梁秀美 ，王祥云 ，汪志威 ，齊沛沛 ，王新全 ，王 強(qiáng) 1，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；2.省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地“浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”，農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，杭州 310021；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京 100094；4.溫州科技職業(yè)學(xué)院分析測試中心，溫州 325006）

自然界90%的開花植物和75%的普通作物授粉依賴于昆蟲傳粉，且主要由蜜蜂完成。因此，蜜蜂對于保障食物供給和生物多樣性具有重要意義[1-2]。近年來，歐美地區(qū)蜂群數(shù)量出現(xiàn)了持續(xù)下滑，尤其是2006年冬“蜂群衰竭失調(diào)癥”（Colony Collapse Disorder，CCD）的爆發(fā)，引起了社會(huì)各界的高度關(guān)注[3]。棲息地的減少和碎片化、蜜粉源植物的減少、病原菌、氣候變化、農(nóng)藥的大量使用等因素被認(rèn)為是蜜蜂等授粉昆蟲減少的主要原因[4-5]。其中，吡蟲啉等新煙堿類農(nóng)藥被認(rèn)為對蜜蜂具有特殊的不良影響[6-9]。為此，歐盟于2013年對吡蟲啉等3種煙堿類農(nóng)藥實(shí)施了為期兩年的臨時(shí)限令，禁止其在油菜等蜜粉源作物上使用[10]。

茶樹是我國秋季重要的蜜粉源植物，2015年國家統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示全國茶園面積達(dá)279萬hm2[11]。茶樹具有泌蜜多、花粉豐富的特點(diǎn)，對蜂群秋季繁殖與組織生產(chǎn)十分有利[12-14]。然而，茶樹于秋茶生產(chǎn)末期開花，由于氣候等原因，秋茶生產(chǎn)中蟲害發(fā)生較重，吡蟲啉等殺蟲劑殘留問題較為突出。2016年綠色和平組織公布的調(diào)查報(bào)告顯示，20批次非生態(tài)茶葉中16批次檢出吡蟲啉殘留，殘留量為0.017～0.387 mg·kg-1[15]。雖然茶花粉中吡蟲啉的殘留情況尚無相關(guān)報(bào)道，但其他作物施用吡蟲啉后，其花粉中吡蟲啉及其代謝物殘留檢出情況極為普遍[16-18]。吡蟲啉及其代謝物具有較強(qiáng)內(nèi)吸性，可通過植物韌皮部或木質(zhì)部傳導(dǎo)至作物各部分，從而導(dǎo)致蜜露和花粉中存在相應(yīng)殘留，這也是歐盟禁止吡蟲啉在油菜、向日葵等蜜粉源作物上使用的主要原因之一。因此，茶樹施用吡蟲啉無疑將導(dǎo)致茶花粉中存在吡蟲啉及其代謝物殘留。

農(nóng)藥對蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)評估主要包括危害商（Hazard quotient，HQ）和暴露量/毒性（Exposure toxicity ratio，ETR）等不同方式。我國以及經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）、聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）、歐洲和地中海植物保護(hù)組織（EPPO）等國際組織廣泛采用危害商作為初級風(fēng)險(xiǎn)評估方式，其中歐洲食品安全局（EFSA）還進(jìn)一步采用急性經(jīng)口LD50、成蜂致畸LC50和幼蜂最大無作用劑量（NOEC）等數(shù)據(jù)計(jì)算相應(yīng)ETR，以進(jìn)一步評價(jià)農(nóng)藥使用的蜜蜂風(fēng)險(xiǎn)[19-23]。然而現(xiàn)有吡蟲啉對蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)評估僅限于吡蟲啉母體，其代謝物殘留尚未涉及。Suchail等[24]的研究結(jié)果表明，吡蟲啉的烯烴代謝物等具有與其母體相似的蜜蜂毒性，因此在評估茶花蜂花粉中吡蟲啉殘留對蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)應(yīng)涵蓋其代謝物殘留的影響。本實(shí)驗(yàn)通過茶樹花期用藥的方式，評估吡蟲啉及其代謝物對蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)情況，以期為吡蟲啉在茶樹上的合理使用提供參考依據(jù)。吡蟲啉及其部分代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 吡蟲啉及其部分代謝物結(jié)構(gòu)式Figure1 The structure of imidacloprid and its metabolites

1 材料與方法

1.1 供試生物

茶樹：龍井43。

意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）：由義烏市佛堂鎮(zhèn)養(yǎng)蜂專業(yè)戶提供，全部實(shí)驗(yàn)用蜂均為健康蜂。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照《2013年的浙江省茶樹病蟲害防治藥劑名單》的施用劑量[25]，于2015年10月10日—11月10日在浙江省紹興市富盛鎮(zhèn)御茶村茶葉有限公司茶園（簡稱茶園），進(jìn)行田間模擬試驗(yàn)。

茶園中部設(shè)4座防蟲網(wǎng)大棚以控制蜜蜂采集范圍，每棚0.067 hm2，其中1座為空白對照，其余3座用于模擬實(shí)驗(yàn)，大棚間間隔2 m。施藥前5 d將蜂箱放入大棚內(nèi)，讓蜂群提前適應(yīng)環(huán)境，每個(gè)大棚放置2箱蜂（約2×5000只）。待蜜蜂歸巢后，關(guān)閉巢門并以塑料布覆蓋蜂箱，防止藥液沾染蜜蜂。隨后，以噴霧器噴施10%吡蟲啉可濕性粉劑2000倍液1次（有效成分11.5 g·hm-2）。施藥后第 1、2、3、5、7、8、13、17、18 d 采集蜂花粉樣品。蜂花粉樣品通過巢門處的蜂花粉采集器脫取。由于氣候原因，未能獲得蜂蜜樣品。樣品采集后，于車載冰箱中冷藏保存，并盡快送至試驗(yàn)室，-18℃保存待測。

1.3 樣品檢測

樣品檢測方法詳見文獻(xiàn)[26]，概述如下：5 g蜂花粉樣品中依次加入10 mL水和10 mL 5%甲酸乙腈溶液，渦旋混勻后加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g氯化鈉，手動(dòng)劇烈振搖30 s，離心取上清液；下層樣品再加5 mL 5%的甲酸乙腈溶液重復(fù)提取一次，合并提取液，待凈化。取5 mL合并后的提取液，以EMR凈化管凈化，離心取上清液。上清液以無水硫酸鎂干燥后，用水稀釋1倍，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，LC-MS/MS測定。蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、6-氯煙酸的定量限分別為0.6、12、1.2、45 μg·kg-1，檢測限分別為 0.2、4、0.4、14 μg·kg-1。在定量限、5倍定量限和10倍定量限的添加水平下，方法回收率在85.9%～107%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于8.2%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

按1.3節(jié)樣品檢測方法，對采集的蜂花粉樣品進(jìn)行檢測，得出相應(yīng)結(jié)果，并用Excel軟件進(jìn)行分析。

1.5 風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)方法

1.5.1 危害商（HQ）

本文采用《NY/T 2882.4—2016農(nóng)藥登記環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估指南第4部分：蜜蜂》對蜜蜂的危害商進(jìn)行評估，結(jié)果表述為風(fēng)險(xiǎn)商值[19]。在噴施場景下，采用噴施農(nóng)藥暴露場景的風(fēng)險(xiǎn)商值對蜜蜂進(jìn)行初級風(fēng)險(xiǎn)評估。

風(fēng)險(xiǎn)商值（RQsp）=AR/（LD50×50）

式中：AR為推薦的農(nóng)藥單次最高施用量（g·hm-2）；LD50為經(jīng)口或接觸的蜜蜂半致死劑量（μg·只-1），吡蟲啉對蜜蜂的急性接觸毒性LD50為0.081 μg·只-1[27]。當(dāng)RQsp≤1時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)可接受；當(dāng)RQsp＞1時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)不可接受，需進(jìn)行高級風(fēng)險(xiǎn)評估[19]。

1.5.2 暴露量/毒性（ETR）

ETR包括急性經(jīng)口LD50、成蜂致畸LC50和幼蜂最大無作用劑量（NOEC）等多種評價(jià)內(nèi)容[28]。本研究根據(jù)現(xiàn)有毒理學(xué)數(shù)據(jù)，開展了急性經(jīng)口LD50和成蜂致畸LC50的ETR評價(jià)。

1.5.2.1 急性經(jīng)口（ETRoral）

成蜂急性經(jīng)口ETRoral=RI/LD50oral

式中：LD50oral指經(jīng)口致死中量（μg·只-1）；RI為蜜蜂單日攝入的殘留量（μg·只-1），可由蜂花粉中的殘留量×蜜蜂單日攝食量計(jì)算所得，其中蜜蜂單日蜂花粉攝食量為 0.012 g·只-1。LD50oral源于 Nauen 等[29]的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，吡蟲啉、吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲和6-氯煙酸分別為 0.041、＞0.036、＞99.5 μg·只-1和＞121.5 μg·只-1，參照ESFA計(jì)算規(guī)則直接以相應(yīng)數(shù)值計(jì)算[29]。ETRoral域值為0.2，當(dāng)數(shù)值＞0.2時(shí)，則存在風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)采取進(jìn)一步的評估。

1.5.2.2 成蜂致畸（ETRchronic）

成蜂致畸ETRchronic=RI/LC50

式中：LC50指經(jīng)口致死中濃度（μg·L-1）；RI為蜜蜂單日攝入的殘留量（μg·只-1）。吡蟲啉及其代謝物尚無LC50數(shù)據(jù)，因此在ESFA評價(jià)中建議采用NOEC值替代[27]。本研究采用Nauen等[29]的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，吡蟲啉、吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲和6-氯煙酸的NOEC值分別為0.001 5、0.002 4、1.2 μg·只-1和 121.5 μg·只-1。ETRchronic域值為0.03，當(dāng)數(shù)值＞0.03時(shí)，則存在風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)采取進(jìn)一步的評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物殘留情況

蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物殘留測定結(jié)果見表1。藥后 1 d，吡蟲啉濃度達(dá) 529.21 μg·kg-1，同時(shí)吡蟲啉脲和 6-氯煙酸分別有 18.01 μg·kg-1和 65.79 μg·kg-1殘留檢出，但蜜蜂毒性相對較高的吡蟲啉烯烴尚無檢出。吡蟲啉殘留在藥后13 d出現(xiàn)急劇降低，在試驗(yàn)最后 1 d 仍有 0.26 μg·kg-1檢出，但已低于 0.6 μg·kg-1的定量限；吡蟲啉烯烴則僅在藥后3～8 d檢出3.50～4.76 μg·kg-1，但均低于 12 μg·kg-1的定量限；吡蟲啉脲和6-氯煙酸均從藥后第1 d逐漸升高，直至藥后第8 d達(dá)到峰值，分別為39.80 μg·kg-1和149.75 μg·kg-1，至藥后17 d兩者均無檢出。

2.2 風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果

2.2.1 風(fēng)險(xiǎn)商

本實(shí)驗(yàn)中吡蟲啉的使用劑量為有效成分11.25 g·hm-2，而吡蟲啉對蜜蜂的急性接觸毒性LD50為0.081 μg·只-1。根據(jù)噴施農(nóng)藥暴露場景的 RQsp，可得吡蟲啉在茶樹上使用的危害商為2.8，高于風(fēng)險(xiǎn)可接受閾值。即吡蟲啉在茶樹上的使用對蜜蜂具有不可接受的風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)一步進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。

表1 吡蟲啉及其代謝物在蜂花粉中的殘留量Table1 The residual of imidacloprid and it′s metabolites in pollen

2.2.2急性經(jīng)口

根據(jù)1.5.2.1的計(jì)算公式，結(jié)合表1的蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物殘留結(jié)果（平均值），蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物的急性經(jīng)口ETRoral評價(jià)結(jié)果見表2。從表2結(jié)果可知，茶樹花期用藥后蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物殘留急性經(jīng)口風(fēng)險(xiǎn)最高為0.15，低于ESFA的0.2閾值，即急性經(jīng)口風(fēng)險(xiǎn)可接受。此外，吡蟲啉代謝物占總體風(fēng)險(xiǎn)比例較低，最高的藥后8 d時(shí)的吡蟲啉烯烴也僅占當(dāng)日總風(fēng)險(xiǎn)的1.6%。

表2 蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物殘留量對蜜蜂的急性經(jīng)口暴露風(fēng)險(xiǎn)（ETRoral）Table2 The ETRoralvalues of imidacloprid and its metabolites in bee pollen for honey bee

表3 蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物殘留量對蜜蜂的成蜂致畸風(fēng)險(xiǎn)（ETRchronic）Table3 The ETRchronicvalues of imidacloprid and its metabolites in bee pollen for honey bee

2.2.3 成蜂致畸

根據(jù)1.5.2.2的計(jì)算公式，結(jié)合表1的蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物殘留結(jié)果（平均值），蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物的急性經(jīng)口ETRchronic評價(jià)結(jié)果見表3。從表3結(jié)果可知，茶樹花期用藥后蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物殘留成蜂致畸風(fēng)險(xiǎn)最高為藥后1 d，達(dá)4.2，遠(yuǎn)高于ESFA的0.03閾值，直到藥后17 d ETRchronic才降至0.03以下，即具有極高的成蜂致畸風(fēng)險(xiǎn)。此外，吡蟲啉代謝物占總體風(fēng)險(xiǎn)比例較低，相對較高的吡蟲啉烯烴也僅占當(dāng)日總風(fēng)險(xiǎn)的1%以下。

3 討論

由于吡蟲啉的廣泛使用，世界各地蜂花粉中均檢出不同程度的吡蟲啉及其代謝物殘留，但濃度跨度較大。法國2002—2004年的連續(xù)監(jiān)測試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)69%的蜂花粉樣品中檢出吡蟲啉或其代謝物6-氯煙酸，殘留量分別為 1.1～5.7 μg·kg-1和 0.6～9.3 μg·kg-1[30]；美國2007—2008年的350份花粉中雖僅有2.9%的樣品檢出吡蟲啉，但殘留量最高達(dá) 992 μg·kg-1[31]；意大利2012—2014年采集的554份蜂花粉中12.5%樣品檢出吡蟲啉，殘留量為 1～19 μg·kg-1[32]。土壤拌種、灌根和葉面噴霧等施藥方式以及距離花期時(shí)間的不同，可能是導(dǎo)致蜂花粉中吡蟲啉殘留濃度差異的主要原因。Dively等[33]研究了不同施藥條件下南瓜花粉中吡蟲啉的殘留情況，結(jié)果表明在移植3周滴灌給藥后花粉中的殘留量可達(dá) 52.3～101 μg·kg-1，而苗床給藥僅產(chǎn)生3.3～6.7 μg·kg-1的殘留。由于國內(nèi)外吡蟲啉主要施藥方式的差異，未能查詢到吡蟲啉花期葉面噴霧施藥后花粉中的殘留情況，但據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[33]推測吡蟲啉花期葉面噴霧可能帶來更大殘留。因此，為保障蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全，應(yīng)限制臨近茶樹花期時(shí)吡蟲啉的使用，具體的安全間隔期仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)確認(rèn)。

雖然蜂花粉等蜂產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留對蜜蜂風(fēng)險(xiǎn)評估已有部分報(bào)道[34-35]，但基于權(quán)威性的考慮，本文最終采用歐盟官方機(jī)構(gòu)EFSA的模型進(jìn)行評估[27]。此外，在采用相同模型和閾值的情況下，不同來源數(shù)據(jù)的采用可能導(dǎo)致截然不同的評價(jià)結(jié)果。本文中，吡蟲啉急性接觸LD50采用EFSA評估報(bào)告所用的0.081 μg·只-1，評價(jià)結(jié)果與EFSA評價(jià)結(jié)果相同，均為不可接受；但急性經(jīng)口LD50為與其代謝物數(shù)據(jù)相匹配，采用文獻(xiàn)數(shù)據(jù)（0.041 μg·只-1），而 EFSA 采用 0.003 7 μg·只-1，結(jié)果導(dǎo)致吡蟲啉本次急性經(jīng)口風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)可接受，但EFSA評價(jià)結(jié)果為不可接受。

為得到更準(zhǔn)確的評估結(jié)果，EFSA在風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)過程中對各種不同施藥場景采用不同系數(shù)計(jì)算農(nóng)藥暴露量。條件所限，本次評價(jià)中所用殘留數(shù)據(jù)具有一定的局限性，更準(zhǔn)確的評價(jià)需進(jìn)一步開展大田試驗(yàn)。本場景中，采用防蟲網(wǎng)封閉的方式使得蜜蜂僅能采集吡蟲啉噴施后的蜂花粉樣品，而且噴施時(shí)間為茶樹始花期，相對實(shí)際情況而言，蜂花粉中吡蟲啉殘留易偏高。此外，茶樹蜂花粉具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，我國蜂農(nóng)通常收集后用于販賣，并不會(huì)任由蜜蜂食用，使得蜜蜂的實(shí)際暴露風(fēng)險(xiǎn)低于評價(jià)結(jié)果。然而，本實(shí)驗(yàn)中吡蟲啉的使用劑量為11.25 g·hm-2，而目前中國農(nóng)藥信息網(wǎng)登記的吡蟲啉在茶樹上的最高推薦劑量為42 g·hm-2[36]，比本實(shí)驗(yàn)高近3倍。若在山谷等半封閉環(huán)境內(nèi)，吡蟲啉按現(xiàn)有最高推薦劑量（42 g·hm-2）在茶樹盛花期時(shí)使用，可能對蜜蜂帶來較為嚴(yán)重的后果。因此，本文認(rèn)為吡蟲啉在茶樹上葉面噴霧，至少在花期附近使用，對蜜蜂有一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)，需進(jìn)一步開展試驗(yàn)和風(fēng)險(xiǎn)評估以確保安全性。

4 結(jié)論

（1）以風(fēng)險(xiǎn)商值（RQsp）進(jìn)行初級風(fēng)險(xiǎn)評估時(shí)，吡蟲啉在茶樹上的使用對蜜蜂具有不可接受的急性接觸風(fēng)險(xiǎn)。

（2）以ETR進(jìn)行急性經(jīng)口評估時(shí)，其茶樹上的使用風(fēng)險(xiǎn)為可接受。

（3）以ETR進(jìn)行成蜂致畸評估時(shí)，其茶樹上的使用風(fēng)險(xiǎn)為藥后前13 d不可接受。

（4）本次評價(jià)結(jié)果顯示，吡蟲啉對蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)絕大多數(shù)源于吡蟲啉母體，占比超過98%。

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