張彩鳳 劉志帆 宋 珍 袁 雯 李 林 鄧晨華 劉翠仙

1 太原師范學院化學系 太原 030619

2 山西省腐植酸工程技術研究中心 太原 030619

3 太原師范學院物理系 太原 030619

腐植酸廣泛應用于人類生活中，不僅在農業(yè)方面發(fā)揮舉足輕重的作用，也是中華醫(yī)藥的“綠色寶藏”，對發(fā)展腐植酸醫(yī)藥健康產業(yè)具有重大意義[1]。腐植酸有很多種類，是一種多孔性的親水膠體，穩(wěn)定性強，具有良好的殺菌效果，可以減少機體內毒素，加速細胞消腫和消炎。腐植酸含有多種可溶于水、酸、堿、乙醇和丙酮的反應性官能團，能夠激活凝血酶，促進細胞凝血，使其有效治療外傷出血。

黃腐酸是腐植酸中活性較高的成分，能促進動物營養(yǎng)的吸收。當無機鹽與黃腐酸接觸時，在水介質中以離子形式存在，具有生物活性[2]。因此，當無機鹽通過黃腐酸和光合作用的自然化學過程轉化為有機體的一部分時，它們對人類和動物都是安全的。許多研究表明，黃腐酸被人體吸收之后，在養(yǎng)分轉化方面具有一定的促進作用，例如黃腐酸能激活消化酶；同時，黃腐酸可以降低自由基的氧化能力；也有研究表明，黃腐酸可以緩解氧氣不足，呼吸不暢，刺激肌細胞活性增加[3]。

三七是四十種大宗藥材品種之一，在國內外應用廣泛，具有“止血活血”效用[4]。人參皂苷Rg1是三七中40多種皂苷單體之一，在神經系統(tǒng)中有顯著作用，主要體現在對智力的影響，通過改善記憶功能和認知障礙，誘導神經細胞興奮，舒緩其凋亡能力。人參皂苷Rg1在抗腫瘤、抗老化、抗疲勞和抗抑郁等方面表現其藥理活性[5]。大量數據還表明，人參皂苷Rg1對治療動物中樞神經系統(tǒng)疾病有作用，可影響皮質、海馬、紋狀體、下丘腦等腦區(qū)[6～9]。人參皂苷Rg1還可以增加蛋白磷酸酯酶2A（Protein phosphatase2A，PP2A）的活性。據曾育琦等[10]人報道，廣泛存在于人體內的PP2A活性的增強可以減少tau蛋白的過度磷酸化，以防治阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease）。黃腐酸可能像PP2A一樣，是一種刺激動物體內酶活性的生物刺激素。

我們提出兩個假設，第一：黃腐酸可以與PP2A相互作用，第二：黃腐酸能對人參皂苷Rg1和PP2A的復合物發(fā)生作用。為了驗證這兩種假設，借助Discovery Studio 4.5軟件平臺從微觀角度出發(fā)，將黃腐酸、人參皂苷Rg1和PP2A進行對接模擬和動力學模擬，通過分子對接（Molecular Docking）、溶劑化（Molecular Dynamics）、結合能計算模擬（Calculate Binding Energy）分析和探討黃腐酸促進PP2A形成的機制，并進一步驗證黃腐酸對人參皂苷Rg1和PP2A復合物的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃腐酸3D圖和人參皂苷Rg1 3D圖都源自小分子結構數據庫（PubChem），PP2A的3D模型則源自蛋白質結構數據庫（PDB）。選大鼠體內PP2A來近似代替所有動物體內蛋白質結構驗證假設。

1.2 材料的優(yōu)化處理

首先將從小分子結構數據庫（PubChem）中下載的黃腐酸分子和人參皂苷Rg1分子進行優(yōu)化處理，通過在Small Molecules中優(yōu)化（Full Minimization），使其得到能量最小化結果。進行Prepare or Filter Ligands面板中的Prepare Ligands操作，使其找到配體分子的全部同分異構體，完成配體分子對接（Molecular Docking）前的準備。

對于從蛋白質結構數據庫（PDB）中下載的PP2A，首先除去蛋白質原有的配體，騰出其空腔位置，并除去其中的水分子，使其更易于觀察。然后找到macromolecules下的Prepare Protein面板，點擊Prepare Protein，使系統(tǒng)自動補全蛋白殘基結構并做加氫處理，使其易于形成氫鍵，最后通過點擊Ligands Groups下的From Current Selection選項，軟件將自動鎖定PP2A的活性作用位點（該部分與配體結合的可能性最大，一般為蛋白質的空腔部分），為進一步的分子對接做好準備。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗所用軟件

美國Accery公司自主研發(fā)的Discovery Studio 4.5是計算機分子模擬軟件。它對生命科學領域的研究具有重要作用，為科學家提供易用的蛋白質模擬、藥物的設計與優(yōu)化工具。通過高質量的圖形界面，經過多年驗證和集成環(huán)境的科學算法，Discovery Studio將實驗數據的保存和管理與專業(yè)標準的建模和仿真工具相結合，為研究隊伍的合作與信息共享提供平臺[11]。Discovery Studio的主要模擬功能包括：（1）生物大分子，蛋白進化分析、蛋白質三維結構的預測與模擬、膜蛋白結構的預測與模擬、抗體結構的預測與模擬等；（2）計算化學，分子力學計算和分子動力學模擬、拉伸分子動力學模擬、量子力學/分子力學（QM/MM）計算等；（3）基于目標結構的藥物設計，基于靶標結構的化合物虛擬篩選、全新藥物設計、藥靶作用機制解釋、分子對接、基于片段的藥物設計與改造等；（4）基于配體的藥物設計，完全基于配體的藥效團設計、基于配體-受體復合物的藥效團設計、化合物數據庫的構建和篩選、藥效團數據庫的構建與保存、基于藥效團數據庫的反向找靶等。基于上述模擬功能，Discovery Studio 4.5的應用主要覆蓋了醫(yī)學、化學和生物學，具有很大的應用前景。

1.3.2 分子對接

分子對接是一種利用受體特征和配體與藥物分子相互作用的設計方法?；谂潴w和受體之間的“鎖-鑰原理”（lock and key principle），模擬配體與受體的相互作用。配體與受體之間的相互作用是分子識別的過程，主要包括靜電相互作用、氫鍵作用等。通過計算binding energy能預測二者之間的結合自由能，Ligand Interaction能預測結合方式，并且可以進行藥物的虛擬篩選。

將分子對接方法分為LibDOCK（基于熱區(qū)匹配的剛性分子對接）、LigandFit（基于幾何形狀匹配的半柔性分子對接）、CDOCKER（基于能量最低原則的分子對接）、Flexibledock（全柔性受體-配體對接）。

1.3.3 小分子與蛋白質對接

在實驗研究中，小分子與大分子的對接方式應用CDOCKER對接方法，是基于CHARMm的對接程序，采用soft-core potentials以及optional grid representation將配體分子與受體活性作用位點進行對接，采用高溫動力學、模擬退火的方法進行優(yōu)化處理。此技術可以精確預測蛋白-配體相互作用關系[12，13]。研究所用的小分子為黃腐酸、人參皂苷Rg1，大分子為PP2A。打開已經優(yōu)化處理的配體和受體，運用CDOCKERD對接技術即可完成分子對接，在Report中即可顯示對接后信息。

1.3.4 分子動力學模擬

分子動力學（Molecular Dynamics，DS）是分子模擬中常用的方法之一，分析復合物等多種分子在不同環(huán)境和狀態(tài)下的熱力學及動力學特性，能夠動態(tài)研究配體的結合過程，預測受體-配體結合自由能。

分別將黃腐酸-PP2A和人參皂苷Rg1-PP2A加入溶劑環(huán)境中，protocol中找到溶劑（solvent），并點擊打開面板，設置好相關的參數，數分鐘得到加入溶劑體系圖，設置束縛體系，設置Dynamics文件夾下Standard Dynamics Cascade流程，運行得到溫度圖和能量圖。

1.3.5 相關能量計算

在分子窗口打開配體、受體或者已對接完成的復合物，在工具欄中展開Receptor-Ligand Interactions選項，點擊Calculate Binding Energy，即可計算結合自由能。

在對接結果表格視圖中顯示Cdocker Interaction Energy，此數值代表對接效果可靠與否。

1.4 數據處理

運行完成后，在Report中顯示對接信息，點擊View Result，即可查看分子視圖，點擊view interaction面板下的ligand interaction，顯示配體和受體之間的作用，在分子窗口中選中某一條虛線，在DS界面的左下方就會顯示該鍵合作用類型及距離等相關信息，距離的單位為埃（

也可點擊show 2D diagram全部顯示結合鍵的類型，分析結果并進行處理。

2 結果與討論

2.1 黃腐酸-PP2A的復合物和人參皂苷Rg1-PP2A的復合物及其動力學模擬結果

從小分子數據庫得到黃腐酸分子結構（圖1為黃腐酸分子結構2D圖，圖2為黃腐酸分子結構3D圖）。從圖中發(fā)現，黃腐酸含有羥基、羰基和羧基含氧官能團等多種活性官能團，這些官能團使黃腐酸易于形成氫鍵。圖3為黃腐酸的氫鍵作用圖示，粉紅部分有羥基存在，能夠給出氫；綠色部分有羰基和含氧環(huán)，能接受氫。

圖1 黃腐酸分子結構（2D）Fig.1 The molecular structure of fulvic acid (2D)

圖2 黃腐酸分子結構（3D）Fig.2 The molecular structure of fulvic acid (3D)

圖3 黃腐酸分子中形成氫鍵作用區(qū)域Fig.3 The area of fulvic acid which can form hydrogen bonds

圖4為人參皂苷Rg1分子結構2D圖，圖5為人參皂苷Rg1分子結構3D圖，均從小分子結構數據庫得到。分子結構表明人參皂苷Rg1含有羥基、分子內氫鍵、含氧環(huán)，使得人參皂苷Rg1很容易與某些物質形成氫鍵。圖6為人參皂苷Rg1的氫鍵作用圖示。

圖4 人參皂苷Rg1分子結構（2D）Fig.4 The molecular structure of ginsenoside Rg1 (2D)

圖5 人參皂苷Rg1分子結構（3D）Fig.5 The molecular structure of ginsenoside Rg1 (3D)

圖6 人參皂苷Rg1分子中形成氫鍵作用區(qū)域Fig.6 The area of ginsenoside Rg1 which can form hydrogen bonds

圖7為從蛋白質結構數據庫PDB中得到的磷酸酯酶2A（PP2A），圖8為通過優(yōu)化后的PP2A非活性構象圖，圖9為PP2A活性位點圖，紅色區(qū)域代表最大可能的結合位點。

圖10為人參皂苷Rg1和PP2A通過CDOCKER對接技術的結果，結合能為-98.8523 kcal/mol。圖11顯示黃腐酸和PP2A通過CDOCKER對接技術的結果，結合能為-13.9682 kcal/mol。

圖12為人參皂苷Rg1與PP2A對接的氫鍵區(qū)域圖。圖13為人參皂苷Rg1與PP2A對接之后的鍵合作用圖?？梢钥闯觯琍P2A的B鏈上207位組氨酸、113位天冬氨酸和C鏈上的300位纈氨酸、301位蘇氨酸與人參皂苷Rg1分子形成氫鍵；B鏈上110位輔氨酸、206位谷氨酸則形成碳氫鍵；A鏈上257位色氨酸、B鏈上99位脯氨酸則形成π-烷基鍵；B鏈上104位蘇氨酸和人參皂苷Rg1形成一對受體。此圖表明人參皂苷Rg1與PP2A的鍵合作用與人參皂苷Rg1中的氫鍵、羥基和環(huán)上的氧有一定的關系。由此可以推斷出，黃腐酸和人參皂苷Rg1分別與任一生物大分子進行對接或者與其他的有機物發(fā)生反應，關鍵在于所含的官能團。

圖14為黃腐酸與PP2A對接的氫鍵區(qū)域圖。圖15為黃腐酸與PP2A對接之后的鍵合作用圖。可以看出，PP2A的B鏈上99位脯氨酸和162位天冬氨酸與黃腐酸形成碳氫鍵；B鏈上100位絲氨酸、200位精氨酸與黃腐酸形成氫鍵；207位組氨酸則與黃腐酸形成π-π鍵；A鏈上258位精氨酸與黃腐酸之間存在靜電作用。此圖也表明黃腐酸與PP2A的鍵合作用與黃腐酸中羥基、羰基和環(huán)上的氧具有一定的關系。

圖16和圖17分別為人參皂苷Rg1與PP2A復合物、黃腐酸與PP2A復合物添加溶劑環(huán)境的圖示，以達到模擬人體環(huán)境的目的。

圖7 PP2A 3D構象Fig.7 The 3D conformation of PP2A

圖8 優(yōu)化后的PP2A的非活性構象Fig.8 The nonactive conformation of optimized PP2A

圖9 PP2A的活性位點Fig.9 The active site of PP2A

圖10 人參皂苷Rg1和PP2A對接結果Fig.10 The docking results of ginsenoside Rg1 and PP2A

圖11 黃腐酸和PP2A對接結果Fig.11 The docking results of fulvic acid and PP2A

圖12 人參皂苷Rg1與PP2A對接的氫鍵區(qū)域圖Fig.12 Hydrogen bond map of ginsenoside Rg1-PP2A compound

圖13 人參皂苷Rg1與PP2A對接后的鍵合作用Fig.13 Bonding interaction of ginsenoside Rg1-PP2A compound

圖14 黃腐酸與PP2A對接的氫鍵區(qū)域圖Fig.14 Hydrogen bond map of fulvic acid-PP2A compound

圖15 黃腐酸與PP2A對接后的鍵合作用Fig.15 Bonding interaction of fulvic acid-PP2A compound

圖16 人參皂苷Rg1與PP2A復合物添加溶劑時的結果Fig.16 The result of addition solvention in ginsenoside Rg1-PP2A compound

圖17 黃腐酸與PP2A復合物添加溶劑時的結果Fig.17 The result of addition solvention in fulvic-PP2A compound

圖18 人參皂苷Rg1-PP2A復合物的動力學模擬Fig.18 Dynamics simulation of the ginsenoside Rg1-PP2A compound

圖18顯示人參皂苷Rg1-PP2A對接后進一步動力學模擬后的結果，由圖可知在22 ps出現能量最低構象，結合能力更強。通過計算，結合能為-98.8523 kcal/mol。對照圖13，人參皂苷Rg1與PP2A結合有氫鍵作用、靜電作用和碳氫鍵作用等，使結合更穩(wěn)定，同樣促進PP2A的生成。圖19為黃腐酸-PP2A對接后進一步動力學模擬后的結果。從中可知隨著溫度的增加，體系的總能量呈下降的趨勢，在18 ps最低能量，構象有效，能夠有效地反應真實情況。通過計算，結合能為-13.9682 kcal/mol。對照圖15，對于PP2A，黃腐酸與之結合有氫鍵作用，靜電作用和碳氫鍵作用等，刺激了PP2A的生物活性。通過結合能的計算，對接后人參皂苷Rg1-PP2A能量變化與黃腐酸-PP2A的相近，因此，間接推測黃腐酸也可作用于PP2A，并產生與人參皂苷Rg1相同的效果，以防治阿爾茨海默病。

圖19 黃腐酸-PP2A復合物的動力學模擬Fig.19 Dynamics simulation of the fulvic acid-PP2A compound

2.2 小分子-大分子復合物和結果分析

圖20顯示黃腐酸與人參皂苷Rg1-PP2A復合物的對接結果。圖21和圖22分別為對接的氫鍵區(qū)域圖和對接后的鍵合作用圖。通過軟件計算可知：對接后的結合能為-107.3415 kcal/mol，對接前的結合能為-98.8523 kcal/mol，可以表明，對接后的結合能下降了。因此可以推斷黃腐酸可以促進PP2A與人參皂苷Rg1的結合，從而可能防治阿爾茨海默病。

綜上可知：預示黃腐酸能夠促進PP2A的形成；黃腐酸也可能作用于人參皂苷Rg1和PP2A形成的復合物，提高人參皂苷Rg1與PP2A的作用能力，因為反應朝能量變低的方向進行，從而提高藥理效果。

圖20 黃腐酸與人參皂苷Rg1-PP2A復合物對接結果Fig.20 The docking results of fulvic acid and ginsenoside Rg1-PP2A complex

圖21 黃腐酸與人參皂苷Rg1-PP2A復合物進行對接的氫鍵區(qū)域圖Fig.21 Hydrogen bond map of the fulvic acids combined with ginsenoside Rg1-PP2A compound

圖22 黃腐酸與人參皂苷Rg1-PP2A復合物進行對接后的鍵合作用Fig.22 Bonding interaction of the fulvic acid combined with ginsenoside Rg1-PP2A compound

3 結論

大量實驗結果顯示：黃腐酸能夠作為一種生物刺激素作用于動物，能夠促進生長過程中養(yǎng)分的轉化。三七中的人參皂苷Rg1可以增加PP2A活性，減少tau蛋白過度磷酸化，實現防治阿爾茨海默病的預防和治療。計算模擬結果表明：人參皂苷Rg1可促進PP2A的產生，黃腐酸也有可能促進PP2A的產生，而且黃腐酸還可能作用于人參皂苷Rg1與PP2A的復合物，促進人參皂苷Rg1和PP2A的結合，提高藥理活性。

[ 1 ]周霞萍，張義超，張世萬. 腐植酸醫(yī)用研究新進展[J].腐植酸，2011，（3）：5～9.

[ 2 ]黃良才. 腐植酸護膚品的開發(fā)[J]. 腐植酸，2001，（2）：24～44.

[ 3 ]Wang Q, Yang Y, Zhu M Q. Structral transformation of birnessite by fulvic acid under anoxic conditions[J].Environmental Science & Technology, 2018, 52(4):1844～1853.

[ 4 ]蒲清榮，稅丕先. 三七藥理作用研究概述[J]. 現代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，（24）：3704～3705

[ 5 ]高妍，薛薇，李敏，等. 人參皂苷Rg1的中樞藥理作用及多靶點機制研究進展[J]. 中國臨床藥理學與治療學，2016，21（1）：22～35.

[ 6 ]彭小松，陳小春，黃俊山，等. 人參皂苷Rg1對Aβ25-35誘導大鼠海馬神經元tau蛋白異常磷酸化的影響[J]. 中國藥理學通報，2005，21（3）：4～7.

[ 7 ]劉超，張雪寧，劉東，等. 異丙酚、人參皂苷Rg-1、蛋白磷酸酯酶-2A和氯化鋰對大鼠電休克后學習記憶及海馬內谷氨酸含量的影響[J]. 中國醫(yī)學科學院學報，2014，（3）：234～240.

[ 8 ]曲忠森，趙永波，王興彬，等. 輕度認知障礙及阿爾茨海默病患者外周血淋巴細胞中蛋白磷酸酯酶-2A的改變[J]. 中華神經科雜志，2007，40（10）：652～654.

[ 9 ]朱粹青，曹小定. 蛋白磷酸酯酶-1和-2A抑制劑對NG108-15細胞tau蛋白磷酸化的影響[J]. 細胞生物學雜志，2002，24（2）：115～117.

[ 10 ]曾育琦，陳曉春，黃春，等. 人參皂苷Rg1通過調節(jié)GSK3β/PP2A活性減輕皮層神經元tau蛋白過度磷酸化[J]. 解剖學報，2007，38（6）：665～670.

[ 11 ]唐赟，李衛(wèi)華，盛亞運. 計算機分子模擬一2013年諾貝爾化學獎簡介[J]. 自然雜志，2013，35（6）：408～415.

[ 12 ]江莉，萬華根，彭群生. 基于CHARMM力場的蛋白質分子場計算及觸覺感知[J]. 計算機輔助設計與圖形學學報，2009，21（7）：886～892.

[ 13 ]Campbellwh. Nitrate reductase structure function and regulation bridging the gap between biochemistry and physiology[J]. Annual Review of Plant Biology, 1999,50(50): 277～303.