陳倩倩，劉 波，王階平，朱育菁，張海峰

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003）

微生物發(fā)酵床以谷殼、秸稈、鋸糠、椰糠等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品作為墊料層，禽畜養(yǎng)殖于其上，日常墊料管理和動物拱翻混合墊料與豬糞尿等排泄物，微生物對混合物進行發(fā)酵，進而消納糞便、去除異味，實現(xiàn)無害化養(yǎng)殖，是一種新型環(huán)保養(yǎng)豬技術(shù)。微生物發(fā)酵床的應(yīng)用可追溯至明崇禎年間，養(yǎng)殖者以碎草和土為墊圈材料，與糞尿充分混合，形成一種廄肥[1]。1970年，日本建立了以木屑為墊料的微生物發(fā)酵床系統(tǒng)[2]。1985年加拿大Biotech公司發(fā)明以秸稈為墊料的微生物發(fā)酵床系統(tǒng)[3]。20世紀(jì)90年代末期，微生物發(fā)酵床在日本、中國、韓國及其他東南亞國家推廣。此后，研究者一直對發(fā)酵床系統(tǒng)進行改良和升級。Chan等[4]為了解決夏季高溫的難題，進行了發(fā)酵床的改良，提高動物福利。Deininger等[5]采用破碎處理的秸稈作為發(fā)酵床墊料，其處理糞便效果和提高動物福利方面優(yōu)于未處理的秸稈。Kapuinen等[6]測定了不同有機墊料的鋪填厚度、承載容量、透氣能力、耐壓程度等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)將泥炭、木屑和稻秸按一定的比例混合后使用，其效果優(yōu)于單純的有機墊料。

微生物發(fā)酵床墊料中的微生物消納處理畜禽糞便，細(xì)菌在降解過程中起重要作用。早期發(fā)酵床微生物研究主要依賴于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法。趙國華等[7]采用常規(guī)的分離培養(yǎng)法研究了養(yǎng)豬發(fā)酵床墊料中微生物群落構(gòu)成，芽胞桿菌為墊料中的優(yōu)勢菌，起著降解墊料有機質(zhì)的作用，隨著發(fā)酵床壽命的延長，其中的微生物群落多樣性逐漸降低。王震等[8]同樣發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌是發(fā)酵床墊料中的優(yōu)勢細(xì)菌，并參與豬糞降解與發(fā)酵床病原生防過程。依靠分離培養(yǎng)技術(shù)，大量的除臭菌、豬糞降解菌得以更深入的研究與應(yīng)用。但該方法操作周期長，過程繁瑣，很難完全分離到墊料中的不可培養(yǎng)的厭氧菌及特殊營養(yǎng)類型微生物。脂肪酸標(biāo)記法與PCR-DGGE技術(shù)無分離培養(yǎng)過程，能夠較為全面揭示微生物多樣性。劉波等[9]采用微生物群落脂肪酸生物標(biāo)記分析了零排放豬場基質(zhì)墊層多樣性，共檢測出37個墊料微生物生物標(biāo)記?；潞Ａ盏萚10]采用PCR-DGGE技術(shù)對發(fā)酵床墊料基質(zhì)中的細(xì)菌群落多樣性進行研究，結(jié)果表明墊料中的主要菌群是節(jié)桿菌屬、放線菌屬、芽胞桿菌屬和梭菌屬等，墊料的組成影響其中的微生物群落結(jié)構(gòu)。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，宏基因組測序技術(shù)成為研究微生物之間以及微生物與環(huán)境因子之間互作的有力工具。該技術(shù)繞過傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)的瓶頸，研究包含特定生境中微生物的全部遺傳信息，更全面地揭示微生物多樣性[11]。

發(fā)酵床墊料中的微生物菌群可分解豬糞尿、抑制病原菌，是發(fā)酵床的核心，其種類和數(shù)量對發(fā)酵床的運行至關(guān)重要。利用宏基因組技術(shù)研究發(fā)酵床微生物變化，能夠揭示微生物群落的細(xì)菌種類、數(shù)量及結(jié)構(gòu)，對于發(fā)酵床降解糞污及除臭等功能研究極其重要。在堆肥研究中，Ren等[12]采用16S rRNA基因序列高通量測序技術(shù)分析牛糞堆肥中的微生物組結(jié)構(gòu)與變化，發(fā)現(xiàn)主要的細(xì)菌為擬桿菌門、變形菌門、厚壁菌門及放線菌門，并且發(fā)酵各階段具有不同的細(xì)菌群落。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵的不同階段，墊料中的優(yōu)勢微生物不同，隨著發(fā)酵時間延長，棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、枝芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、放線菌屬、乳桿菌屬含量增加[13]。但是基于宏基因分析養(yǎng)豬發(fā)酵床微生物組季節(jié)性變化研究鮮見報道。溫度影響細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)，如微生物細(xì)胞的酶活性、細(xì)胞質(zhì)膜流動性及環(huán)境因子（如物質(zhì)溶解度）等，進而影響微生物的生長和代謝。因此采用Illumina二代測序技術(shù)，研究夏季高溫與冬季低溫脅迫下發(fā)酵床墊料細(xì)菌微生物組多樣性，可為夏、冬季節(jié)發(fā)酵床的維護和發(fā)酵床豬糞的生物降解提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗地點：微生物發(fā)酵床位于福建省福清漁溪現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)樣本工程示范基地。發(fā)酵床厚度為80 cm，微生物組采樣季節(jié)選擇夏季和冬季，發(fā)酵床夏季和冬季樣本采集方法：夏季樣本取自微生物發(fā)酵床7月份表層墊料，冬季樣本取自同年12月份微生物發(fā)酵床表層墊料。采用五點取樣法采集，同時進行3次重復(fù)采樣，混合每次采集的墊料，進行細(xì)菌多樣性研究。墊料由70%椰糠和30%谷殼粉構(gòu)成，厚度為80 cm。墊料的管理采用兩天旋耕一次，兩周翻犁一次，兩月深鉤一次，并根據(jù)墊料濕度的變化調(diào)整新鮮墊料的添加。本次夏季和冬季墊料的采樣深度為0～15 cm，含水量為45%左右。7月份發(fā)酵床室內(nèi)平均溫度為30.13℃，12月份為15.67℃。夏季樣本記為s1、s2和s3；冬季樣本記為w1、w2和w3。

1.2 方法

1.2.1 微生物發(fā)酵床墊料總DNA的提取

按土壤DNA提取試劑盒FastDNA SPIN Kit for Soil的操作指南，稱取500 mg墊料樣本分別進行總DNA的提取。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA濃度，稀釋至終濃度為1 ng·μL-1開展后續(xù)試驗。

1.2.2 微生物組16S rDNA V3-V4區(qū)測序

采用原核生物16S rDNA基因V3-V4區(qū)通用引物 338F（5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′）和806R（5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′對各墊料樣本總DNA進行PCR擴增，PCR反應(yīng)重復(fù)3次。取相同體積混合后進行目的片段回收，所用膠回收試劑盒為AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（Axygen公司）。采用 QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）對回收產(chǎn)物進行定量檢測。然后構(gòu)建插入片段為 350 bp的 Paired-End（PE）文庫（TruSeqTMDNA Sample Prep Kit建庫試劑盒，Illumina公司），經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測，HiSeq上機測序（上海美吉）。

1.2.3 微生物組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析

對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)。采用Mothur軟件（Version 1.36.1）基于有效數(shù)據(jù)進行 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類和物種分類分析[14]。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)分析[15]。從各個OTU中挑選出一條序列作為該OTU的代表序列，將該代表序列與已知物種的16S數(shù)據(jù)庫（Silva，http：//www.arb-silva.de）進行物種注釋分析；根據(jù)每個OTU中序列的條數(shù)，得到各個OTU的豐度值[16-17]。反映組間各樣品之間的共有及特有OTU數(shù)目的Venn圖，采用VennDiagram軟件生成[18]。

相應(yīng)的數(shù)據(jù)釋放與SRA（Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫，序列號分別為 SRR5611215（S1），SRR5611214（S2），SRR5611217（S3），SRR5611216（W1），SRR5611223（W2）和 SRR5611222（W3）。

1.2.4 微生物發(fā)酵床細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)季節(jié)變化差異分析

選取含量前9的細(xì)菌門和前12的細(xì)菌屬分別比較兩個季節(jié)在門和屬水平上的差異。采用RDA（冗余分析）法，基于線性模型研究溫度、墊料、菌群三者之間的關(guān)系。在RDA圖內(nèi)，環(huán)境因子用箭頭表示，箭頭連線和排序軸的夾角代表某個環(huán)境因子與排序軸的相關(guān)性大小，夾角越小，相關(guān)性越高；反之相關(guān)性越低。環(huán)境因子之間的夾角為銳角時表示兩個環(huán)境因子之間呈正相關(guān)關(guān)系，不出現(xiàn)銳角時呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

1.2.5 微生物發(fā)酵床細(xì)菌群落PICRUSt基因預(yù)測

16S功能預(yù)測是通過PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）對OTU豐度表進行標(biāo)準(zhǔn)化[19]，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的信息，獲得各功能基因的豐度，推測微生物群落的功能信息。PICRUSt首先根據(jù)微生物16S rRNA信息推測親緣關(guān)系最近的微生物，根據(jù)其宏基因組預(yù)測其他基因片段的功能，與數(shù)據(jù)庫比對獲得微生物群落的代謝功能。經(jīng)PICRUSt分析，絕大多數(shù)微生物預(yù)測結(jié)構(gòu)與真實基因功能圖譜非常相近，但對于無法用數(shù)據(jù)庫比對獲得同源物種信息的微生物則無法預(yù)測其功能。分析獲得KEGG代謝通路包含3個水平信息，本文采用level2水平進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物發(fā)酵床細(xì)菌種類季節(jié)變化差異

夏季和冬季發(fā)酵床6個樣本共獲得762 923個有效序列。所有樣本的稀釋曲線接近平臺（圖1），測序深度已經(jīng)基本覆蓋樣本中的所有物種，覆蓋率高。韋恩圖（圖2）顯示，夏季樣本包含1741種OTUs，冬季樣本包含1677種OTUs，夏季樣本有更豐富的細(xì)菌種類。2組樣本共有的OTU有1575個，其中夏季特有OTU 166種，占夏季總OTU的9.5%；冬季特有OTU有102種，占冬季總量的6.1%。夏冬墊料6個樣本中共檢測到1843種OTU類型，其中夏季樣本包含34門，70綱，139目，258科，566屬和 889種細(xì)菌；冬樣本包含28門，59綱，124目，231科，525屬和832種細(xì)菌。夏季微生物發(fā)酵床具有更為豐富和多樣的細(xì)菌類群。

2.2 微生物發(fā)酵床細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)季節(jié)變化差異

微生物發(fā)酵床主要的細(xì)菌為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和糖桿菌門（圖3）。夏季樣本中，主要細(xì)菌為擬桿菌門（28.3%）、厚壁菌門（20.7%）、放線菌門（19.8%）和變形菌門（10.4%）。冬季發(fā)酵床墊料的主要細(xì)菌為擬桿菌門（31.6%）、厚壁菌門（28.1%）和變形菌門（22.3%）。其中，異常球菌-棲熱菌門在微生物發(fā)酵床夏季樣本中的含量為冬季樣本的10倍。夏季墊料中的放線菌門、綠彎菌門和螺旋菌門含量也明顯高于冬季樣本。而變形菌門在冬季樣本中的含量遠(yuǎn)高于夏季樣本，為后者的2倍。擬桿菌門和厚壁菌門含量也明顯高于夏季樣本。

圖1 測序樣品稀釋曲線Figure1 Rarfaction curve of samples

圖2 OTU水平的韋恩圖Figure2 Venn diagram on OTU level

通過對細(xì)菌門水平的研究，發(fā)現(xiàn)夏、冬兩個季節(jié)微生物發(fā)酵床墊料中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同，細(xì)菌分布與溫度相適應(yīng)。夏季中耐熱細(xì)菌含量多，包括放線菌門、異常球菌-棲熱菌門、綠彎菌門和螺旋菌門，并且具有更豐富的細(xì)菌種類。冬季，在各種生境中廣泛分布的擬桿菌門、厚壁菌門及變形菌門含量高。

在屬水平上，兩個季節(jié)的墊料共檢測到581個細(xì)菌屬，其中夏季樣本包含566個屬，393 210 reads；冬季樣本包含525屬，369 713 reads。選取兩個季節(jié)樣本中含量前12的屬，比較其在兩個季節(jié)中的差異（圖4）。夏季樣本中的主要細(xì)菌為糖桿菌屬（6.5%）、漠河桿菌屬（8.8%）和特呂珀菌屬（7.4%）。冬季樣本中含量較多的為糖桿菌屬（7.1%）、硫假單胞菌（6.8%）、寡源桿菌屬（3.5%）和嗜蛋白菌屬（3.8%）。異常球菌-棲熱菌門的特呂珀菌屬在夏季樣本中的相對含量為冬季樣本的10倍；擬桿菌門的漠河桿菌是冬季樣本的13.2倍。假單胞菌科的硫假單胞菌在冬季樣本中的相對含量為夏季樣本的25倍。發(fā)酵床冬季樣本中擬桿菌門的普氏菌屬-9、鏈球菌屬、黃桿菌屬和嗜蛋白菌屬高于發(fā)酵床夏季樣本，分別是夏季樣本的3.7、9.6、5.2、3.4、1.9 倍。

圖3 微生物發(fā)酵床墊料在門水平的微生物組成及相對豐度Figure3 Relative abundances of predominant bacterial compositions on phylum level

圖4 微生物發(fā)酵床墊料在屬水平的微生物組成及相對豐度Figure4 Relative abundances of predominant bacterial compositions on genus level

2.3 微生物發(fā)酵床細(xì)菌群落季節(jié)變化熱圖分析

通過對不同分類水平的微生物進行多樣性分析，選擇含量前50的細(xì)菌屬，根據(jù)它們在發(fā)酵床夏季和冬季墊料樣本中豐度比例結(jié)構(gòu)建立熱圖（圖5）。按季節(jié)不同，樣本聚成兩類：夏季樣本（s1、s2和s3）和冬季樣本（w1、w2和w3），說明相同季節(jié)的微生物發(fā)酵床墊料具有相似的微生物構(gòu)成。根據(jù)豐度差異，細(xì)菌可聚成3類。第1類為在微生物發(fā)酵床夏季和冬季樣本中含量低的細(xì)菌，包含葡萄球菌屬、短桿菌屬和涅斯捷連科氏菌等7個屬。第二類為夏季樣本含量高的降解菌，包括嗜熱菌特呂珀菌屬、漠河桿菌屬、紫單胞菌科、間孢囊菌科及微球菌目的細(xì)菌。第三類為冬季樣本含量較高的細(xì)菌屬，其中可分為3亞類。硫假單胞菌屬和糖桿菌屬含量最高；第二亞類包含嗜蛋白菌屬、海洋桿菌屬、不動桿菌屬和嗜冷桿菌屬等9個屬的細(xì)菌，多為適冷菌；第三亞類包含假單胞菌屬、乳酸桿菌屬、黃桿菌屬等降解菌。

異常球菌-棲熱菌門在夏季發(fā)酵床含量高，此門細(xì)菌包含異常球菌目和棲熱菌目2個目，具有厚的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，能夠抵抗嚴(yán)酷環(huán)境。在微生物發(fā)酵床中分離到的該門細(xì)菌有異常球菌目的特呂珀菌屬。放線菌門在夏季微生物發(fā)酵床中的含量也明顯高于冬季樣本，為冬季的3.5倍。放線菌是自然界中重要的降解菌，可降解多種有機物。擬桿菌門的漠河桿菌屬含量也高于冬季樣本。

變形菌門細(xì)菌在冬季發(fā)酵床中含量高。微生物發(fā)酵床的該門細(xì)菌主要包括：β-變形菌的寡源桿菌屬和γ-變形菌的假單胞菌屬、硫假單胞菌屬、海洋桿菌屬等，其中假單胞菌屬和硫假單胞菌含量高于夏季樣本。冬季樣本中擬桿菌門也具有數(shù)量優(yōu)勢，是夏季樣本的2倍多。擬桿菌門的嗜蛋白菌屬、冬季微菌屬和黃桿菌屬在冬季發(fā)酵床中的含量分別為夏季樣本的1.8、2.1、5.2 倍。

圖5 細(xì)菌在各樣本間的分布熱圖（屬水平）Figure5 Hierarchically clustered heatmap of bacterial distribution of different communities from the samples on the genus level

2.4 微生物發(fā)酵床細(xì)菌群落季節(jié)變化關(guān)聯(lián)分析

RDA法分析結(jié)果反映了墊料菌群與季節(jié)性溫度之間的關(guān)系。結(jié)果（圖6）顯示，細(xì)菌門的分布與溫度相關(guān)。分析結(jié)果可以看出：①溫度與放線菌門含量夾角為銳角，呈正相關(guān)，隨溫度升高而增加，在夏季發(fā)酵床含量高達(dá)19.8%，而冬季含量則為12.7%；②溫度與厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門的含量為鈍角，呈負(fù)相關(guān)，3個門細(xì)菌含量隨溫度降低而增加，在冬季樣本中含量較高，分別是夏季樣本的1.4、2.1、1.1倍；③放線菌與厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門菌量之間為鈍角，呈負(fù)相關(guān)，隨著溫度升高放線菌含量增加，夏季發(fā)酵床中的放線菌含量是冬季墊料的1.6倍，而厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門含量分別降低了27.3%、53.4%和10.4%；④厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門之間呈銳角，呈正相關(guān)，它們在夏季和冬季發(fā)酵墊料中的含量變化一致。

圖6 墊料微生物與季節(jié)因子的冗余分析Figure6 Redundancy analysis（RDA）of the relationship between bacterial phylum and the season parameters

2.5 發(fā)酵床微生物代謝相關(guān)基因的季節(jié)性差異

根據(jù)PICRUSt預(yù)測兩個季節(jié)主要有機物降解途徑，分析細(xì)菌群落對氨基酸、碳水化合物和脂類代謝的相關(guān)基因拷貝數(shù)的季節(jié)差異性。研究發(fā)現(xiàn)夏季高溫條件代謝相關(guān)基因豐度高，有機物代謝活躍（圖7）。夏季發(fā)酵床墊料細(xì)菌氨基酸、碳水化合物和脂類代謝基因的拷貝數(shù)分別為6808477、6480413和2121815，比冬季高27.3%、27.5%和27.1%。如，夏季墊料細(xì)菌群落中參與氨基酸代謝的氨基轉(zhuǎn)移酶、肽酶及脫羧酶的拷貝數(shù)分別為14 327、58 036和17 157，是冬季的1.5、1.3、1.6倍；糖酵解途徑中的葡萄糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶拷貝數(shù)是8048、28 506及4252，為冬季的1.8、1.1、1.3倍；脂類代謝中的羧酸酯酶和甘油磷酸二酯酶是16 860和44 061，為冬季的2.0、1.5倍。根據(jù)PICRUSt的預(yù)測信息，夏季發(fā)酵床細(xì)菌的有機物代謝基因數(shù)量高于冬季，推測夏季發(fā)酵床墊料細(xì)菌的代謝水平高于冬季，與細(xì)菌群落豐度和多樣性指數(shù)高有關(guān)。

圖7 發(fā)酵床細(xì)菌群落氨基酸、碳水化合物和脂類代謝相關(guān)基因的季節(jié)性差異Figure7 Functional prediction of bacterial community in amino acid，carbohydrate and lipid metabolism

3 討論

畜牧業(yè)產(chǎn)生的糞污及其副產(chǎn)物造成的環(huán)境污染是制約我國禽畜養(yǎng)殖健康發(fā)展的一大障礙。規(guī)?；B(yǎng)殖導(dǎo)致大量的糞便集中產(chǎn)生，未經(jīng)處理排放至環(huán)境，會造成水源、土壤和空氣等嚴(yán)重污染[20-21]。采用微生物發(fā)酵的方式處理禽畜糞便，將養(yǎng)殖廢棄物轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)有機肥，可實現(xiàn)資源充分利用。本研究分析了微生物發(fā)酵床夏季和冬季墊料的細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵床的主要細(xì)菌為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和放線菌門。李志宇[22]采用傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)方法以及PCR-DGGE分子技術(shù)分析了發(fā)酵床墊料微生物的多樣性，發(fā)現(xiàn)主要的菌群為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門。朱雙紅[23]采用16S rRNA克隆結(jié)合酶切分型的方式獲得生物發(fā)酵床樣本中的細(xì)菌組成，主要為厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門，這與本研究結(jié)果一致。采用宏基因組方法研究微生物發(fā)酵床中的細(xì)菌組成發(fā)現(xiàn)擬桿菌門占主要優(yōu)勢，約為細(xì)菌總量的30%，而在李志宇[22]和朱雙紅[23]的研究中厚壁菌門是主要細(xì)菌，占細(xì)菌總量的55%以上。由于分子克隆方式通量不夠，不能全面揭示環(huán)境微生物多樣性，這是造成本研究結(jié)果與前人研究差異的主要原因，也說明宏基因組技術(shù)在環(huán)境微生物多樣性研究方面具有明顯優(yōu)勢。微生物發(fā)酵床細(xì)菌群落多樣性分析結(jié)果表明微生物發(fā)酵床含有豐富的細(xì)菌資源，這為進一步挖掘新物種和新功能提供了重要來源。

夏季和冬季發(fā)酵床室溫有所差異，同時夏季和冬季發(fā)酵床墊料的細(xì)菌群落構(gòu)成也不同。夏季優(yōu)勢菌為特呂珀菌屬和漠河菌屬；冬季主要為假單胞菌屬和硫假單胞菌。特呂珀菌屬能夠適應(yīng)高溫環(huán)境，最佳生長溫度為50℃，可利用多種糖類、有機酸和氨基酸[24]，在溫度較高的夏季（平均室溫為30.13℃）相對含量高。漠河桿菌屬于擬桿菌門黃桿菌科，分離于糞便發(fā)酵物[25]，參與糞便的生物降解。夏季高溫下，含量具有顯著差異的特呂珀菌屬和漠河桿菌屬參與高溫下的糞污降解。冬季發(fā)酵床中，假單胞菌屬和硫假單胞菌屬含量明顯高于夏季。假單胞菌分布廣泛，是重要的有機物降解菌[26-27]。分離自厭氧發(fā)酵的活性污泥中的硫假單胞菌是厭氧菌，可以硝酸鹽為電子受體氧化還原活性污泥中的硫化物，參與氮循環(huán)過程[28-29]。微生物發(fā)酵床中的假單胞菌屬和硫假單胞菌屬細(xì)菌可能與低溫下氮的利用相關(guān)。此外，在冬季的墊料樣本中，嗜冷菌屬和冬季微菌屬含量也高于夏季樣本。嗜冷菌屬是變形菌門莫拉氏菌科好寒或耐寒的細(xì)菌，常分布于潮濕、冷鹽的環(huán)境中，在溫暖和低鹽的環(huán)境中也有分布，在食品發(fā)酵中起重要作用[30]。冬季微菌屬是適冷性細(xì)菌，最適生長溫度為16～19℃[31]，在冬季發(fā)酵床平均室溫約為16℃，適合生長。冬季微生物發(fā)酵床適冷菌和嗜冷菌含量高，與冬季發(fā)酵床較低的溫度相關(guān)。綜上，溫度是影響發(fā)酵床墊料中細(xì)菌多樣性的重要因素之一。

微生物能夠通過有氧或厭氧發(fā)酵降解糞污中的有機物并產(chǎn)生能量[32]，目前已經(jīng)有多種微生物和復(fù)合微生物菌劑應(yīng)用于養(yǎng)殖廢棄物處理中。肖翰等[33]將微生物菌劑接種至發(fā)酵床墊料中，發(fā)現(xiàn)接種菌劑能夠顯著提高微生物數(shù)量、發(fā)酵溫度以及各種酶的活性。王義祥等[34]將復(fù)合EM菌劑添加至堆肥發(fā)酵系統(tǒng)，促進了有機質(zhì)的礦化分解和提高腐殖化指數(shù)。復(fù)合微生物菌劑是一種多菌種共存的生物體系，每種微生物有各自特定的生活環(huán)境，許多微生物性能需在特定的環(huán)境中表達(dá)。因此，菌劑環(huán)境的適應(yīng)性研究是復(fù)合微生物菌劑開發(fā)中的關(guān)鍵。墊料中的細(xì)菌包括能在較高溫度下起降解作用的嗜熱菌特呂珀菌屬、漠河桿菌屬、紫單胞菌科、間孢囊菌科及微球菌目的細(xì)菌，也包含低溫降解菌如假單胞菌屬、乳酸桿菌屬、黃桿菌屬等。微生物發(fā)酵床中的這些細(xì)菌表現(xiàn)出對高溫和低溫環(huán)境的適應(yīng)性，為降解養(yǎng)殖廢棄物復(fù)合微生物菌劑的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

本研究揭示了夏、冬季節(jié)發(fā)酵床細(xì)菌的多樣性及其分布特征的差異性：夏季微生物發(fā)酵床中的放線菌和嗜熱菌等有機質(zhì)降解菌含量高，促進夏季高溫條件下的豬糞降解；在冬季低溫條件下嗜冷菌和適冷菌含量高，促進豬糞在較低溫度下的降解。對夏、冬季節(jié)細(xì)菌多樣性的分析有助于研究細(xì)菌與環(huán)境的協(xié)同適應(yīng)，發(fā)掘發(fā)酵床中蘊藏的耐熱、嗜冷和嗜鹽等嗜極細(xì)菌資源；同時為夏、冬季節(jié)發(fā)酵床的維護提供理論依據(jù)，促進以發(fā)酵床設(shè)施處理養(yǎng)殖廢棄物技術(shù)的發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究揭示了夏、冬季節(jié)發(fā)酵床墊料細(xì)菌群落構(gòu)成，優(yōu)勢菌為擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和放線菌門。夏、冬季節(jié)墊料細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同，前者有更為豐富的細(xì)菌類群。夏季樣本中的放線菌門和異常球菌-棲熱菌門的含量高于冬季樣本；異常球菌-棲熱菌門的特呂珀菌屬含量高于冬季樣本。冬季樣本中的擬桿菌門和變形菌門含量高于夏季樣本；擬桿菌門的嗜蛋白菌屬、冬季微菌屬和黃桿菌屬以及變形菌門的假單胞菌屬、硫假單胞菌屬和嗜冷菌屬含量高于夏季墊料。季節(jié)性溫度影響微生物發(fā)酵床細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與代謝水平。

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