薛德林 柳學(xué)成 程貴良 劉志國 王冠穎 戰(zhàn)曉燕 胡江春

1 中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所 沈陽 110016

2 東營海躍生物飼料有限公司 東營 110000

3 遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司 沈陽 110032

4 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 上海 201600

腐植酸是一種廣泛存在于自然界中結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能活躍的混合物。由于腐植酸具有特殊的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，作為飼料添加劑在水產(chǎn)和畜禽養(yǎng)殖上已經(jīng)有廣泛應(yīng)用[1～9]。

本文對腐植酸、豆粕和玉米漿粉通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)出的腐植酸發(fā)酵肽與枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參和基圍蝦混合養(yǎng)殖中的增產(chǎn)效果進(jìn)行研究，旨在為腐植酸類飼料添加劑的利用及腐植酸類凈水劑和微生態(tài)制劑的應(yīng)用提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

（1）枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis 2018），從遼寧大連黃海海域底泥中分離得到。

（2）釀酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae CICC 1421），從中國工業(yè)微生物保藏管理中心購買。

（3）嗜酸乳桿菌（Lactobacillus Acidophilus CICC 6074），從中國工業(yè)微生物保藏管理中心購買。

1.1.2 供試原料

（1）腐植酸，從內(nèi)蒙古霍林河郭勒樹艷腐植酸公司定購，腐植酸含量≥60%，細(xì)度≤80目，水份≤15%，pH=5.0。

（2）玉米漿粉，山東西王集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，市售，蛋白質(zhì)含量≥42%，碳水化合物（糖）≥8.0%，總磷含量≥1.0%，灰分≤5.0%，水分≤6.0%，細(xì)度≤100目。

1.1.3 供試設(shè)備

發(fā)酵罐，匯森生物設(shè)備（鎮(zhèn)江）有限公司生產(chǎn)；固體發(fā)酵機(jī)組，中國水產(chǎn)科學(xué)院上海漁用機(jī)械研究所研制生產(chǎn)；低溫負(fù)壓流化床，中國水產(chǎn)科學(xué)院上海漁用機(jī)械研究所研制生產(chǎn)。

1.1.4 供試苗種

海刺參、基圍蝦，由山東東營海躍水產(chǎn)生物科技有限公司自繁。

1.2 腐植酸發(fā)酵肽產(chǎn)品制備工藝

腐植酸發(fā)酵肽產(chǎn)品制備工藝：液體發(fā)酵→固體發(fā)酵→烘干粉碎→產(chǎn)品保證值檢測。

（1）液體發(fā)酵工藝過程：1支試管斜面→1000 mL三角搖瓶10瓶（搖床培養(yǎng)24 h）→1 t種子罐（24 h）→10 t發(fā)酵罐（36 h）。

將選用的枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿菌菌株分別在各自的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，各發(fā)酵罐所選用培養(yǎng)基、發(fā)酵條件及發(fā)酵結(jié)果見表1。

（2）固體發(fā)酵工藝過程：3 t旋轉(zhuǎn)蒸球高溫高壓處理固體發(fā)酵物料→物料冷卻后與發(fā)酵菌液混合→傳送帶機(jī)械鋪料→采用流動履帶式全自動發(fā)酵機(jī)組發(fā)酵。

固體發(fā)酵物料配比：腐植酸40份，豆粕30份，玉米漿粉30份。

發(fā)酵菌液配比：枯草芽孢桿菌15份、釀酒酵母15份、嗜酸乳桿菌份15份。

將固體發(fā)酵原料與發(fā)酵菌液，按照100∶45混合，混勻后，均勻的平鋪到流動履帶式全自動發(fā)酵器上進(jìn)行100 h發(fā)酵。

（3）烘干粉碎過程：傳送系統(tǒng)→負(fù)壓式低溫真空流化床→傳送系統(tǒng)→大型微粉機(jī)械→多級篩過篩→傳送系統(tǒng)→成品包裝→質(zhì)檢→腐植酸發(fā)酵肽產(chǎn)品。

固體發(fā)酵完成后對所得產(chǎn)物在負(fù)壓式低溫真空流化床進(jìn)行烘干，烘干的條件是，進(jìn)風(fēng)溫度80 ℃，出風(fēng)溫度35 ℃，流化時間12 min，含水量12.0%，粉碎、過篩目數(shù)100目。

（4）產(chǎn)品保證值檢測：粗蛋白檢測按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6432-1994飼料中粗蛋白測定方法[10]進(jìn)行測定；氨基酸檢測按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18246-2000飼料中氨基酸測定方法[11]進(jìn)行測定；小肽檢測按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22492-2008飼料中酸溶蛋白方法[12]進(jìn)行測定，小肽分子量小于2000道爾頓；抗原檢測按照發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的定性檢測方法——sds-PAGE方法[13]進(jìn)行測定；乳酸檢測按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.173-2016中乳酸測定方法[14]進(jìn)行測定。

表1 枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿菌液體發(fā)酵所需培養(yǎng)基、發(fā)酵條件Tab.1 The culture medium and fermentation conditions of Bacillus Subtilis, Saccharomyces Cerevisiae,Lactobacillus Acidophilus liquid fermentation

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

1.3.1 海刺參與基圍蝦大面積混養(yǎng)

試驗(yàn)組1：養(yǎng)殖場2（1200畝），養(yǎng)殖場5（1300畝），養(yǎng)殖場6（1150畝）；腐植酸發(fā)酵肽5千克/畝、枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝用量，在水溫平均達(dá)到18 ℃以上后，按潮汐規(guī)律，每半月投撒一次；試驗(yàn)期間共應(yīng)用10次。

試驗(yàn)組2：養(yǎng)殖場1（1000畝），養(yǎng)殖場3（1000畝），養(yǎng)殖場7（1000畝）；腐植酸發(fā)酵肽10千克/畝、枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝用量，在水溫平均達(dá)到18 ℃以上后，按潮汐規(guī)律，每半月投撒1次；試驗(yàn)期間共應(yīng)用10次。

對照組：養(yǎng)殖場4（1250畝），養(yǎng)殖場8（1000畝），養(yǎng)殖場9（1100畝）?？莶菅挎邨U菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝、腐植酸10千克/畝用量，水溫平均達(dá)到18 ℃以上后，按潮汐規(guī)律，每半月投撒一次；試驗(yàn)期間共應(yīng)用10次。

1.3.2 海刺參大面積養(yǎng)殖

試驗(yàn)組：腐植酸發(fā)酵肽按照10%劑量拌入海刺參餌料中，枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝，在水溫平均達(dá)到18 ℃以上，按潮汐規(guī)律，試驗(yàn)期應(yīng)用2次。

對照組：腐植酸按照10%劑量拌入海泥中，枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝，在水溫平均達(dá)到18 ℃以上，按潮汐規(guī)律，試驗(yàn)期應(yīng)用2次。

1.3.3 基圍蝦大面積養(yǎng)殖

試驗(yàn)組：腐植酸發(fā)酵肽按照10%劑量拌入基圍蝦餌料中，枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝，水溫平均達(dá)到18 ℃以上，按潮汐規(guī)律，試驗(yàn)期應(yīng)用2次。

對照組：腐植酸按照10%劑量拌入海泥中，枯草芽孢桿菌5千克/畝、嗜酸乳桿菌5千克/畝，在水溫平均達(dá)到18 ℃以上，按潮汐規(guī)律，試驗(yàn)期共應(yīng)用2次。

1.3.4 試驗(yàn)時間、地點(diǎn)、管理及經(jīng)濟(jì)效益分析

試驗(yàn)時間：海刺參與基圍蝦大面積混合養(yǎng)殖是2017年5月1日—11月1日，為期180天；海刺參大面積養(yǎng)殖是2017年5月10日—6月10日，為期30天；基圍蝦大面積養(yǎng)殖是2017年8月1日—10月1日，為期60天。

試驗(yàn)地點(diǎn)：山東東營海躍水產(chǎn)生物科技有限公司養(yǎng)殖場。

日常管理：按照試驗(yàn)設(shè)計投撒腐植酸發(fā)酵肽和微生物制劑，巡塘、換水、滅草等項(xiàng)管理措施，按照正常管理進(jìn)行。在山東東營地區(qū)海刺參最佳生長時間為4月15日—6月15日、9月1日到11月1日。海刺參最適生長溫度為20±5 ℃，25 ℃以上高水溫期有夏眠習(xí)性。

飼料報酬率：也稱耗料增重比、料重比、料肉比、飼料消耗比。即每生產(chǎn)單位重量的產(chǎn)品所耗用飼料的數(shù)量。

經(jīng)濟(jì)效益分析：按照經(jīng)濟(jì)效益計算公式，試驗(yàn)凈效益=試驗(yàn)增加收入－試驗(yàn)投入費(fèi)用。

試驗(yàn)增加費(fèi)用：腐植酸發(fā)酵肽、腐植酸、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌所投入費(fèi)用。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐植酸發(fā)酵肽的生產(chǎn)

2.1.1 液體發(fā)酵

按照表1選用的培養(yǎng)基、發(fā)酵條件，經(jīng)過36 h的發(fā)酵，生產(chǎn)出枯草芽孢桿菌≥2×1010個/毫升、釀酒酵母≥3×109個/毫升、嗜酸乳桿菌≥8×109個/毫升的菌液。

2.1.2 固體發(fā)酵

經(jīng)固體發(fā)酵得到含水量≤10%、枯草芽孢桿菌≥6×1010個/毫升、釀酒酵母≥1.5×109個/毫升、嗜酸乳桿菌≥2.5×109個/毫升的腐植酸發(fā)酵肽。

2.1.3 腐植酸發(fā)酵肽的產(chǎn)品保證值

通過上述工藝生產(chǎn)出的腐植酸發(fā)酵肽的產(chǎn)品，其產(chǎn)品與腐植酸有區(qū)別，通過產(chǎn)品保證值檢測，結(jié)果見表2。

表2 腐植酸發(fā)酵肽與腐植酸的區(qū)別及其產(chǎn)品保證Tab.2 The difference of humic acid fermentation peptide with humic acid and its products guarantee value

2.2 腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在

海刺參與基圍蝦大面積混養(yǎng)中的應(yīng)用

腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌對海刺參基圍蝦混養(yǎng)中成活率及產(chǎn)量的影響結(jié)果，見表3。

經(jīng)方差分析海刺參重量：試驗(yàn)組1與對照組比較：P=0.0203，0.01≤P≤0.05，差異顯著；試驗(yàn)組2與對照組比較：P=0.0088，P≤0.01，差異極顯著；試驗(yàn)組1與試驗(yàn)組2比較：P=0.0203，0.01≤P≤0.05，差異顯著。

經(jīng)方差分析基圍蝦重量：試驗(yàn)組1與對照組比較：P=0.0467，0.01≤P≤0.05，差異顯著；試驗(yàn)組2與對照組比較：P=0.0021，P≤0.01，差異極顯著；試驗(yàn)組1與試驗(yàn)組2比較：P=0.0438，0.01≤P≤0.05，差異顯著。

腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參與基圍蝦混養(yǎng)中的應(yīng)用結(jié)果，通過表3可以看出，試驗(yàn)組1海刺參平均196.9千克/畝，基圍蝦平均17.5千克/畝；試驗(yàn)組2海刺參平均206.1千克/畝，基圍蝦平均19.6千克/畝；對照組海刺參平均160.4千克/畝，基圍蝦平均15.6千克/畝。與對照組相比，試驗(yàn)組1海刺參增重率22.76%，基圍蝦增重率12.18%；試驗(yàn)組2海刺參增重率28.49%，基圍蝦增重率25.64%。

腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參與基圍蝦混養(yǎng)中的經(jīng)濟(jì)效益分析結(jié)果見表4?？梢钥闯?，試驗(yàn)組1投入成本增加400元/畝，試驗(yàn)增加收入3880元/畝，凈收益增加3480元/畝；試驗(yàn)組2投入成本增加900元/畝，試驗(yàn)增加收入 4950元/畝，試驗(yàn)凈收益增加4050元/畝。

表3 腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌對海刺參、基圍蝦混養(yǎng)成活率及產(chǎn)量的影響（春秋2季）Tab.3 Effects of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on survival rate and yield of sea cucumbers and shrimps mixed breeding (spring and fall)

表4 腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參、基圍蝦混養(yǎng)中的經(jīng)濟(jì)效益分析Tab.4 The economic benef i t analysis of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on sea cucumbers and shrimps mixed breeding

2.3 腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參大面積養(yǎng)殖中的應(yīng)用

腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參養(yǎng)殖中對海刺參成活率及增重的影響，試驗(yàn)結(jié)果及其數(shù)據(jù)分析見表5。

經(jīng)過方差分析：試驗(yàn)組與對照組比較，P=0.0092，P≤0.01，差異極顯著。

通過表5可以看出，在海刺參大面積養(yǎng)殖中，試驗(yàn)組增重量39.3千克/畝、成活率52.08%、飼料報酬率1.102；對照組增重量27.1千克/畝、成活率45.41%、飼料報酬率1.600。與對照組相比，試驗(yàn)組海刺參增重率45.02%、成活率提高6.67個百分點(diǎn)，飼料報酬率降低0.498。

腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參大面積養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益分析見表6。

通過表6可以看出，試驗(yàn)組投入成本增加180元/畝，收入增加1220元/畝，試驗(yàn)增加凈收益1040元/畝。（投入的海刺參餌料100元沒有計入到投入費(fèi)用中）。

2.4 腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在

基圍蝦大面積養(yǎng)殖中的應(yīng)用

腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌對基圍蝦成活率及增重影響，試驗(yàn)結(jié)果及其數(shù)據(jù)分析見表7。

經(jīng)過方差分析：試驗(yàn)組與對照組比較：P=0.0065，P≤0.01，差異極顯著。

通過表7可以看出，在基圍蝦大面積養(yǎng)殖中，試驗(yàn)組增重量18.5千克/畝、成活率44.7%、飼料報酬率0.720；對照組增重量14.2千克/畝、成活率20.3%、飼料報酬率0.941。與對照組相比，試驗(yàn)組基圍蝦增重率30.28%、成活率提高24.4個百分點(diǎn)，飼料報酬率（FCR）降低0.221。

腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在基圍蝦大面積養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益分析結(jié)果見8。

通過表8可以看出，試驗(yàn)組1投入成本增加180元/畝，收入增加430元/畝，試驗(yàn)增加凈收益250元/畝。（投入的基圍蝦餌料50元沒有計入到投入費(fèi)用中）。

表5 腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌對海刺參成活率及增重的影響（30天）Tab.5 Effects of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on survival rate and weight of sea cucumbers (30 days)

表6 腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在海刺參養(yǎng)殖中經(jīng)濟(jì)效益分析Tab.6 The economic benef i t analysis of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus in sea cucumbers breeding

表7 腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌對基圍蝦成活率及增重的影響（60天）Tab.7 Effects of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus on survival rate and weight of shrimps (60 days)

表8 腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌在基圍蝦養(yǎng)殖中的經(jīng)濟(jì)效益分析Tab.8 The economic benef i t analysis of humic acid fermented peptide, Bacillus Subtilis and Lactobacillus Acidophilus in shrimps breeding

3 結(jié)論

（1）腐植酸是一種存在于自然界中結(jié)構(gòu)復(fù)雜功能活躍的混合物，泥炭腐植酸中存在少量的蛋白質(zhì)、氨基酸和小肽，而礦源腐植酸中沒有。腐植酸作為飼料添加劑主要是利用其具有的特殊分子結(jié)構(gòu)和生物活性物質(zhì)。將腐植酸、豆粕、玉米漿粉按3∶4∶3比例混合，以枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、嗜酸乳桿菌為發(fā)酵菌種，經(jīng)液體制菌、固體發(fā)酵、低溫烘干、微粉碎等生產(chǎn)工藝，得到的腐植酸發(fā)酵肽，其主要物理性狀、化學(xué)性質(zhì)和微生物含量測定指標(biāo)：蛋白質(zhì)38%，小肽10%，賴氨酸3.0%，細(xì)度≤100目，含水量≤10%，枯草芽孢桿菌≥6×109個/毫升，釀酒酵母≥1.5×109個/毫升，嗜酸乳桿菌≥2.5×109個/毫升。

（2）腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌在海刺參與基圍蝦大面積混養(yǎng)中進(jìn)行應(yīng)用試驗(yàn)，結(jié)果表明：海刺參增重率22.76%～28.49%，基圍蝦增重率12.18%～25.64%；試驗(yàn)凈收益增加3480～4050元/畝；海刺參大面積養(yǎng)殖中，試驗(yàn)結(jié)果表明：海刺參增重率45.02%、成活率提高6.67個百分點(diǎn)，飼料報酬率（FCR）降低0.498，試驗(yàn)凈收益增加1040元/畝?；鶉r大面積養(yǎng)殖中，試驗(yàn)結(jié)果表明：基圍蝦增重率30.28%、成活率提高24.4個百分點(diǎn)，飼料報酬率（FCR）降低0.221，試驗(yàn)凈收益增加250元/畝。從經(jīng)濟(jì)效益分析中可以看出，在海刺參與基圍蝦大面積混養(yǎng)中，應(yīng)用腐植酸發(fā)酵肽、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌，經(jīng)濟(jì)效益增加最多，海刺參大面積養(yǎng)殖次之。

（3）腐植酸發(fā)酵肽和枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌，作為生物飼料添加劑，可為海刺參與基圍蝦提供小分子的多肽、氨基酸和氮素營養(yǎng)，可以降低養(yǎng)殖水體中的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有毒有害物質(zhì)的濃度，有效地清除池底積累的殘余餌料和排泄廢棄物，有效地改善水質(zhì)。并能促進(jìn)單細(xì)胞微藻的生長，調(diào)節(jié)藻菌相，降低透明度，抑制光合作用，從而控制多細(xì)胞大型澡類的生長，結(jié)合枯草芽孢桿菌能分泌蛋白酶等酶類，可起到控草作用，使養(yǎng)殖水體形成一個良性生態(tài)循環(huán)體系。

綜上所述，腐植酸發(fā)酵肽和枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌，作為綠色環(huán)保型生物飼料添加劑在海刺參與基圍蝦大面積混養(yǎng)中應(yīng)用潛力巨大，經(jīng)濟(jì)效益顯著，作為綠色環(huán)保型飼料添加劑廣泛推廣應(yīng)用，必將對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)作出重要貢獻(xiàn)。

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