國超 曾繁爽 楊旭 吳洋磊 楊禎

摘 要：綜述了caspase種類、分類和caspase家族在機體發(fā)育、炎癥和調節(jié)細胞凋亡等方面發(fā)揮的重要作用?？偨Y了不同種類的caspase在魚類、貝類、甲殼類和棘皮類中的免疫應答、作用機制以及炎癥中的階段性研究進展，并歸納了caspase抑制劑在水產動物中的應用。

關鍵詞：caspase; caspase抑制劑;水產動物

Caspase是一類進化保守，具有相似氨基酸序列、結構和特異性底物的蛋白酶家族[1]。由于caspase具有半胱氨酸蛋白酶活性——其活性位點的半胱氨酸殘基僅在天冬氨酸殘基之后才會親核攻擊和切割目標蛋白，因此caspase被稱為具有天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，又稱為半胱天冬酶[2]。目前已鑒定出14種半胱天冬酶，分別命名為caspase-1—caspase-14，它們都具有一些共同的特性：（1）均為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶;（2）都有一個保守的五肽活性位點QACXG（X可以是R、Q或D）;（3）前體都是稱為前蛋白酶的酵素[3]。根據(jù)半胱天冬酶在氨基酸序列上的同源性，將半胱天冬酶分為三個亞類，第一類是被稱為細胞凋亡活化劑的啟動caspase，包括caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10;第二類是被稱為細胞凋亡效應劑的效應caspase，包括caspase-3、caspase-6和caspase-7;第三類是發(fā)揮炎癥介質作用的caspse，例如caspase-1、caspase-4、caspase-5等[4]。一般情況下，半胱天冬酶家族可通過兩條途徑被激活：一是凋亡信號誘導的凋亡受體介導途徑;另一種是應激誘導的線粒體介導途徑（caspase-9依賴途徑）。一旦凋亡途徑被激活，它們就會產生連鎖反應，凋亡激活因子caspase-2、caspase-8等將激活其下游凋亡效應因子caspase-3、caspase-6和caspase-7。

半胱天冬酶在生物程序性細胞死亡（例如細胞焦亡和壞死性凋亡）中發(fā)揮重要作用，而這些形式的細胞死亡可以保護生物體免受應激信號刺激和病原體攻擊。同時半胱天冬酶在炎癥中也有作用，它可以直接處理促炎細胞因子，如pro-IL1β。由于以上半胱天冬酶在細胞凋亡和免疫中發(fā)揮的不可或缺的作用，越來越多有關水產動物半胱天冬酶的研究被報道，因此，本文將綜述近年來半胱天冬酶在魚類、貝類、甲殼類和棘皮類四大類水產動物中的研究進展，以期為研究者了解半胱天冬酶對水產動物細胞凋亡和免疫的影響提供參考。

1 Caspase在魚類中的研究進展

細胞凋亡對所有多細胞生物的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)具有重要的影響。因此，所有后生動物物種似乎都擁有凋亡機制的必要組成部分，但總的來說，它們的數(shù)量和復雜性在進化過程中不斷增加。幾乎所有哺乳動物半胱天蛋白酶的同源魚類已被鑒定出來，但也有一些魚類特有的半胱天蛋白酶被認為具有不同的功能[5]。

斑馬魚（Danio rerio）作為常見的模式生物是研究caspase最全面的魚類之一。斑馬魚的基因組編碼多種凋亡成分，包含多個caspase啟動子和效應子，其中至少有6個caspase具有與哺乳動物caspase-8和caspase-10同源的蛋白酶結構域[6]。同時在斑馬魚中還發(fā)現(xiàn)了幾種炎性介質的caspase：caspase caspy和caspase caspy2，其催化結構域與人caspase-1和caspase-5的同源性最高，但它們都包含一個n端pyrin結構域[7]。此外，斑馬魚的基因組包含caspase-C和一種caspase-C樣蛋白酶，與人類caspase-4的相似性很高[8]。

關于caspase的研究報道在其他常見魚類中屢見不鮮。LPEZ-CASTEJN等[9]首次鑒定魚類炎癥性caspase—金頭鯛（Sparus aurata）caspase-1，并發(fā)現(xiàn)鯛魚caspase-1基因在孵化后1天的幼魚中表達，其mRNA表達水平在整個發(fā)育過程中都在增加。大西洋鮭作為一種原始硬骨魚，其凋亡受體和線粒體介導途徑的許多關鍵成分被鑒定出來，Takle等[10]從大西洋鮭中克隆了五種編碼caspase-3、caspase-6和caspase-7的基因，并在熱應激鮭魚胚胎中研究發(fā)現(xiàn)，高溫可以誘導啟動子caspase激活。Bi等[11]鑒定小黃魚的caspase-6和caspase-7基因，并分析了整個caspase家族的進化，進一步描述了魚類中caspase-6和caspase-7基因的進化選擇位點。結果表明，caspase-6基因在硬骨魚的物種進化和基因復制方面的出現(xiàn)，早于caspase-7，且caspase-6基因在魚類進化過程中沒有潛在的正選擇位點，而caspase-7基因則被發(fā)現(xiàn)了兩個潛在的正選擇位點。除此之外，其他常見的水產養(yǎng)殖魚類的部分caspase研究進展見表1。

2 Caspase在貝類和甲殼類中的研究進展

相比魚類，caspase在貝類和甲殼類中的研究較少，主要集中于牡蠣、扇貝、貽貝、鮑、對蝦和部分蟹類。在貝類和甲殼類的caspase的研究中，主要方法有：（1）從轉錄水平上探究caspase基因在各組織的表達。（2）通過脅迫等方式激發(fā)免疫應答，探究該物種caspase基因對脅迫的響應。

研究表明caspase基因廣泛存在于貝類和甲殼類的血細胞、鰓和肝胰腺等組織，例如在太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）鰓中觀察到較高的caspase-3和caspase-7表達水平[23]，牡蠣先天免疫反應中發(fā)現(xiàn)鰓和血細胞中caspase-1表達量較高[24]，香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）體內caspase-8中普遍表達，其在性腺和外套膜中表達水平最高[25];雜色鮑（Haliotis diversicolor）[26]和皺紋盤鮑（Haliotis discus discus）[27]caspase基因在鰓、血液、肝胰腺和肌肉等各組織器官中均有表達，其中在鰓中表達量最高，可能是因為鰓是病原菌入侵的主要部位;caspase基因在中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）[28]和凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[29]血細胞、心臟、肝胰腺、鰓、胃、肌肉等組織中廣泛表達，其中中華絨螯蟹肝胰腺中表達量最高而凡納濱對蝦血細胞中表達量最高。

3 Caspase在棘皮類中的研究進展

Caspase在棘皮類中的研究主要集中于海膽和海參。海膽作為常見的模式生物通常用來研究caspase在動物細胞凋亡和免疫中發(fā)揮的作用。由于目前已成功鑒別的海膽caspase基因僅數(shù)種，包括caspase-3、caspase-7、caspase-8[30]，因此有關海膽caspase實驗大多數(shù)是研究在一種或數(shù)種環(huán)境脅迫下海膽體內整個caspase酶家族的變化，這些變化可以用caspase酶活力、免疫細胞化學檢測、細胞凋亡數(shù)量等評估。

與海膽不同，海參caspase的研究通常與海參特有的生理習性（例如化皮、吐腸、夏眠、再生等）相聯(lián)系，其中與化皮關聯(lián)的海參caspase基因研究是最多的，這與海參化皮伴隨細胞凋亡、凋亡信號傳導等凋亡過程有關[31]。已有研究表明，海參自溶過程中caspase-3、caspase-9是關鍵性的內源酶之一[32]。

4 Caspase抑制劑在水產養(yǎng)殖中的應用

細胞凋亡是一種在受到適當觸發(fā)因素刺激時允許細胞自我毀滅的機制，細胞凋亡可以調節(jié)機體發(fā)育和內環(huán)境穩(wěn)定，但凋亡的失衡會引起機體發(fā)生疾病，例如腫瘤的產生、自身免疫疾病、細胞過度凋亡和凋亡衰減等。由于caspase家族是介導機體細胞凋亡關鍵性的內源酶，因此caspase抑制劑也被廣泛應用于治療機體的凋亡失衡。Caspase抑制劑主要分為兩類：（1）天然caspase抑制劑，例如細胞因子效應調節(jié)劑A（CrmA）、Zn2+等;（2）人工合成caspase抑制劑，包括合成肽類和合成非肽類。

隨著水產動物caspase研究的深入，研究表明caspase抑制劑可用于治療水產動物凋亡失衡，提高抗病能力。例如KIM等[33]發(fā)現(xiàn)廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK可以延長養(yǎng)殖魚類感染病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）的存活時間;YABU等[34]發(fā)現(xiàn)caspase抑制劑benzyloxycarbonyl-Asp-Glu-Val-Asp-fluoromethylketone可以明顯抑制斑馬魚因caspase-3的過表達而引起的細胞凋亡;Qu等[35]發(fā)現(xiàn)凋亡抑制劑（IAP）蛋白可以通過抑制牡蠣（Crassostrea gigas）caspase活性和促進免疫反應來維持細胞增殖和細胞死亡之間的平衡;宋林生等[36]克隆了一種中華絨螯蟹caspase抑制劑基因EsCystatin并在大腸桿菌中實現(xiàn)體外重組表達，研究結果表明當重組蛋白濃度達到350 μg/mg時木瓜蛋白酶（活性中心為半胱氨酸）活性被完全抑制，研究結果為中華絨螯蟹病害防治和防御體制提供了理論基礎;楊靜峰等[37]發(fā)現(xiàn)使用廣譜性caspase抑制劑Z-DEVD-FMK及其多肽衍生物AC-DEVD-CHO以及6-氨基-3-甲基嘌呤，通過浸泡或者灌腸的方式用于海參，可以抑制因細胞凋亡而引起的海參化皮，有效延長鮮活海參的存活和運輸時間。

5 展望

caspase是細胞凋亡的關鍵性內源酶，與機體的免疫密切相關。研究caspase在水產動物的種類和作用，有助于了解和掌握水產動物的疾病發(fā)生機制，從而進一步發(fā)掘潛在的免疫增強劑。目前有關水產動物caspase的研究處于起步階段，僅有部分魚類趨近完善，大部分貝類、甲殼類和棘皮類的報道相對較少。毋庸置疑，未來Caspase必將是水產免疫研究的重點對象。

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（收稿日期：2021-08-16;修回日期：2021-10-29）