李凡，夏兵祥，徐健，張業(yè)偉

(南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 普外科,江蘇 南京 210009)

肝癌是常見的惡性腫瘤，在男性死因中位居第5位，在女性死因中位居第8位[1]，其發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲是術后復發(fā)和導致患者死亡的主要原因[2]。腫瘤細胞通常會發(fā)生浸潤、擴散和轉(zhuǎn)移等不同的變化，這個復雜的生理變化過程會涉及腫瘤細胞不同外基質(zhì)成分的變化，患者宿主細胞與腫瘤細胞之間也存在一系列復雜、多步驟、多因素的連續(xù)性相互作用[3]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，白細胞介素(IL)-33與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關，同時也能激活機體免疫效應機制抑制腫瘤生長[4]。本實驗通過研究IL-33對肝癌細胞遷移、侵襲能力以及對細胞骨架的影響，以期為肝癌的臨床診治方案選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

本研究所涉及的肝癌HepG2細胞株獲贈于中國科學院上海細胞庫，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)2～3 d。待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取適量細胞分為低濃度、高濃度兩個實驗組和對照組進行實驗。

DHEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Hyclone公司；GAPDH抗體、羊抗兔二抗以及抗β-鏈蛋白均購自美國CST公司；抗基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9抗體購自Abcam公司；Matrugel人工重構基底膜材料購自美國BD公司；FITC染料購自美國Sigma公司；穿透小室及PVDF膜購自Millipore公司。

1.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測肝癌細胞MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平

肝癌細胞按照每瓶2×106的標準接種于各個培養(yǎng)瓶中，如上條件進行過夜培養(yǎng)。低濃度、高濃度實驗組肝癌細胞中分別加入低濃度(102U·ml-1)和高濃度(103U·ml-1)的IL-33，對照組加入相應等體積的培養(yǎng)液。各組肝癌細胞經(jīng)不同處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后收集細胞并提取總蛋白，所提蛋白的濃度采用BCA法測定，加熱變性后置于-20 ℃環(huán)境保存。取50 μg蛋白行常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白的表達水平。

1.3 肝癌細胞表面分子的表達水平檢測

檢測肝癌細胞表面細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、人類白細胞抗原-Ⅰ(HLA-Ⅰ)和CD44的表達水平。取經(jīng)不同處理的肝癌細胞，加入相應的FITC標記的單克隆抗體(抗-ICAM-1、抗-CD44和抗-HLA-Ⅰ)，在4 ℃下孵育30 min，然后用PBS洗3遍，用流式細胞儀檢測熒光強度。

1.4 細胞附壁檢測

將細胞外基質(zhì)、纖連素或Ⅳ型膠原蛋白分別加入96孔培養(yǎng)板中，再加入經(jīng)過不同處理的肝癌細胞(3H-TdR標記)，在37 ℃下孵育不同時間后，收集附壁及殘留的細胞檢測黏附肝癌細胞。

1.5 細胞聚集檢測

取適量經(jīng)過不同處理的肝癌細胞懸浮液及培養(yǎng)液混合后，置于微量離心管中，在37 ℃下孵育不同時間，期間每10 min振蕩1次，然后加入戊二醛行細胞固定，最后在顯微鏡下觀察并對未聚集的細胞進行計數(shù)。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移

取適量肝癌細胞采用0.25%的胰酶進行消化處理，于6孔細胞培養(yǎng)板上分別接種1 ml的單細胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)約24 h至懸浮細胞基本融合，然后對孔內(nèi)細胞液進行垂直劃痕處理。取適量PBS液先后沖洗2次后再加入對應濃度的IL-33，陰性對照組加入等體積的培養(yǎng)液，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并采用常規(guī)光學顯微鏡觀察。在觀察到的每個視野內(nèi)隨機選擇3個區(qū)域，統(tǒng)計在100倍視野下遷移劃痕空隙的長度。

1.7 穿透小室法檢測細胞侵襲

將穿透小室放入24孔板中，在內(nèi)表面均勻鋪以100 μl Matrigel制作人工基底膜，于無菌環(huán)境下過夜處理，實驗前30 min重新成膠，相應對照組不采取任何處理。取不同濃度IL-33處理的實驗組及對照組的肝癌細胞各100 μl細胞懸液，分別接種于已成膠的穿透小室內(nèi)；另取600 μl含趨化因子的培養(yǎng)液加入至穿透外室并行常規(guī)培養(yǎng)，每組設置3次重復。培養(yǎng)16 h后吸除多余培養(yǎng)液，取膜下層細胞，利用多聚甲醇進行固定，并采用0.1%結(jié)晶紫進行約10 min的染色處理。制片完成后置于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計膜下層的腫瘤細胞數(shù)目，每組隨機選取5個視野進行計數(shù)，取平均值，設置3次重復。

1.8 高內(nèi)涵細胞分析系統(tǒng)免疫熒光法檢測細胞骨架

取消化后的細胞懸浮液接種于96孔板，上述同樣環(huán)境下培養(yǎng)24 h后給予不同濃度的IL-33處理，而對照組則加入等體積培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后棄去細胞培養(yǎng)上清，加入多聚甲醛固定，隨后按照畢蕾等[5]的方法進行處理，最后高內(nèi)涵細胞分析系統(tǒng)讀板獲取數(shù)據(jù)。

1.9 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均值±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 經(jīng)IL-33處理后肝癌細胞MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白的表達水平

蛋白質(zhì)印跡法分析結(jié)果顯示，實驗組肝癌細胞經(jīng)不同濃度的IL-33作用48 h后，MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平較對照組顯著降低(P<0.05)，見圖1。經(jīng)103U·ml-1的IL-33作用后，肝癌細胞中MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平在24 h和48 h較對照組均降低，尤其在48 h蛋白表達水平降低更顯著，見圖2。這提示IL-33對肝癌細胞中的MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平具有濃度和時間依賴性的作用。

2.2 IL-33對肝癌細胞ICAM-1、HLA-Ⅰ及CD44表達的調(diào)節(jié)

經(jīng)低濃度和高濃度IL-33作用后，肝癌細胞ICAM-1、HLA-Ⅰ的表達率較之對照組均顯著增加(P<0.05)，CD44表達顯著下降(P<0.05)，但高濃度和低濃度組間表達率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

圖1不同濃度IL-33作用下肝癌細胞MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平

Fig1ExpressionlevelsofMMP-2,MMP-9andβ-cateninproteinsinhepatocellularcarcinomacellstreatedwithdifferentconcentrationsofIL-33

圖2高濃度IL-33作用下不同時間肝癌細胞MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平

Fig2ExpressionlevelsofMMP-2,MMP-9andβ-cateninproteinsinhepatocellularcarcinomacellstreatedwithhighconcentrationsofIL-33underdifferencetime

2.3 IL-33對肝癌細胞遷移能力的影響

與IL-33低濃度及高濃度組相比，對照組的肝癌細胞遷移劃痕空隙長度有明顯下降，在48 h后尤為顯著(P<0.05)，可見IL-33對肝癌細胞的遷移有顯著的抑制作用，并表現(xiàn)出一定的時間和IL-33劑量依賴性，見表2、圖3。

表1IL-33對肝癌細胞ICAM-1、HLA-Ⅰ及CD44表達的調(diào)節(jié)

Tab1RegulationofIL-33ontheexpressionofICAM-1,HLA-ⅠandCD44inhepatocellularcarcinomacells

組 別肝癌細胞表面分子的表達率/%ICAM-1HLA-ⅠCD44對照組12.116.223.3低濃度組25.4a20.7a 14.9a高濃度組29.8a23.3a13.8a

a 與對照組比較，P<0.05

表2IL-33作用下肝癌細胞遷移劃痕空隙的長度

Tab2ThelengthofmigrationgapoflivercancercellsunderIL-33

組 別肝癌細胞遷移劃痕空隙的長度24 h48 h對照組0.63±0.110.43±0.15低濃度組0.88±0.07a0.81±0.09a高濃度組0.91±0.07a0.90±0.05a

a 與對照組比較，P<0.05

圖3不同濃度IL-33作用下肝癌細胞劃痕實驗光鏡照片×100

Fig3LightmicroscopicphotographsofwoundhealingassayinhepatomacellstreatedwithdifferentconcentrationsofIL-33(×100)

2.4 IL-33對肝癌細胞侵襲能力的影響

細胞培養(yǎng)16 h后，經(jīng)結(jié)晶紫染色處理，對照組穿透小室濾膜的細胞數(shù)量為148.63±8.93，較IL-33低濃度組(109.48±9.65)及高濃度組(86.53±6.72)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。這提示在一定程度上IL-33可以抑制肝癌細胞的體外侵襲能力，并有一定的劑量依賴性。

2.5 經(jīng)IL-33處理后肝癌細胞對細胞外基質(zhì)成分的親和力

經(jīng)不同濃度IL-33處理后，實驗組肝癌細胞對細胞外基質(zhì)成分纖維連接蛋白(fibronectin, FN)和Ⅳ型膠原(type Ⅳ collagen)的親和力較對照組均顯著降低(P<0.05)，在40 min和1 h后差異尤為明顯(表3)；同時，IL-33高濃度與低濃度組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.6 經(jīng)IL-33處理后肝癌細胞的聚集能力

經(jīng)高濃度和低濃度的IL-33處理后，各組肝癌細胞的聚集能力均呈明顯的下降趨勢(P<0.05)，這也提示IL-33可抑制肝癌細胞的聚集，但高濃度與低濃度組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

圖4不同濃度IL-33作用下肝癌細胞Transwell遷移實驗光鏡照片×100

Fig4LightmicroscopicphotographsofTranswellmigrationinhepatomacellstreatedwithdifferentconcentrationsofIL-33(×100)

2.7 IL-33對肝癌細胞骨架的影響

如圖5所示，只有對照組肝癌細胞的微絲骨架分布較為密集、清晰，面積較大。經(jīng)IL-33作用后，肝癌細胞F-肌動蛋白構成的微絲顯著減少(P<0.05)，骨架面積分析顯示，高濃度和低濃度IL-33處理后的骨架面積(分別為1 687.63±225.48和1 955.04±198.22)均顯著小于對照組(3 561.42±273.48)。這提示IL-33能有效降低肝癌細胞骨架面積，并表現(xiàn)出一定的IL-33劑量依賴性。

表3經(jīng)IL-33處理后肝癌細胞對細胞外基質(zhì)成分的親和力

Tab3AffinityofhepatomacellstoextracellularmatrixaftertreatmentwithIL-33

組 別Ⅳ型膠原的親和力纖維連接蛋白的親和力20 min40 min60 min20 min40 min60 min對照組25.21±4.8332.51±5.6546.84±5.3325.21±4.8332.51±5.6546.84±5.33低濃度組12.43±3.67a15.64±4.25a21.65±4.68a12.43±3.67a15.64±4.25a21.65±4.68a高濃度組10.65±3.44a13.58±3.98a19.54±4.51a10.65±3.44a13.58±3.98a19.54±4.51a

a 與對照組比較，P<0.05

表4經(jīng)IL-33處理后肝癌細胞的聚集能力

Tab4AggregationabilityofhepatomacellsafterIL-33treatment

組 別肝癌細胞的聚集率20 min40 min60 min對照組57.42±6.5781.62±7.6388.54±5.89低濃度組29.33±5.60a51.32±6.55a53.44±5.21a高濃度組25.44±4.88a47.98±6.23a51.64±6.74a

a 與對照組比較，P<0.05

3 討 論

腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學特性之一，是一個復雜的、多步驟的病理發(fā)生過程，包含多基因調(diào)控和多層次調(diào)節(jié)，涉及腫瘤細胞的多個發(fā)生環(huán)節(jié)如細胞增殖、基質(zhì)降解和細胞遷移等[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，多個生物學過程在腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴散過程中起著非常重要的作用，如多數(shù)腫瘤細胞骨架的重建、腫瘤細胞表面細胞黏附分子的表達、腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)之間的親和力等等[3]。因此，抑制腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的有效手段就是阻斷腫瘤細胞的增殖、侵襲，以及該過程所涉及的各個環(huán)節(jié)、途徑。HepG2是目前在肝癌研究中被廣泛接受的的模式細胞[7]。本研究采用不同濃度的IL-33對肝癌細胞進行干預，通過檢測IL-33對肝癌細胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，以期為臨床肝癌的綜合治療和診斷提供相關的參考依據(jù)。

圖5不同濃度IL-33作用下肝癌細胞骨架免疫熒光法檢測圖×200

Fig5ImmunofluorescencedetectionofcytoskeletonofhepatomacellsunderdifferentconcentrationsofIL-33(×200)

肝癌HLA-Ⅰ類抗原能夠增加肝癌細胞的免疫原性，可以有效激活毒T細胞對腫瘤細胞的殺傷力，進而增強對腫瘤細胞的滅殺能力[8]。ICAM-1屬于一種免疫球蛋白，機體的淋巴細胞會在ICAM-1與其配體白細胞相關抗原1之間的相互作用下有效地誘導遷移和聚集在腫瘤部位[9]。CD44是一種廣泛存在的細胞表面跨膜糖蛋白，參與腫瘤細胞的異質(zhì)性黏附，并通過與細胞骨架蛋白相結(jié)合，共同促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[10]。有研究表明，CD44在腫瘤組織中的異常表達可能與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移具有相關性[11]。IL-33作為白介素家族新近發(fā)現(xiàn)的一員，不僅能夠參與基因表達的調(diào)控，還能作為細胞因子影響信號通路的傳導[12]，已發(fā)現(xiàn)其在患者的炎癥反應和免疫應答中發(fā)揮著非常重要的作用[13-14]。

本研究顯示，經(jīng)低濃度和高濃度IL-33作用后，肝癌細胞ICAM-1、HLA-Ⅰ的表達率較之對照組均顯著增加，CD44表達顯著下降。提示：IL-33能夠增強肝癌細胞的免疫原性，增加宿主T細胞受體依賴性，以加強T細胞對肝癌細胞的殺傷力；而HLA限制性T細胞的細胞毒作用，可以有效抑制腫瘤細胞的遷移能力。此外，本研究結(jié)果也顯示，經(jīng)IL-33處理后，肝癌細胞的聚集能力顯著下降，且肝癌細胞對纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原的親和力也顯著下降，細胞劃痕實驗和Transwell系統(tǒng)也發(fā)現(xiàn)干預后的肝癌細胞侵襲和遷移能力較之對照組明顯下降，這也進一步表明IL-33能夠抑制肝癌細胞的侵襲和遷移能力。

細胞骨架與腫瘤細胞的運動有關，細胞骨架是由細胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚合而成的纖維狀網(wǎng)架結(jié)構。為了保持細胞特有的形狀，在微觀結(jié)構上細胞骨架與位于其內(nèi)側(cè)的核膜及外側(cè)的細胞膜具有緊密關系。細胞骨架的主要結(jié)構有微絲、微管以及中間纖維，而作為微絲結(jié)構的主要細胞骨架蛋白——肌動蛋白，其自身不斷反復地發(fā)生解聚和聚合，在腫瘤細胞的形態(tài)改變和遷移中起著非常重要的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的IL-33作用于肝癌細胞后，其F-肌動蛋白構成的微絲顯著減少，提示IL-33可以誘導微絲骨架結(jié)構蛋白發(fā)生形態(tài)改變和重構，使骨架面積降低，抑制腫瘤細胞向外運動和侵襲。

β-鏈蛋白高表達水平可以促進細胞增殖，導致腫瘤發(fā)生。有研究證實，肝癌患者β-鏈蛋白的表達程度與患者肝內(nèi)轉(zhuǎn)移呈正相關[16]。MMPs是β-鏈蛋白的下游基因產(chǎn)物，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的促進因子[17]，其中MMP-2和MMP-9作為主要金屬酶類均能夠有效降解Ⅳ型膠原。眾多研究表明，兩者在肝癌組織中的表達均呈較高水平，且有報道稱其與肝癌的浸潤及轉(zhuǎn)移可能具有非常密切的關系[18-19]。本研究中，經(jīng)不同濃度的IL-33干預后，實驗組肝癌細胞中的MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平顯著降低，并且存在IL-33濃度和處理時間依賴關系，這提示IL-33能夠通過降低肝癌相關蛋白表達水平，有效抑制肝癌細胞的侵襲遷移。

綜上所述，IL-33能夠通過有效上調(diào)肝癌細胞ICAM-1、HLA-Ⅰ分子及降低肝癌相關蛋白的表達水平，減少細胞骨架微絲數(shù)量和面積，從而有效抑制肝癌細胞的遷移和侵襲。

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