞菌090223、黏質(zhì)沙雷氏菌1379、產(chǎn)酸克伯桿菌3株革蘭氏陰性菌的抑菌活性最好,MIC最低,為0.468 75 mg/mL。

        3 討論

        天麻是蘭科天麻屬多年生草本植物,根狀莖肥厚,無綠葉,蒴果倒卵狀橢圓形。其根莖入藥用以治療頭暈?zāi)垦?、肢體麻木、小兒驚風(fēng)等癥并且對一些細菌具有一定的抑制作用[25-26]。從已有報道中可知,烏天麻揮發(fā)油對米曲霉、黃曲霉、小麥紋枯病和茶輪斑病有一定的抑制作用[27]。

        本試驗對選取的40株菌(G-菌20株、G+菌12株和8株真菌)進行了抑菌活性研究。從試驗結(jié)果可知,天麻多糖具有廣譜抑菌活性,無論是對革蘭氏陽性菌,還是革蘭氏陰性菌或真菌都具有抑制作用并且抑制效果較為明顯。對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌的MIC值范圍分別為0.468 75~ 15 mg/mL、0.937 5~120 mg/mL、0.937 5~30 mg/mL,其中對革蘭氏陰性菌的抑菌效果更為明顯,表現(xiàn)出很強的抑制效果,對嗜麥芽假單胞菌090223、黏質(zhì)沙雷氏菌1379、產(chǎn)酸克伯桿菌的最小抑菌濃度更是低至 0.468 75 mg/mL。本研究結(jié)果為天麻的進一步研究開發(fā)利用提供了一定的依據(jù)。

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        表3 天麻多糖對各種菌株的最小抑菌濃度

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