，，，，，，，

1.山西醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)院消化內(nèi)科，山西 太原 030001；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院重癥肝病科；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院北京市肝病研究所；4.山西省腫瘤醫(yī)院 山西省腫瘤研究所

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of kaempferol on the apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells.MethodsHepG2 cells were incubated with different concentrations of kaempferol for 24 hours to select the best drug concentration (100 μmol/L), and HepG2 cells were incubated at different times. Cell viability was measured by MTT assay; lactate dehydrogenase (LDH) activity in cell supernatants was measured by LDH assay kit; apoptosis was measured by flow cytometry. The expression of apoptosis-related protein was detected by Western blotting.ResultsKaempferol had the induced effect on apoptosis of HepG2 cells in a dose- and time-dependent. When HepG2 cells were treated with kaempferol for 24 hours, the cells viability was gradually decreased and the apoptotic rate was increased gradually with the increase of kaempferol concentrations. Compared with the normal control group, in the 100 μmol/L kaempferol for 24 hours group, the cells survival rate was significantly decreased [(60.58±3.74)%vs(100±2.28)%,P<0.0001], and the apoptotic rate was significantly increased [(16.43±0.07)%vs(0.68±0.09)%,P<0.0001]. The expression of apoptotic factor Cleaved-caspase3 protein was increased with the increase of kaempferol concentrations， HepG2 cells were incubated with kaempferol for 24 hours by Western blotting. When the kaempferol concentration was 100 μmol/L, the apoptotic rate also was increased gradually with the prolongation of time when HepG2

cells were incubated with kaempferol. Compared with the normal control group, in the 100 μmol/L kaempferol for 24 hours group, the cell survival rate was significantly decreased [(59.36±3.09)%vs(100±2.28)%,P<0.0001], and the apoptotic rate was significantly increased [(16.71±1.12)%vs(0.35±0.01)%,P<0.0001]. The expression of apoptotic factor Cleaved-caspase3 was increased with the prolongation of time.ConclusionKaempferol has an induced effect on the apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 cells in dose- and time-dependent. It indicats that high concentration of kaempferol could induce the apoptosis of HepG2 cells by promoting the expression of apoptotic factor Cleaved-caspase3, and thus it has the potential effect on anti-hepatocarcinoma activity.

【Keywords】 Kaempferol； HepG2 cells； Cell apoptosis； Mechanism

山萘酚是一種多酚類抗氧化物，為天然黃酮類化合物的一種(化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)，其主要來源于姜科植物山萘的根莖，中草藥淫羊藿、石菖蒲、苦參、山豆根等均含有此成分，同時廣泛存在于日常食用的蔬菜、水果當(dāng)中。山萘酚具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、保肝等功效。據(jù)研究證實(shí)，山萘酚可通過阻礙NF-κB信號通路來抑制炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)，可對因?yàn)檠装Y因子誘發(fā)的哮喘、肝細(xì)胞炎癥等發(fā)揮預(yù)防及治療作用；山萘酚具有激活過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR-γ)的作用，從而提高胰島素敏感性，增強(qiáng)葡萄糖儲存能力，其中PPAR-γ激動劑已成為脂質(zhì)代謝異常和2型糖尿病的常用藥物，據(jù)此推測山萘酚將可能成為治療糖尿病的臨床用藥；山萘酚還可提高細(xì)胞氧化應(yīng)激能力，降低活性氧的產(chǎn)生，有顯著的抗氧化活性，具有抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷作用。山萘酚不僅有如上作用，還有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的功效，據(jù)相關(guān)研究[5-8]表明，山萘酚有抗胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌等功能，然而關(guān)于山萘酚對肝癌的研究為數(shù)甚少且相關(guān)機(jī)制說法不一。所以本次研究通過體外實(shí)驗(yàn)，來探討山萘酚對于人類肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響，從而為日后山萘酚用于藥品研發(fā)及肝癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 山萘酚化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 The chemical structure of kaempferol

1 材料與方法

1.1材料山萘酚(純度>95%)、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；噻唑藍(lán)(MTT)購自美國Amresco公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司；乳酸脫氫酶(LDH)活力定量檢測試劑盒購自普利萊基因技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購自美國Thermo公司；β-actin、Cleaved-caspase3抗體和辣根酶標(biāo)記兔抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞購自美國ATCC公司，于含質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中(孵箱氣體體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、溫度為37 ℃、飽和濕度)傳代培養(yǎng)。

1.3藥品配制山萘酚溶于DMSO，配制為5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的儲存濃度。

1.4藥物干預(yù)取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板里培養(yǎng)，24 h后換成含有山萘酚濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的培養(yǎng)基，同時設(shè)溶劑對照組(DMSO終濃度為2 g/L)和空白對照組，孵育HepG2細(xì)胞24 h。再以濃度為100 μmol/L山萘酚的培養(yǎng)基孵育HepG2細(xì)胞3 h、6 h、12 h、24 h。

1.5MTT法檢測細(xì)胞存活率按上述方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT(0.5 mg/ml)200 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去MTT，每孔加DMSO 150 μl，震蕩器震蕩10 min，于酶標(biāo)儀490 mm處波長測定吸光度值(OD值)，計算細(xì)胞存活率，公式如下：細(xì)胞相對存活率(%)=(藥物處理組OD值-空白對照組OD值)/(溶劑對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.6細(xì)胞上清LDH檢測按上述方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)后，留取細(xì)胞上清液，按LDH試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測定A440值，根據(jù)標(biāo)曲計算細(xì)胞上清液LDH活性單位。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測山萘酚干預(yù)HepG2細(xì)胞對凋亡的影響細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)如上，收集細(xì)胞上清置于15 ml離心管中，用質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰酶消化細(xì)胞，并將細(xì)胞收集于同一離心管中，離心，1 000 r/min，離心半徑為5 cm，5 min，棄掉細(xì)胞上清，用1×PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500 μl結(jié)合緩沖液，將細(xì)胞移入流式管，每管加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光，室溫放置15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.8蛋白印記法檢測Cleaved-caspse3蛋白的表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)如上，棄上清，用1×PBS洗3次，收集細(xì)胞于1.5 ml離心管中，每管加入500 μl細(xì)胞裂解液(含有蛋白酶抑制劑)，-80 ℃與4 ℃之間反復(fù)凍融3次，定量后取適量蛋白上樣，質(zhì)量濃度為120 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜(聚偏氟乙烯膜，30 V，4 ℃，過夜)，一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，1.5 h，二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，1.5 h。取等量的ECL化學(xué)發(fā)光試劑A液和B液混勻后孵育聚偏氟乙烯膜，壓片曝光。

2 結(jié)果

2.1山萘酚對HepG2細(xì)胞存活率的影響山萘酚作用于HepG2細(xì)胞24 h后，5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L山萘酚組細(xì)胞的存活率分別為(103.12±3.53)%、(94.87±5.34)%、(86.73±7.67)%、(75.23±6.98)%、(60.58±3.74)%。其中濃度為50 μmol/L、100 μmol/L組細(xì)胞存活率與空白對照組(100±2.28)%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2A)。山萘酚濃度為100 μmol/L作用于HepG2細(xì)胞3 h、6 h、12 h、24 h后細(xì)胞存活率分別為(104.73±3.84)%、(87.58±6.98)%、(74.68±5.41)%、(59.36±3.09)，12 h、24 h藥物處理組與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖2B)。

圖2 山萘酚對HepG2細(xì)胞生存率的影響

A：不同濃度山萘酚作用于HepG2細(xì)胞對其生存率的影響；B：濃度為100 μmol/L的山萘酚作用不同時間對HepG2細(xì)胞生存率的影響

Fig2TheeffectsofkaempferolonthesurvivalrateofHepG2cells

A: the effects of different concentrations of kaempferol on the survival rate of HepG2 cells; B: the effects of kaempferol at the concentration of 100 μmol/L on the survival rate of HepG2 cells at different time

2.2山萘酚對HepG2細(xì)胞上清LDH活性的影響山萘酚5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L孵育HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞上清LDH活性單位分別為(198.4±10.35)U、(368.71±4.69)U、(392.36±3.97)U、(432.46±11.82)U、(471.37±8.16)U，除了濃度為5 μmol/L組，其余各組與空白對照組(213.7±10.89)U兩兩相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖3A)。濃度為100 μmol/L的山萘酚作用于HepG2細(xì)胞3 h、6 h、12 h、24 h后，細(xì)胞上清LDH活性單位分別為(228.03±17.71)U、(231.52±18.13)U、(312.52±18.79)U、(429.76±12.76)U。其中12 h、24 h與空白對照組(165.62±12.28)U比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖3B)。

2.3山萘酚對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響不同濃度的山萘酚作用于HepG2細(xì)胞24 h后均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中濃度為100 μmol/L山萘酚干預(yù)組細(xì)胞凋亡率為(16.43±0.07)%，顯著高于空白對照組(0.68±0.09)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)；山萘酚濃度為100 μmol/L，作用時間3 h、6 h、12 h、24 h細(xì)胞凋亡率分別為(5.23±0.08)%、(7.41±0.01)%、(11.9±0.95)%、(16.71±1.12)%，與空白對照組(0.35±0.01)%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖4)。

2.4山萘酚誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡對Cleaved-caspase3蛋白的影響蛋白印跡法檢測凋亡標(biāo)志性蛋白Cleaved-caspase3的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參。結(jié)果證實(shí)，當(dāng)山萘酚作用于HepG2細(xì)胞24 h后，隨著山萘酚濃度的升高，凋亡蛋白Cleaved-caspase3表達(dá)增加(見圖5A)；當(dāng)使用濃度為100 μmol/L山萘酚干預(yù)HepG2細(xì)胞時，凋亡蛋白Cleaved-caspase3的表達(dá)隨著作用時間的延長表達(dá)也增加(見圖5B)。

圖3 山萘酚對HepG2細(xì)胞上清LDH酶活性影響

A：不同濃度山萘酚作用于HepG2細(xì)胞對其細(xì)胞上清LDH酶活性的影響；B：濃度為100 μmol/L的山萘酚作用不同時間對HepG2細(xì)胞上清LDH酶活性的影響

Fig3TheeffectsofkaempferolonLDHenzymeactivityinHepG2cellssupernatant

A: the effects of different concentrations of kaempferol on LDH enzyme activity in HepG2 cells supernatant; B: the effects of kaempferol at the concentration of 100 μmol/L on LDH enzyme activity in HepG2 cells supernatant

圖4 山萘酚對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

A～B：不同濃度山萘酚作用于HepG2細(xì)胞間對其細(xì)胞凋亡率的影響；C～D：濃度為100 μmol/L的山萘酚作用不同時間對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響

Fig4TheeffectsofkaempferolonapoptoticrateofHepG2cells

A-B: the effects of different concentrations of kaempferol on the apoptotic rate of HepG2 cells; C-D: the effects of kaempferol at the concentration of 100 μmol/L on the apoptotic rate of HepG2 cells at different time

3 討論

肝癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，在我國常見惡性腫瘤中目前排第4位，腫瘤致死病因排第3位，嚴(yán)重危害人類生命健康[9-10]。在中醫(yī)范疇中，肝癌可根據(jù)其臨床表現(xiàn)歸屬為“癥瘕”、“積聚”、“鼓脹”，而現(xiàn)代中醫(yī)藥可治療輕型癥狀，改善生命質(zhì)量，延長生存時間，緩解毒副作用，在臨床上已成為不可或缺的治療手段。

圖5 山萘酚作用于HepG2細(xì)胞對其凋亡蛋白Cleaved-caspase3表達(dá)的影響

A：不同濃度山萘酚作用于HepG2細(xì)胞對其凋亡蛋白
Cleaved-caspase3表達(dá)的影響；B：濃度為100 μmol/L的山萘酚作用不同時間對HepG2細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved-caspase3表達(dá)的影響

Fig5TheeffectsofkaempferolontheexpressionofapoptosisproteinCleaved-caspase3inHepG2cells

A: the effects of different concentrations of kaempferol on the expression of apoptosis protein Cleaved-caspase3 in HepG2 cells; B: the effects of kaempferol at the concentration of 100 μmol/L on the expression of apoptosis protein Cleaved-caspase3 in HepG2 cells at different time

山萘酚是一種黃酮類化合物，具有廣泛的生物學(xué)作用。近年來，關(guān)于山萘酚抗癌方面的大量研究證實(shí)了一定濃度的山萘酚可通過不同的機(jī)制抑制結(jié)腸癌、胃癌[6]、膽管癌[7]、口腔癌[11]等癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移、侵襲擴(kuò)散，并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。如QIN等[7]研究表明，山萘酚影響PI3K/AKT信號通路從而抑制膽管癌細(xì)胞增殖代謝并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡；HUNG等[8]發(fā)現(xiàn)，山萘酚可以通過下調(diào)AKT/FAK信號通路來抑制腎癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，從而預(yù)防癌細(xì)胞侵襲擴(kuò)散。通過本次實(shí)驗(yàn)的研究，結(jié)果表明，山萘酚能夠以劑量和時間依賴的方式誘導(dǎo)人類肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制是高濃度的山萘酚誘導(dǎo)凋亡因子Cleaved-caspase3表達(dá)，從而促使癌細(xì)胞凋亡。

凋亡自古謂之大量減少，據(jù)《陳書·世祖紀(jì)》記載：“自喪亂以來，十有馀載，編戶凋亡，萬不遺一，中原氓庶，蓋云無幾?！爆F(xiàn)代醫(yī)學(xué)定義細(xì)胞凋亡具體指由基因介導(dǎo)的程序性死亡，此過程可清除衰老和異常的細(xì)胞，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。Caspase家族是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶[12]，Caspase3是蛋白Caspase家族中重要的一員，Cleaved-caspase3是Caspase3的激活體，主要參與調(diào)控細(xì)胞凋亡及炎癥過程。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時，各個凋亡信號通路最終激活Caspase3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅表明山萘酚具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的作用，同時證實(shí)了單體山萘酚主要依賴藥物劑量誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。早期研究[13]證實(shí)，低濃度0.01、0.1 μmol/L山萘酚可以抑制正常肝細(xì)胞7702內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘導(dǎo)的CHOP蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡。當(dāng)濃度增至1.00 μmol/L時，山萘酚對CHOP蛋白表達(dá)的抑制作用不顯著，且會產(chǎn)生細(xì)胞損傷作用。另一項(xiàng)研究[14]采用5～100 μmol/L的山萘酚孵育HepG2細(xì)胞24 h，用MTT法檢測藥物毒性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)藥物濃度<20 μmol/L時對細(xì)胞活性無顯著影響，但隨著藥物濃度增高，所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性增強(qiáng)。同樣，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了以上結(jié)論，當(dāng)濃度為5 μmol/L時，山萘酚對細(xì)胞具有保護(hù)作用，與正常組相比，細(xì)胞活性增高且細(xì)胞上清LDH含量有所下降；當(dāng)濃度為100 μmol/L時，山萘酚對細(xì)胞的毒性作用明顯增強(qiáng)，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，顯著降低了細(xì)胞活性，增加了細(xì)胞上清LDH含量，且誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Caspase3表達(dá)。同時隨著山萘酚濃度的增加，細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，表明山萘酚隨濃度的升高，藥物毒性逐漸增加。隨后選取高濃度山萘酚孵育HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，藥物毒性增加，細(xì)胞活性逐漸下降，凋亡率增高，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3表達(dá)增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度山萘酚對細(xì)胞可起到保護(hù)性作用，而高濃度山萘酚產(chǎn)生細(xì)胞毒性會誘導(dǎo)細(xì)胞損傷及凋亡，同時在高濃度狀態(tài)下，山萘酚孵育時間的延長對細(xì)胞的損傷會增加。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了山萘酚對于人類肝癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山萘酚以劑量-時間依賴性誘發(fā)肝癌細(xì)胞凋亡。經(jīng)山萘酚處理的肝癌HepG2細(xì)胞，隨著藥物濃度增加和孵育時間延長導(dǎo)致凋亡因子Cleaved-caspase3的表達(dá)逐步增強(qiáng)，表明山萘酚誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡與提高Caspase3活性和藥物高濃度密切相關(guān)。研究后期可通過體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證山萘酚誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡作用，為山萘酚的研究開發(fā)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為肝癌的治療提供更多的選擇。

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