吳蔓莉，張 晨，祁燕云，葉茜瓊，祝長(zhǎng)成

（西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710055）

西北地區(qū)是我國(guó)重要的石油生產(chǎn)地，石油的開(kāi)采在給當(dāng)?shù)貛?lái)經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，不可避免地帶來(lái)環(huán)境污染問(wèn)題。目前西北地區(qū)的石油污染土壤問(wèn)題十分嚴(yán)重，許多學(xué)者對(duì)當(dāng)?shù)氐氖臀廴厩闆r進(jìn)行了調(diào)查研究[1-2]。劉培等[3]的調(diào)查結(jié)果表明，陜北某采油區(qū)油井周?chē)蜔N含量高達(dá)10 850～13 488 mg·kg-1，是土壤背景值的21～27倍，石油污染使土壤在有機(jī)質(zhì)含量、總烴含量及生態(tài)毒性等方面均達(dá)到重度污染水平，污染情況十分嚴(yán)重。因此，如何有效去除黃土壤中的石油污染物，已經(jīng)成為當(dāng)?shù)刎叫杞鉀Q的主要環(huán)境問(wèn)題。

利用微生物修復(fù)法處理石油污染土壤具有成本低、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為廣泛采用的土壤修復(fù)技術(shù)[4-5]。微生物修復(fù)技術(shù)包括微生物強(qiáng)化（Bioaugmentation）和微生物刺激（Biostimulation）兩種方法[6-7]。微生物強(qiáng)化是指通過(guò)向污染場(chǎng)地中投加高效降解菌以加快污染物降解的方法。一般在功能性降解菌數(shù)量較少的污染土壤中，利用微生物強(qiáng)化法進(jìn)行修復(fù)效果較好[8-10]。微生物刺激是指通過(guò)向污染場(chǎng)地添加烴降解菌生長(zhǎng)所需的氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素以及H2O2、O2等電子受體，通過(guò)刺激微生物的生長(zhǎng)而達(dá)到加速降解石油污染物的目的[11-13]。多數(shù)研究認(rèn)為，當(dāng)土壤的碳氮磷比為100/10/1時(shí)，降解菌的活性最強(qiáng)，有利于土壤中污染物的去除[14-15]。

在對(duì)油污土壤進(jìn)行生物修復(fù)處理時(shí)，石油烴的去除效果既與土壤濕度、pH、通氧量、養(yǎng)分等土壤環(huán)境因素有關(guān)，也受土壤功能性微生物數(shù)量和活性的影響。楊茜等[13]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對(duì)陜北地區(qū)黃土壤進(jìn)行生物修復(fù)時(shí)，通過(guò)補(bǔ)充氮磷進(jìn)行生物刺激的修復(fù)效果好于投加降解菌進(jìn)行的生物強(qiáng)化修復(fù)。Haghollahi A等[16]的研究結(jié)果表明，在利用生物法對(duì)沙子、黏質(zhì)土、粗粒土中的石油烴分別進(jìn)行270 d的修復(fù)時(shí)，存在于沙子中的石油烴去除率可達(dá)到70%以上，而黏質(zhì)土中石油烴的去除率僅為23.5%，說(shuō)明土壤有機(jī)質(zhì)是影響石油烴去除的重要影響因素。研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)土壤濕度為10%時(shí)，對(duì)石油烴去除效果較好。繼續(xù)增加土壤濕度對(duì)石油烴的去除無(wú)顯著性的影響。

盡管文獻(xiàn)對(duì)影響石油烴去除的因素進(jìn)行了研究報(bào)道，但是，不同因素對(duì)土壤中石油烴去除效果的影響程度存在差異。文獻(xiàn)對(duì)于影響修復(fù)效果的限制性因素報(bào)道相對(duì)較少。本論文利用微生物強(qiáng)化和微生物刺激兩種方法對(duì)西北地區(qū)石油污染黃土壤進(jìn)行模擬修復(fù)研究，以期確定適合黃土壤中石油污染物去除的生物修復(fù)方法，并利用SPSS軟件分析土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、降解菌數(shù)量及不同組分烴之間的相關(guān)關(guān)系，以期明確影響黃土壤中石油烴降解的限制性因素。研究結(jié)果對(duì)于探明黃土壤中石油烴的微生物去除特性及影響石油烴去除的限制性因素具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 供試土壤及測(cè)定方法

石油污染土壤采自甘肅慶陽(yáng)某油井周?chē)?，土樣?jīng)除雜、碎散、過(guò)篩（0.85 mm）、混勻后密封儲(chǔ)存在塑料袋中，以備實(shí)驗(yàn)使用。

土壤性質(zhì)測(cè)定方法：土壤含水率、總有機(jī)碳、總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效磷的測(cè)定方法見(jiàn)“土壤分析技術(shù)規(guī)范”[17]，土壤中石油烴的測(cè)定采用超聲波提取-重量法測(cè)定[18]，利用層析法分離總石油烴中的烷烴和多環(huán)芳烴并采用GC-MS進(jìn)行測(cè)定[19]。石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴降解菌數(shù)量的測(cè)定采用最大可能計(jì)數(shù)法[20]。測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 石油污染土壤的生物與理化性質(zhì)Table1 Physical and biochemical properties of the petroleum-contaminated soil

1.2 石油烴降解菌群的富集篩選

取5 g石油污染土壤接種于含有50 mL滅菌的磷酸鹽緩沖溶液中，150 r·min-1、30 ℃振蕩培養(yǎng) 2 h。吸取5 mL培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接到以石油烴為唯一碳源的100 mL PBS緩沖液中，相同條件下振蕩培養(yǎng)7 d。如此連續(xù)富集培養(yǎng)3次，將最后一次培養(yǎng)液在4℃、10 000 r·min-1條件下離心 10 min，棄去上清液，向離心管中加入30 mL PBS緩沖液，搖勻，在相同條件下離心10 min，棄去上清液；如此反復(fù)5次。用PBS調(diào)節(jié)混菌懸液OD值為1.0（600 nm處測(cè)定）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

生物強(qiáng)化修復(fù)處理（BA）：向800 g供試土壤中加入1.2中獲得的石油烴降解菌群混菌懸液10 mL（OD600=1.0），使土壤中外加降解菌個(gè)數(shù)為108cfu·g-1。

生物刺激修復(fù)處理（BS）：向800 g土壤中加入1.202 3 g NH4NO3和 0.504 9 g KH2PO4，使土壤 C∶N∶P=100∶10∶1。

自然衰減（CK）：取800 g供試土壤，不進(jìn)行任何處理作為控制實(shí)驗(yàn)（CK）。

每種處理3個(gè)平行，室溫條件下，連續(xù)進(jìn)行5周的修復(fù)。

每周取2 g土樣，分別對(duì)土壤中不同組分烴、不同功能降解菌數(shù)、不同形態(tài)氮、有效磷含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和處理

利用SPSS19.0軟件對(duì)不同組分烴、土壤氮、磷營(yíng)養(yǎng)含量以及降解菌數(shù)量的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。利用單因素方差分析（ANOVA），在P＜0.05水平時(shí)對(duì)總菌、石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴降解菌數(shù)量、不同形態(tài)氮及有效磷含量、不同組分烴含量進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，利用雙變量法（Pearson相關(guān)系數(shù)）進(jìn)行相關(guān)性分析[21]。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物修復(fù)對(duì)不同組分烴的去除作用

不同修復(fù)處理對(duì)土壤中總石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴的去除情況如圖1a、圖1b、圖1c所示。石油污染土壤中初始石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴的含量分別為18 800±115.4、13 266±500.0、3066±333.3 mg·kg-1。經(jīng)過(guò)5周的修復(fù)，自然衰減（CK）土壤中石油烴、烷烴和多環(huán)芳烴的含量變?yōu)?18 033±233.3、13 516±316.7、2416±50.6 mg·kg-1，三種烴的去除率分別為（4.08±0.02）%、（-1.88±0.01）%、（21.23±0.07）%；生物強(qiáng)化處理的土壤中（BA）石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴的含量為17 916±383.3、13 016±183.3、2050±116.7 mg·kg-1，去除率分別為（4.70±0.03）%、（1.88±0.05）%、（33.14±0.16）%；生物刺激處理的土壤中（BS）石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴的含量為 16 066±66.7、10 350±183.3、2050±216.7 mg·kg-1，三種烴的去除率分別為（14.54±0.01）%、（21.98±0.04）%、（33.14±0.13）%。相比自然衰減和生物強(qiáng)化的修復(fù)處理，利用生物刺激修復(fù)可對(duì)黃土壤中總石油烴、烷烴和多環(huán)芳烴起到較好的去除作用。

石油烴組分中，烷烴比多環(huán)芳烴易于被微生物降解[11，14]。但在本研究中，三種不同處理土壤中的烷烴去除率均低于多環(huán)芳烴去除率，可能的原因是由于本次實(shí)驗(yàn)使用的是經(jīng)過(guò)了一次生物修復(fù)處理的油污土壤，一些易降解烴類已在第一期修復(fù)中大部分被去除。

圖1 土壤中不同組分烴的濃度變化Figure1 The concentrations of different fractional petroleum hydrocarbons in cultivated loessial soil

生物強(qiáng)化技術(shù)的核心是投加高效降解菌。但是外源微生物添加至污染土壤中后一般會(huì)受到土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)而發(fā)生拮抗，從而影響生物強(qiáng)化處理效果[22-23]。因此，有研究認(rèn)為從石油污染土壤中直接分離出具有石油降解能力的土著微生物，將其富集后重新投加到石油污染土壤中進(jìn)行生物強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)，會(huì)取得較好的修復(fù)效果[10，24]。本次研究中，利用從石油污染土壤中富集的降解菌對(duì)原污染土壤進(jìn)行了生物強(qiáng)化修復(fù)，對(duì)土壤中的多環(huán)芳烴起到了較好的降解作用，但是對(duì)烷烴和總石油烴的去除效果相對(duì)較差。利用生物刺激法對(duì)黃土壤中不同組分石油烴的去除作用較好。

楊茜等[13]對(duì)陜北子長(zhǎng)石油污染黃土壤進(jìn)行生物修復(fù)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，加入氮磷營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生物刺激好于投加降解菌進(jìn)行生物強(qiáng)化的修復(fù)效果。劉五星等[25]對(duì)南京近郊煉油廠附近的污染潮土進(jìn)行生物修復(fù)處理研究表明，添加氮磷等營(yíng)養(yǎng)后，土壤中烴降解菌明顯增加，石油降解速率顯著加快，但接種菌劑以及定期翻動(dòng)對(duì)石油烴降解率沒(méi)有顯著影響。這些結(jié)果說(shuō)明對(duì)于西北地區(qū)石油污染的黃土壤及我國(guó)南方一些不同土質(zhì)的土壤，利用生物刺激法進(jìn)行修復(fù)對(duì)石油烴的去除效果好于生物強(qiáng)化修復(fù)。

2.2 土壤不同形態(tài)氮的變化規(guī)律

修復(fù)過(guò)程中土壤不同形態(tài)氮的變化情況如圖2a、圖 2b、圖 2c所示。

土壤中硝態(tài)氮的初始含量為12.4±0.05 mg·kg-1。整個(gè)修復(fù)過(guò)程中CK、BA處理的土壤中硝態(tài)氮的含量基本保持不變，BS處理中由于加入硝酸銨進(jìn)行生物刺激處理，使得土壤中硝態(tài)氮的含量增加至248.2±3.71 mg·kg-1，修復(fù)前3周呈增加趨勢(shì)，第4周時(shí)開(kāi)始降低。說(shuō)明本次修復(fù)中對(duì)硝態(tài)氮幾乎不利用。

土壤中銨態(tài)氮的初始含量為0.84±0.05 mg·kg-1，BA處理中銨態(tài)氮含量在第1周增加至5.21±0.17 mg·kg-1，第2周后開(kāi)始降低，修復(fù)5周后穩(wěn)定在1.38±0.08 mg·kg-1左右。BS處理中由于添加了硝酸銨，使得土壤中銨態(tài)氮含量增加至210.4±4.32 mg·kg-1，修復(fù)1周后，土壤中銨態(tài)氮含量降低為171.6±1.68 mg·kg-1。在此后的3周內(nèi)持續(xù)降低，修復(fù)第5周時(shí)降低為97.2±0.43 mg·kg-1。說(shuō)明在進(jìn)行生物刺激處理的土壤中微生物在降解石油烴過(guò)程中對(duì)銨態(tài)氮有所利用。

一些研究認(rèn)為，生物修復(fù)油污土壤過(guò)程中存在著氮的遷移轉(zhuǎn)化及利用過(guò)程。葉茜瓊等[11]對(duì)西北地區(qū)石油污染黃土壤的修復(fù)研究結(jié)果表明，合并生物強(qiáng)化與生物刺激處理油污土壤可使總氮、氨氮含量呈先增加、后降低的趨勢(shì)，而硝態(tài)氮的含量在修復(fù)前期降低，修復(fù)后期基本不變。本研究中，修復(fù)過(guò)程中消耗了銨態(tài)氮，對(duì)硝態(tài)氮幾乎不利用。可能是由于本次修復(fù)中，對(duì)油污土壤進(jìn)行了單獨(dú)生物強(qiáng)化和生物刺激處理，其土壤修復(fù)機(jī)制與同時(shí)進(jìn)行生物強(qiáng)化和生物刺激修復(fù)的機(jī)制有所不同，造成了對(duì)不同形態(tài)氮利用上的差異。

圖2 土壤中不同形態(tài)氮濃度變化Figure2 The changes of various of nitrogen in different treatments

2.3 土壤有效磷變化規(guī)律

如圖3所示，土壤中有效磷的初始濃度為11.8±0.14 mg·kg-1，在整個(gè)修復(fù)過(guò)程中，CK處理的土壤中有效磷濃度保持在（12.3±0.15）～（15.6±0.50）mg·kg-1之間，BA處理中，由于投加的菌懸液中有磷酸鹽緩沖液，使土壤中有效磷濃度增加至（22.2±1.20）～（26.2±0.15）mg·kg-1，并在修復(fù)期間保持不變；BS 處理中KH2PO4的添加使有效磷的濃度增加至93.5±2.5 mg·kg-1，在修復(fù)的第 4、5 周降低至 84.1±1.53 mg·kg-1和87.4±0.75 mg·kg-1。

許多文獻(xiàn)研究認(rèn)為，向土壤中添加氮磷營(yíng)養(yǎng)有利于土壤中石油烴的去除[14-15，25]。然而，對(duì)于修復(fù)過(guò)程中有效磷含量變化的研究，文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少。本研究中通過(guò)測(cè)定修復(fù)過(guò)程中有效磷的含量變化發(fā)現(xiàn)，生物刺激修復(fù)過(guò)程中對(duì)有效磷有一定的消耗作用，而生物強(qiáng)化修復(fù)過(guò)程中有效磷的含量基本保持不變。

圖3 土壤中有效磷濃度變化Figure3 The changes of available phosphorus in different treatments

圖4 土壤降解菌數(shù)量變化Figure4 The counts of hydrocarbon degraders in different treatments

2.4 土壤微生物變化規(guī)律

如圖4所示，修復(fù)處理前，污染土壤中總細(xì)菌數(shù)和石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴降解菌數(shù)量分別為1.78×108CFU·g-1和 2.95×105、2.95×105、5.75×102MPN·g-1。

與CK與BS相比，BA處理的土壤中石油烴降解菌數(shù)量最多，在修復(fù)期間達(dá)到1.10×107MPN·g-1并基本保持不變；烷烴降解菌數(shù)在修復(fù)第1周時(shí)達(dá)到最大（2.85×107MPN·g-1），第 2 周后開(kāi)始迅速降低，修復(fù)結(jié)束時(shí)降低至2.96×105MPN·g-1；土壤中多環(huán)芳烴降解菌數(shù)量在整個(gè)修復(fù)過(guò)程中基本保持不變。

BS處理的土壤中，石油烴、烷烴降解菌數(shù)均在修復(fù)第2周時(shí)達(dá)到最大，分別為4.30×107MPN·g-1和1.25×107MPN·g-1，第2周后開(kāi)始降低，修復(fù)結(jié)束時(shí)石油烴和烷烴降解菌數(shù)分別降低至1.60×105MPN·g-1和2.96×105MPN·g-1；土壤中多環(huán)芳烴降解菌在修復(fù)第1周時(shí)數(shù)量最多，由初始時(shí)的5.75×102MPN·g-1增加至1.60×105MPN·g-1，第 5 周時(shí)減少至 7.08×103MPN·g-1。

土壤微生物是利用生物法去除石油烴的核心資源。許多文獻(xiàn)對(duì)于修復(fù)過(guò)程中降解菌數(shù)量變化進(jìn)行了報(bào)道。楊茜[13]、Wu[19-20]、劉五星[25]等的研究結(jié)果表明，添加氮磷等營(yíng)養(yǎng)使土壤中的烴降解菌數(shù)量明顯增加，石油降解速率加快。盡管直接投加菌劑也會(huì)使土壤中的降解菌數(shù)量增加，但是總體上接種菌劑的土壤中降解菌數(shù)量比添加氮磷營(yíng)養(yǎng)的土壤中少。

本研究中，生物刺激作用使土壤中多環(huán)芳烴降解菌數(shù)量在修復(fù)前期顯著增加，而生物強(qiáng)化處理的土壤中總石油烴降解菌數(shù)多于生物刺激處理的土壤。但總體上，與不經(jīng)處理的土壤相比，生物強(qiáng)化和生物刺激均可顯著增加土壤中石油烴、烷烴降解菌的數(shù)量，研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

2.5 相關(guān)性分析

本次研究中，利用生物刺激法（BS）可有效去除石油污染黃土壤中的總石油烴、烷烴和多環(huán)芳烴。為了進(jìn)一步研究影響不同組分烴去除的主要因素，利用SPSS19.0軟件對(duì)生物刺激處理的土壤中不同組分烴含量與降解菌數(shù)量以及氮磷含量進(jìn)行相關(guān)性分析。所得結(jié)果如表2所示。

BS處理中，土壤石油烴含量與土壤總氮、銨態(tài)氮、有效磷濃度、細(xì)菌總數(shù)及烷烴降解菌數(shù)顯著相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為 0.641、0.793、0.570、0.693、0.571）；烷烴含量與土壤銨態(tài)氮濃度、石油烴降解菌數(shù)顯著相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為0.508、0.552）；多環(huán)芳烴含量與有效磷濃度顯著相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.543）；土壤銨態(tài)氮濃度與石油烴降解菌數(shù)量、烷烴降解菌數(shù)量和細(xì)菌總數(shù)顯著相關(guān)。結(jié)果表明，向土壤中添加銨態(tài)氮可刺激土壤中石油烴和烷烴降解菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)土壤中的石油烴和烷烴的降解起到促進(jìn)作用。影響石油污染黃土壤生物修復(fù)作用的限制性因素為土壤中銨態(tài)氮和有效磷含量。

表2 生物刺激處理的土壤中各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析（r）Table2 Correlation analysis of different impact factors in biostimulation treatment（r）

3 結(jié)論

（1）經(jīng)過(guò)5周的修復(fù)，生物刺激法處理的土壤中石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴去除率分別為14.54%、21.98%和33.14%。與自然衰減和生物強(qiáng)化處理相比，利用微生物刺激法可有效去除黃土壤中的石油烴。

（2）生物刺激修復(fù)處理的土壤中銨態(tài)氮濃度隨修復(fù)時(shí)間的增加而降低，土壤中硝態(tài)氮濃度幾乎不發(fā)生變化，石油烴降解過(guò)程中需利用銨態(tài)氮和有效磷，對(duì)硝態(tài)氮幾乎不利用。與自然衰減的土壤相比，生物刺激可增加土壤中石油烴、烷烴、多環(huán)芳烴降解菌的數(shù)量。

（3）影響石油污染黃土壤生物修復(fù)作用的限制性因素為土壤中銨態(tài)氮和有效磷含量，向土壤中添加氮磷營(yíng)養(yǎng)可刺激土壤中烴降解菌的生長(zhǎng)，從而對(duì)土壤中不同組分烴的降解起到促進(jìn)作用。

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