支力強，楊一欣，許毛，姚舒馨，馬建兵*

(1.西安市紅會醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，陜西 西安 710054；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實驗中心，陜西 咸陽 712046；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710061)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，并能導(dǎo)致骨脆性增加和易于骨折的全身性疾病。骨量減少的本質(zhì)原因是成骨細胞與破骨細胞之間的平衡被打破，因此成骨細胞增殖和分化對骨正常結(jié)構(gòu)的維持起著重要作用[1]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirtuin 1，SIRT1)基因是sirtuins家族研究最為廣泛的一員，參與了神經(jīng)退變性疾病、糖尿病、腫瘤、炎癥、衰老等疾病的病理過程[2-3]。有文獻報道，在成骨條件性敲除SIRT1對小鼠長骨的發(fā)育有很大影響，如骨礦物密度(bone densitometry，BMD)降低、長骨長度變短、皮質(zhì)骨厚度減少、鈣結(jié)節(jié)較少等[4]；并且SIRT1作為骨量的調(diào)節(jié)因子，能夠抑制硬骨素的形成[5]。同時，SIRT1基因敲除也能加速骨關(guān)節(jié)炎小鼠的病程，其可能機制與細胞自噬相關(guān)基因如ATG 5、ATG 7相關(guān)[6-8].磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/ 蛋白激酶B(protein kinaseB，AKT)通路在神經(jīng)細胞增殖和分化、氧化應(yīng)激、細胞損傷過程中發(fā)揮了重要作用[9-11]，但SIRT1對大鼠來源成骨細胞分化的影響是否通過PI3K/AKT通路發(fā)揮效應(yīng)的機制尚未清楚。

本研究通過采用SIRT1特異性激動劑白藜蘆醇和抑制劑EX-527，觀察其對大鼠來源成骨細胞分化能力的影響，同時測定PI3K/AKT通路磷酸化水平，以探討SIRT1對大鼠來源成骨細胞分化能力的影響與PI3K/AKT通路的關(guān)系，為臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供一個新的思路或者新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 Sprague Dawley大鼠乳鼠，購自西安交通大學(xué)實驗動物中心。膠原酶A、 alizarin red S(美國Sigma公司)，白藜蘆醇和EX-527(美國selleckchemicals公司)，0.25%含EDTA胰酶(美國Thermo scientific公司)，4%多聚甲醛(西安赫特生物)，羊抗兔SIRT1、Runx2、OPN、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT一抗均購自美國Abcam公司(稀釋比例均為1：1 000)，組織裂解蛋白提取液RIPA和BCIP/NBT堿性磷酸酶染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，兔SP檢測試劑盒(中杉金橋有限公司)，酶標(biāo)儀DENLEY DRAGON Wellscan MK 3(美國Thermo scientific公司)，Western blot發(fā)光成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.2 原代細胞提取 取出生1周內(nèi)的乳鼠，泡在75%酒精溶液中消毒30 min，待乳鼠死亡后剪掉頭顱泡在高壓滅菌后的PBS溶液中，其余步驟在超凈臺中操作。扒開頭皮剪掉顱骨，泡在另一個放PBS的皿中，剪碎顱骨，第一次消化，0.25%含EDTA胰酶消化15 min，棄掉上清液，加膠原酶A消化30 min，消化期間每4 min中震蕩一次，棄掉消化液，再次加入膠原酶A消化2 h，待消化完畢后加入含血清培養(yǎng)基終止消化，1 000 r離心8 min，棄掉上清液，用培養(yǎng)液(10%胎牛血清，α-MEM培養(yǎng)基，1%青霉素-鏈霉素)重懸細胞，放入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后換液，即得大鼠來源原代成骨細胞。第3代細胞用于鋪板，加入成骨分化液(10%胎牛血清，α-MEM培養(yǎng)基，1%青霉素-鏈霉素，10 mMβ磷酸甘油鈉，50 μM抗環(huán)血酸)[12]。將細胞隨機分為四組：對照組、低劑量組(10 μM)、中劑量組(20 μM)和高劑量組(40 μM)，每2～3 d換液。

1.3 CCK-8測定細胞毒性 將生長狀態(tài)良好的原代細胞，以8×103/孔密度種植于96孔板中，按照CCK-8試劑盒步驟進行細胞毒性試驗，用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值。

1.4 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色和Alizarin red S染色 將接種于24孔板的細胞倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗5 min，共洗3次，4%多聚甲醛室溫固定20～30 min，再用PBS洗5 min，共洗3次，分別按BCIP/NBT堿性磷酸酶染色試劑盒說明書加入ALP染色劑和1%茜素紅染料，ALP室溫避光孵育30 min，Alizarin red S室溫孵育30 min，PBS洗5 min，共洗3次，拍照，觀察顏色變化。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測 Ⅰ型膠原量制備細胞爬片，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，加入體積分數(shù)為70%的乙醇，固定30 min，根據(jù)免疫組化試劑盒要求染色，在顯微鏡下觀察，拍照。

1.6 Western blot檢測 相關(guān)蛋白表達在6孔板中加入蛋白裂解液RIPA，放置冰上裂解30 min，用細胞刮充分刮落細胞，吸取液體至EP管，經(jīng)4℃ 11 400 r(12 000 g)離心10 min后吸取上清液至新EP管，進行蛋白定量。按100 μg蛋白進行上樣，采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳跑膠，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入SIRT1、Runx2、OPN、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT的一抗(1︰1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜，帶辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1︰4 000)室溫孵育2 h，再用TBST洗膜，采用強化學(xué)發(fā)光法進行定量(ChemiDoc-It 415 Imager化學(xué)發(fā)光儀，美國upland公司)，最后應(yīng)用Image J軟件進行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 細胞形態(tài)及細胞毒性 提取的原代大鼠成骨細胞24 h后換液，在顯微鏡下觀察，可見細胞排列整齊，大小基本一致，細胞透光性好，呈長條狀分布，以上說明細胞生長狀況良好，可以開展后續(xù)實驗。在加入低、中、高劑量非瑟酮后，經(jīng)過CCK-8細胞毒性檢測，發(fā)現(xiàn)各組間細胞在450 nm處吸光度值沒有明顯差異(P>0.05，見圖1)，說明白藜蘆醇和EX-527對細胞幾無毒性，可以用于后續(xù)實驗。

圖1 白藜蘆醇對原代成骨細胞的毒性

2.2 成骨細胞分化，ALP水平和鈣結(jié)節(jié)表達 在成骨細胞經(jīng)過誘導(dǎo)分化7、12 d后，分別檢測采用BCIP/NBT堿性磷酸酶染色試劑盒和alizarin red S進行ALP水平和鈣結(jié)節(jié)表達(見圖2a)。在加入了白藜蘆醇后，ALP染色顏色變深，這說明ALP水平有明顯上升，EX-527加入以后，染色顏色變淺，表明其水平呈現(xiàn)一個下降趨勢，同樣地，鈣結(jié)節(jié)的形成通過Alizarin red S染色也能觀察到與ALP水平同樣地變化，白藜蘆醇增加了鈣結(jié)節(jié)的沉積，EX-527組里鈣結(jié)節(jié)的沉積相比白藜蘆醇組顯著降低。通過ALP和alizarin red S結(jié)果表明，白藜蘆醇能夠促進成骨細胞的分化，抑制SIRT1后該效果同樣也被抑制。

2.3 白藜蘆醇對成骨分化影響 為進一步觀察白藜蘆醇對成骨細胞分化的影響，我們通過免疫組織化學(xué)的手段檢測了Ⅰ型膠原的表達，在光學(xué)顯微鏡下所拍照片可以看出，白藜蘆醇能夠明顯上調(diào)Ⅰ型膠原，其染色顏色較深，在加入EX-527后，Ⅰ型膠原的表達顯著下降(見圖2b)。同時，通過western blot檢測了SIRT1和成骨分化相關(guān)蛋白的表達水平，如RUNX2、OPN，我們發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能特異性激活SIRT1(P<0.01)，EX-527特異性抑制SIRT1的表達(P<0.001)。伴隨著SIRT1的上調(diào)與下調(diào)，成骨分化相關(guān)蛋白RUNX2和OPN也呈現(xiàn)了相同的表達趨勢(P<0.001)，隨著白藜蘆醇的加入呈上升趨勢，EX-527加入后明顯下降，如圖3所示。結(jié)果表明，激活SIRT1能夠促進成骨細胞分化相關(guān)因子Ⅰ型膠原、RUNX2和OPN的表達，成骨細胞分化能力增強，抑制SIRT1后，相關(guān)因子表達下降，成骨細胞分化能力減弱。

2.4 SIRT1與PI3K/AKT通路的關(guān)系 為了進一步探究SIRT1在成骨分化中是否通過PI3K/AKT通路發(fā)揮效應(yīng)，我們通過western blot技術(shù)檢測了PI3K/AKT總蛋白水平與磷酸化蛋白水平。研究發(fā)現(xiàn)，在激活了SIRT1后，PI3K/AKT磷酸化水平顯著升高(P<0.001)，然而，在抑制了SIRT1的活性以后，PI3K/AKT磷酸化水平明顯下降(P<0.001或P<0.05)，見圖4。結(jié)果表明，在SIRT1調(diào)控成骨分化過程中，PI3K/AKT通路在其中發(fā)揮了重要作用。

3 討 論

骨質(zhì)疏松即骨質(zhì)疏松癥，是多種原因引起的一組代謝性骨病變，主要特點是單位體積內(nèi)骨組織量減少。在多數(shù)骨質(zhì)疏松中，骨組織的減少主要由于骨質(zhì)吸收增多所致，以骨骼疼痛、易于骨折為特征。成骨細胞和破骨細胞之間的平衡對維持骨量必不可少[12]。本研究通過探討SIRT1對大鼠原代成骨細胞分化的影響，以尋求SIRT1在抗衰老性疾病中可能的作用機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，在白藜蘆醇刺激下，成骨細胞表現(xiàn)出ALP活性和鈣結(jié)節(jié)的增加，說明白藜蘆醇促進成骨細胞向成熟骨細胞分化，有利于骨量增加，這與之前的研究不謀而合[13-14]。

a 堿性磷酸酶和茜素紅染色 b 免疫組化圖

a western blot檢測SIRT1、RUNX2、OPN的表達 b SIRT1灰度值分析 c RUNX2灰度值分析 d OPN灰度值分析注：*與對照組比較，P<0.01；**與對照組比較，P<0.001；#與Res組比較，P<0.001

a western blot檢測PI3K、AKT總蛋白及磷酸化水平 b 磷酸化PI3K灰度值分析 c 磷酸化AKT灰度值分析注：**與對照組比較，P<0.001；#與Res組比較，P<0.001；##與Res組比較，P<0.05

在加入SIRT1特異性抑制劑之后，ALP活性和鈣結(jié)節(jié)程度都出現(xiàn)明顯下降，說明SIRT1在成骨分化中發(fā)揮了重要作用。我們通過檢測成骨相關(guān)因子如Ⅰ型膠原、RUNX2、OPN等相關(guān)蛋白的表達，同樣也發(fā)現(xiàn)了SIRT1能夠促進成骨細胞的分化，抑制SIRT1的活性后，成骨分化也一定程度被抑制，這也從另一角度佐證了我們的猜想，SIRT1在成骨分化過程中起到重要作用。

PI3K-AKT信號通路作為細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，在細胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進增殖分化的關(guān)鍵作用，它與人類多種疾病如急性淋巴白血病、腎癌、酒精肝等的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系[15-17]。由于PI3K-AKT信號通路與各種疾病病理生理過程相關(guān)，因此我們認為在成骨分化過程中，PI3K-AKT信號通路也扮演了很重要的角色。本研究通過加入SIRT1特異性抑制劑，研究SIRT1與PI3K-AKT通路之間的相關(guān)性，來明確PI3K-AKT通路在成骨細胞分化中發(fā)揮的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在加入白藜蘆醇組的成骨細胞中，PI3K-Akt的磷酸化水平明顯上升，該效應(yīng)在加入EX-527后被部分抵消，因此我們推測，SIRT1與PI3K-AKT通路在大鼠原代成骨細胞分化中有著不可替代的作用，PI3K-AKT信號通路可能被用于臨床治療骨量減少為特征病癥的一個新的靶點。

本研究著重于SIRT1基因在成骨分化中與PI3K-AKT通路之間的關(guān)系，希望能夠找到骨質(zhì)疏松相關(guān)疾病發(fā)病機制，為臨床治療提供新的靶點和新的思路。

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